Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas

Este protocolo ofrece un método versátil para detectar y cuantificar el ácido úrico con alta sensibilidad. Por lo tanto, es un protocolo para aplicaciones diagnósticas y clínicas. Este protocolo puede cuantificar rápidamente biomarcadores en una matriz compleja, como los fluidos corporales.

Esta técnica puede extenderse potencialmente para diagnosticar enfermedades que utilizan el ácido úrico como biomarcador, como la gota, la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares. También se puede utilizar para detectar y cuantificar otras sustancias peligrosas para el monitoreo ambiental. Al intentar el protocolo por primera vez, los investigadores pueden tener dificultades para formar agregados estables de CB7 y nanopartículas de oro.

Se recomienda mezclar las nanopartículas de oro en soluciones CB7 mediante sonicación, ya que otras técnicas podrían afectar a la cinética de agregación. Un video que muestra los pasos críticos de la adición de la mezcla CB7 puede aumentar las posibilidades de éxito y la reproducibilidad para los investigadores cuando son nuevos en el sistema. Para la síntesis de semillas de oro, disuelva 98,5 miligramos de áurico en 10 mililitros de agua desionizada en un vial de vidrio para obtener una solución de cloruro áurico de 25 milimolares y 64,5 miligramos de polvo de citrato de sodio en 500 microlitros de agua desionizada en un vial de vidrio.

A continuación, diluya un mililitro de la solución de cloruro áurico con 99 mililitros de agua en una botella de 250 mililitros con tapa azul para obtener una solución de cloruro áurico de 0,25 milimolares y añada 99,5 mililitros de la solución de cloruro áurico de 0,25 milimolares a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 250 mililitros equipado con un condensador. A continuación, caliente la solución a 90 grados centígrados agitando vigorosamente durante 15 minutos antes de inyectar 500 microlitros de la solución de citrato de sodio en el matraz, sin dejar de agitar hasta que la solución se vuelva de color rojo rubí. Para iniciar el crecimiento sembrado de las nanopartículas de oro, transfiera 25 mililitros de la solución de semilla de oro a un tubo de 50 mililitros y enfríe la solución a 70 grados en un ThermoMixer.

Mientras la solución se enfría, llene una jeringa desechable Luer lock de tres mililitros con 2,5 mililitros de solución de cloruro áurico de 25 milimolares y llene otra jeringa desechable Luer lock de tres milímetros con 2,5 mililitros de solución de citrato de sodio de 60 milimolares. Coloque las jeringas en bombas de jeringa y use adaptadores Luer a MicroTight para conectar un tubo de PEEK de 150 micromolares de diámetro interno a las jeringas. Inserte el tubo en el tubo de centrífuga que contiene la solución de semillas de oro enfriada en el ThermoMixer y configure ambas bombas de jeringa para dispensar 167,5 microlitros de solución durante 20 minutos.

Ajuste la velocidad de rotación del ThermoMixer a 600 rotaciones por minuto y pulse Start en la bomba de jeringa que contiene la solución de cloruro áurico de 25 milimolares. Después de dos minutos, presione Start en la bomba de jeringa que contiene la solución de citrato de sodio de 60 milimolares. Después de 30 minutos, retire una alícuota de la solución de nanopartículas de oro para su análisis.

Para preparar una solución de CB7 de 0,4 milimolares, añada 4,65 miligramos de CB7 a un vial de vidrio de 15 mililitros y 10 mililitros de agua al vial. Después de tapar herméticamente, sonique el vial a temperatura ambiente hasta que el sólido CB7 se disuelva por completo. Para preparar una solución de ácido úrico de 0,4 milimolares, agregue 2,69 miligramos de ácido úrico a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y agregue 40 mililitros de agua al tubo.

Después de tapar herméticamente, agite la mezcla en un ThermoMixer ajustado a 70 grados centígrados y 800 revoluciones por minuto durante dos horas. Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, diluya un mililitro de la solución de ácido úrico de 0,4 milimolares con nueve mililitros de agua en un frasco de vidrio de 15 mililitros para obtener una solución de ácido úrico de 0,04 milimolares. Después de tapar herméticamente, sonique el vial durante 30 segundos.

Para preparar los complejos de ácido úrico CB7, agregue 750 microlitros de la solución CB7 de 0,4 milimolar y 750 microlitros de la solución de ácido úrico de 0,4 milimolares a un tubo de 1,5 mililitros y sonique la mezcla durante 30 segundos. A continuación, mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos para asegurar la formación de los complejos anfitrión-huésped. Haga clic en el icono de los asistentes de la aplicación de espectroscopia en el software del sistema Raman y seleccione Raman.

Inicie una nueva adquisición y establezca el tiempo de integración en 30 segundos, los escaneos en promedio en cinco y el furgón en cero. A continuación, almacene el espectro de fondo e introduzca la longitud de onda del láser. Para la formación de sustrato SERS, agregue 900 microlitros de la solución de nanopartículas de oro de 40 nanómetros y 100 microlitros de solución compleja de ácido úrico CB7 preformada a un tubo de 1,5 mililitros y sonique hasta que la solución cambie de rojo rubí a púrpura.

Transfiera la solución de muestra a una semi-micro cubeta y coloque la cubeta en el soporte de muestras Raman. Cierre la tapa e inicie la medición. A continuación, configure el guardado automático para registrar cinco espectros SERS consecutivos.

Los espectros ultravioleta visibles para las nanopartículas de oro sintetizadas muestran un cambio de los picos de resonancia del plasmón de la superficie localizada de 521 a 529 nanómetros después de 10 pasos de crecimiento, mientras que los datos de dispersión dinámica de la luz muestran una distribución de tamaño estrecha a medida que el tamaño de las nanopartículas aumenta de 25,9 a 42,8 nanómetros. Los tamaños promedio de G0, G5 y G10 medidos a partir de imágenes electrónicas de transmisión son de aproximadamente 20, 33 y 40 nanómetros respectivamente. En estos análisis representativos, se formaron complejos huésped-huésped de CB7 y ácido úrico con CB7 vacío que median la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de los nanoagregados de nanopartículas de oro CB7 respaldadas por las señales características de ácido úrico en el espectro SERS.

Por el contrario, no se pueden observar señales SERS de ácido úrico en ausencia de CB7, lo que ilustra el papel clave de CB7 en el desencadenamiento de la agregación de nanopartículas de oro. La alta sensibilidad del esquema de detección presentado en este protocolo se demuestra mediante la observación de señales SERS claras desde los picos de ácido úrico a 640 y 1130 centímetros recíprocos hasta el límite de detección de 0,2 micromolares. Además, se obtuvieron correlaciones muy fuertes entre la intensidad del SERS y las concentraciones logarítmicas de ácido úrico por ley de potencia para ambos picos con regiones lineales encontradas en el rango de 0,2 a 2 micromolares.

El ácido úrico tiene una baja solubilidad en agua, por lo que es necesario asegurarse de que el polvo de ácido úrico tenga un suave antes del siguiente paso. Se pueden realizar análisis de datos avanzados, lo que permite cuantificar múltiples biomarcadores presentes en la matriz.