Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

SM FISH cuantifica con precisión los niveles y la localización de RNasa específica. Este método es particularmente útil para analizar la variación de célula a célula y alelo por alelo en el ARN. La transcripción de genes es un proceso esencial en biología celular, SM FISH permite la investigación del contenido de ARN en respuesta a estímulos externos a nivel de célula individual y proporciona información espacial.

Después del tratamiento con agonistas de los receptores de estrógenos, lavar las células con PBS estéril frío con calcio y magnesio y fijar las células con 500 microlitros de tampón de fijación durante 30 minutos en hielo. Al final de la incubación, lavar las células dos veces con PBS estéril frío con calcio y magnesio durante tres minutos antes de agregar 500 microlitros de etanol al 70% a cada pocillo. A continuación, selle la placa de 24 pocillos con una película de plástico de parafina y coloque la placa en un rotador a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro y hasta 16 horas.

Para la hibridación de ARN FISH, al final de la incubación lavar las células una vez con 500 microlitros de tampón SSC 2X suplementado con formamida al 10% durante cinco minutos a temperatura ambiente en un rotador. Durante la incubación, coloque un trozo de película de plástico de parffin con el lado no expuesto hacia arriba en una placa de Petri de vidrio limpia con un descontaminante de superficie de ARN y colóquelo en toallas de papel estériles saturadas de agua a lo largo de los bordes de la placa. Al final de la incubación, coloque gotas de 30 microlitros espaciadas uniformemente de tampón de sonda de exón GREB1 y intrón GREB1 recién preparadas en el lado limpio de la película de plástico de parafina y use pinzas estériles para colocar suavemente un cubreobjetos de células con el lado de la célula hacia abajo en cada gota sin burbujas.

Después de sellar el plato con una película de plástico de parafina, cubra el plato con papel de aluminio e incube el plato durante la noche a 37 grados centígrados sobre una superficie plana no giratoria. A la mañana siguiente, use pinzas para devolver los cubreobjetos a la celda de la placa de 24 pocillos con el lado hacia arriba para dos lavados de 15 minutos en 500 microlitros de tampón SSC 2X fresco suplementado con 10% de formamida por lavado a 37 grados Celsius en un rotor calentado. Después del segundo lavado, contratiñir el ADN con un microgramo por mililitro de DAPI en tampón 2X SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador, seguido de un lavado de cinco minutos en tampón 2X SSC a temperatura ambiente.

Utilice una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón SSC 2X y enjuague las muestras con agua sin nucleasas para eliminar el exceso de sales. A continuación, utilice un medio de montaje que no se endurezca para montar los portaobjetos de la cubierta en portaobjetos de vidrio y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Para la obtención de imágenes de muestras, cargue el portaobjetos con la intensidad más alta esperada en una platina de microscopio de epifluorescencia de campo amplio equipada con un objetivo de 60 o 100 veces el aceite en una cámara sCOMS y coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo.

Para la adquisición de Zstack, concéntrese en la muestra en el canal DAPI y seleccione la parte superior e inferior del Zstack a las distancias a las que los núcleos teñidos con DAPI se desenfocan. Utilice la diapositiva para optimizar la cantidad de iluminación de la fuente de luz y los tiempos de exposición para cada canal y adquirir imágenes de todas las diapositivas en condiciones que eviten el blanqueo de fotos o la saturación de píxeles de la cámara. Después de la adquisición, utilice 10 ciclos de un algoritmo de restauración agresivo para desconvolucionar las imágenes y guardar todas las imágenes de proyección de acuerdo con la profundidad de bits de la cámara utilizada.

Para el análisis de imágenes, primero descargue Jupiter Notebook desde GitHub e instale Python Anaconda Distribution versión 3.6 o superior. Abra el símbolo del sistema de Anaconda e introduzca el comando de instalación para instalar SimpleITK para Anaconda. Abra Anaconda Navigator e inicie Jupiter Notebook.

Se abrirá un navegador web que muestra directorios y archivos. Navegue por las estructuras de directorios para llegar al directorio que contiene el Jupiter Notebook descargado de GitHub. A continuación, abra el bloc de notas y pulse Mayús y Intro para ejecutar cada celda.

En este experimento representativo, las células de cáncer de mama adherentes se trataron con un agonista del receptor de estrógeno, o vehículo, durante 24 horas. Los conjuntos de sondas separadas espectralmente frente a las secuencias intrónicas y exónicas de GREB1 permitieron la visualización y cuantificación simultáneas de ARNm naciente y maduro. Es importante destacar que se puede marcar el número de alelos transcripcionalmente activos en cada célula que se ha demostrado que forman parte del curso del tiempo de respuesta al estrógeno.

Al contar los intrones y exones superpuestos, se determinó que las células tratadas con E2 tenían una fracción cuatro veces mayor de células que exhiben dos o más alelos GREB1 activos en comparación con las células tratadas con vehículos. A medida que los intrones se empalman a partir del ARNm naciente para producir ARNm maduro que consta solo de secuencias de exones, el número de ARNm maduro por célula se puede contar cuantificando el número de puntos verdes. El trazado de estos datos permite observar el cambio en la distribución de la célula madura de ARNm GREB1 y el cambio en el pliegue agregado de la población celular después del tratamiento con E2.

C-FISH permite investigar múltiples especies de ARN de forma secuencial, MERFISH es una técnica de código de barras para aumentar masivamente la multiplexación, e iFISH se utiliza para estudiar simultáneamente el ARN y las proteínas.