Name: Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a detectar ácido úrico con alta sensibilidad mediante espectroscopia SERS usando nanopartículas de oro y cucurbit[7]uril. Este método permite cuantificar biomarcadores en fluidos biológicos para diagnóstico clínico.

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TCL agradece el apoyo de la Royal Society Research Grant 2016 R1 (RG150551) y el UCL BEAMS Future Leader Award financiado a través del premio de Patrocinio Institucional por el EPSRC (EP/P511262/1). WIKC, TCL e IPP agradecen la beca financiada por el Programa de Vinculación a la Investigación A*STAR-UCL a través del EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1). GD y TJ desean agradecer al EPSRC M3S CDT (EP/L015862/1) por patrocinar su beca. TJ y TCL reconocen a Camtech Innovations por su contribución a la matrícula estudiantil de TJ. Todos los autores están agradecidos con el Fondo de Acceso Abierto de UCL.

1. Síntesis de au npn
<ol><li>Síntesis de semillas de Au mediante el método convencional de Turkevich26<ol>
<li>Preparar 10 mL de solución de HAuCl4 de 25 mM disolviendo 98,5 mg de HAuCl4· Precursor de 3H2O con 10 ml de agua desionizada en un vial de vidrio. NOTA: Transfiera una pequeña cantidad de precursor de HAuCl4 a un bote de pesaje y use una espátula de plástico en lugar de una espátula metálica para pesar los cristales porque el precursor de HAuCl4 corroerá el material de laboratorio de metal. El paso de pesaje debe realizarse lo más rápido posible, ya que HAuCl4 es higroscópico y, por lo tanto, aumentará su peso con el tiempo al absorber agua de la atmósfera. HAuCl4 es altamente corrosivo y puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Tenga especial cuidado al manipularlo.</li>
		<li>Preparar 0,5 ml de solución de citrato de sodio de 500 mM disolviendo 64,5 mg de polvo de citrato de sodio con 0,5 ml de agua desionizada en un vial de vidrio.</li>
		<li>Diluya 1 ml de la solución HAuCl4 de 25 mM con 99 ml de agua en una botella de tapa azul de 250 ml para dar 100 ml de solución HAuCl4 de 0,25 ml.</li>
		<li>Agregue 99,5 ml de la solución HAuCl4 de 0,25 mM en un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 250 ml equipado con un condensador. Calentar la solución a 90 °C bajo agitación vigorosa y mantener la temperatura durante 15 min.</li>
		<li>Inyecte 0,5 ml de la solución de citrato de sodio de 500 mM en la mezcla de reacción y mantenga la temperatura y la agitación hasta que el color de la solución se vuelva rojo rubí. NOTA: La reacción dura unos 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Crecimiento sembrado de Au NPs mediante el método cinéticamente controlado13
	<ol>
<li>Enfríe la solución de semilla de Au sintetizada a 70 °C.</li>
		<li>Preparar 10 ml de solución de citrato de sodio de 60 mM disolviendo 154,8 mg de polvo de citrato de sodio con 10 ml de agua desionizada en un vial de vidrio.</li>
		<li>Inyecte 0,67 ml de la solución HAuCl4 de 25 mM y 0,67 ml de la solución de citrato de sodio de 60 mM a las semillas Au con un intervalo de tiempo de 2 min.</li>
		<li>Repita el paso 1.2.3 para aumentar gradualmente el tamaño de au nps a 40 nm. NOTA: Se necesitan unos 10 pasos de crecimiento para alcanzar los 40 nm. El número real de pasos necesarios puede depender de la configuración precisa.</li>
	</ol></li>
	<li>Crecimiento sembrado de AU NP usando sintetizador automatizado (Figura 2)
	<ol>
<li>Transfiera 25 ml de la solución de semillas au preparada en la sección 1 a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml y enfríe a 70 °C en un termomezclador. NOTA: Controle la temperatura dentro del termomezclador utilizando un termómetro de termopar colocado en un tubo centrífugo de 50 ml que contiene 25 ml de agua.</li>
		<li>Llene una jeringa desechable luer lock de 3 ml con 2,5 ml de solución HAuCl4 de 25 ml. Llene otra jeringa desechable Luer lock de 3 ml con 2,5 ml de solución de citrato de sodio de 60 ml.</li>
		<li>Coloque las jeringas en las bombas de jeringa y utilice adaptadores Luer-to-MicroTight para conectar el tubo PEEK (diámetro interno de 150 μm) a las jeringas. Inserte el tubo en el tubo de la centrífuga que contiene la solución de semillas de Au en el termomezclador.</li>
		<li>Ajuste ambas bombas de jeringa para dispensar 0,1675 ml de solución durante 20 min (8,357 μL por minuto).</li>
		<li>Ajuste la velocidad de rotación del termomezclador a 700 rpm y pulse Start en la bomba de jeringa que contiene la solución HAuCl4 de 25 mM.</li>
		<li>Después de 2 min, presione Start en la bomba de la jeringa que contiene la solución de citrato de sodio de 60 mM.</li>
		<li>30 min después de iniciar la inyección de solución de HAuCl4 , retire una alícuota de la solución au np para su análisis.</li>
		<li>Repita los pasos 1.3.5 – 1.3.7 para aumentar gradualmente el diámetro de los NP au hasta 40 nm. NOTA: Esta configuración se puede utilizar para aumentar au nps de hasta 40 nm en un solo paso aumentando el volumen de reactivos añadidos en el paso 1.3.4. Esto se logra aumentando el tiempo de dispensación mientras se mantiene la misma tasa de inyección.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Caracterización de los NP de Au
<ol><li>Espectroscopia UV-Vis<ol>
<li>Agregue 1 ml de la solución Au NP a una cubeta de cuarzo semi-micro.</li>
		<li>Encienda el espectrómetro.</li>
		<li>Establezca el rango de longitud de onda en 400 - 800 nm.</li>
		<li>Adquirir el espectro UV-Vis para cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispersión dinámica de luz (DLS)<ol>
<li>Filtre la solución de muestra en una cubeta semi-micro de plástico con un filtro de 0,22 μm.</li>
		<li>Encienda el instrumento DLS.</li>
		<li>Ajuste la temperatura a 25 °C y equilibre durante 60 s.</li>
		<li>Medir el tamaño hidrodinámico de cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)<ol>
<li>Vierta una gota de 5 μL de la solución de muestra sobre una rejilla de Cu de 300 mallas recubierta en C y séquela al aire. NOTA: La dilución es necesaria para muestras de solución de Au NP más concentradas para obtener NP de Au bien dispersas en una cuadrícula TEM.</li>
		<li>Adquiera múltiples imágenes TEM para cada muestra utilizando un TEM a un voltaje de aceleración de 200 kV.</li>
		<li>Mida el diámetro de 200 Au NP para cada muestra utilizando ImageJ para calcular el tamaño promedio y la desviación estándar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Formación de complejos CB7-UA
<ol><li>Preparación de la solución CB7 de 0,4 mM<ol>
<li>Añadir 4,65 mg de CB7 a un vial de vidrio de 15 ml. NOTA: La cantidad de CB7 se calcula en base a la fórmula de peso de CB7 (= 1163 Da) que ha sido empleada por la mayoría de los informes en la literatura. Sin embargo, las muestras sólidas CB7 generalmente contienen agua, HCl, metanol y otras sales que quedan de los pasos de síntesis y purificación, lo que contribuye a ~ 10 – 20% de peso muerto en la muestra. Los disolventes y sales atrapados no se podían eliminar calentando en un horno de vacío u otros medios. Sus cantidades varían entre diferentes lotes de muestras, pero se pueden cuantificar mediante análisis elementales. Sin embargo, el protocolo presentado no es sensible a la presencia de cantidad no cuantificada de disolventes y sales en las muestras de CB7.</li>
		<li>Agregue 10 ml de agua al vial y apriete la tapa.</li>
		<li>Sonicar la muestra a temperatura ambiente hasta que el sólido CB7 se disuelva por completo. NOTA: CB7 fue sintetizado de acuerdo con la literatura27 , pero también está disponible comercialmente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la solución UA de 0,4 mM<ol>
<li>Añadir 2,69 mg de UA a un tubo centrífugo de 50 ml.</li>
		<li>Agregue 40 ml de agua al tubo y apriete la tapa.</li>
		<li>Utilice un termomezclador para girar la solución de muestra ajustando la temperatura a 70 °C, la velocidad a 800 rpm y el tiempo a 2 h. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. NOTA: LA UA tiene una baja solubilidad en agua (0,40 mM)5. Girar durante más tiempo si el polvo de UA no se ha disuelto por completo. Alternativamente, la ultrasonicación se puede utilizar para facilitar la disolución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluciones secuenciales de la solución UA de 0,4 mM<ol>
<li>Diluya 5 ml de la solución de UA de 0,4 mM con 5 ml de agua en un vial de vidrio de 15 ml para dar 10 ml de solución de UA de 0,2 ml. Apriete la tapa y sonice durante 30 s.</li>
		<li>Repita el paso 3.3.1 utilizando una cantidad adecuada de AU y agua como se describe en la Tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de los complejos CB7-UA<ol>
<li>Añadir 0,75 ml de la solución CB7 de 0,4 mM y 0,75 ml de solución UA de 0,4 mM en un tubo de 1,5 ml. Asegure la tapa y sonice durante 30 s.</li>
		<li>Espere 30 minutos para garantizar la formación de complejos anfitrión-huésped.</li>
		<li>Repita el paso 3.4.1 – 3.4.2 utilizando una solución de UA de diferentes concentraciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Detección SERS de UA
<ol><li>Configuración experimental del sistema Raman (Figura 3)<ol>
<li>Encienda el láser He-Ne de 633 nm (22,5 mW).</li>
		<li>Encienda el espectrómetro Raman modular.</li>
		<li>Encienda la computadora e inicie el software.</li>
		<li>Haga clic en el icono Asistentes de aplicación de espectroscopia y, a continuación, seleccione Raman.</li>
		<li>Iniciar una nueva adquisición. Establezca el tiempo de integración en 30 s, los escaneos en promedio en 5 y boxcar en 0.</li>
		<li>Almacene el espectro de fondo e ingrese la longitud de onda del láser (es decir, 633 nm). NOTA: El tiempo de integración es el tiempo para cada escaneo, los escaneos al promedio es el número de escaneos promediados para crear cada espectro y boxcar es el número de píxeles vecinos promediados28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formación de los sustratos SERS<ol>
<li>Añadir 0,9 mL de la solución NP au de 40 nm y 0,1 ml de la solución compleja CB7-UA preformada en un tubo de 1,5 ml. Asegure la tapa y sonice hasta que la solución cambie de rojo rubí a púrpura. NOTA: También se pueden utilizar muestras comerciales de solución np de 40 nm au estabilizadas con citrato. Por lo general, la densidad óptica del pico de resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) se ajusta a 1 a través de la dilución a partir de muestras de solución madre concentrada. La concentración de citrato en la muestra se mantiene típicamente como 2 mM.</li>
		<li>Transfiera la solución de muestra a una cubeta semi-micro. Coloque la cubeta en el portamuestras Raman y cierre la tapa.</li>
		<li>Inicie la medición.</li>
		<li>Configure el guardado automático para registrar cinco espectros SERS consecutivos.</li>
		<li>Detenga la medición y cambie la muestra.</li>
		<li>Repita el paso 4.2.1 – 4.2.5 usando una solución CB7-UA de diferentes concentraciones. NOTA: Se encuentra que el tiempo de agregación depende de la concentración de UA en los nanoagregados, que van desde 30 s para 0,1 μM UA hasta 30 min para 20 μM UA, debido a la diferencia en la concentración de CB7 vacío que tiene una contribución importante a la mediación de la agregación de Au NP. Para el complejo CB7-UA, un portal está bloqueado por la voluminosa molécula ua, lo que hace que no esté disponible para unirse a la superficie Au NP y, por lo tanto, no pueda mediar la agregación NP21. La muestra está lista para la medición cuando el color de la solución cambia de rojo rubí a púrpura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Procesamiento de datos<ol>
<li>Descargue e instale la línea de base con el complemento de mínimos cuadrados asimétricos (ALS) en Origin. NOTA: El plugin ALS requiere OriginPro.</li>
		<li>Inserte los datos sin procesar en Origin.</li>
		<li>Calcule un valor promedio a partir de los cinco espectros SERS de cada muestra. Divida el valor por la potencia del láser (es decir, 22,5 mW) y por el tiempo de integración (es decir, 30 s).</li>
		<li>Haga clic en el icono als para abrir el cuadro de diálogo. Establezca el factor asimétrico en 0,001, el umbral en 0,03 %, el factor de suavizado en 2 y el número de iteraciones en 20 para corregir la línea de base de cada espectro promediado.</li>
		<li>Grafique los espectros SERS de diferentes concentraciones de UA utilizando líneas apiladas por y compensaciones. La salida debe ser de intensidad (cuenta s-1 mW-1) contra el desplazamiento Raman (cm-1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de síntesis automatizada descrito en el protocolo permite sintetizar de forma reproducible Au NP de tamaños crecientes. Aunque hay algunos elementos que aún deben llevarse a cabo manualmente, como la adición rápida de citrato de sodio durante la síntesis de semillas y la verificación periódica para garantizar que el tubo PEEK sea seguro, este método permite Au NP de grandes tamaños (hasta 40 nm), que generalmente requerirían múltiples inyecciones manuales de HAuCl4 y citrato de sodio, para ser sinte...

El ácido úrico, que es el producto final del metabolismo de los nucleótidos de purina, es un biomarcador importante en el suero sanguíneo y la orina para el diagnóstico de enfermedades como la gota, la preeclampsia, las enfermedades renales, la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes 1,2,3,4,5. Los métodos actuales para la detección de ácido úrico incluyen ensayos enzimáticos colorimétricos, cromatografía líquida de alto rendimiento y electroforesis capilar, que consumen mucho tiempo, son costosos y requieren una preparación sofisticada demuestras 6,7,8,9.
La espectroscopia Raman mejorada con superficie es una técnica prometedora para el diagnóstico rutinario en el punto de atención, ya que permite la detección selectiva de biomoléculas a través de sus huellas dactilares de vibración y ofrece numerosas ventajas, como alta sensibilidad, respuesta rápida, facilidad de uso y preparación de muestras nula o mínima. Los sustratos SERS basados en nanopartículas de metales nobles (por ejemplo, Au NP) pueden mejorar las señales Raman de las moléculas de analito de 4 a 10 órdenes de magnitud10 a través de una fuerte mejora electromagnética causada por la resonancia de plasmónde superficie 11. Au NPs de tamaños personalizados se pueden sintetizar fácilmente en lugar de la fabricación lenta de nanocompuestos metálicos complejos12, y por lo tanto son ampliamente utilizados en aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades superiores 13,14,15,16. La unión de moléculas macrocíclicas, cucurbitáceas (CBn, donde n = 5-8, 10), en la superficie de Au NP puede mejorar aún más las señales SERS de las moléculas de analito, ya que las moléculas CB altamente simétricas y rígidas pueden controlar el espaciado preciso entre las Au NP y localizar las moléculas de analito en el centro o en las proximidades de los puntos calientes plasmónicos a través de la formación de complejos huésped-huésped (Figura 1) 17, 18,19,20. Ejemplos anteriores de estudios SERS utilizando Au NP: Los nanoagregados CBn incluyen nitroexplosivos, aromáticos policíclicos, diaminoestilbeno, neurotransmisores y creatinina 21,22,23,24,25, con las mediciones de SERS realizadas en una cubeta o cargando una pequeña gota en un portamuestras hecho a medida. Este esquema de detección es particularmente útil para cuantificar rápidamente biomarcadores en una matriz compleja con una alta reproducibilidad.
Aquí, se demostró un método fácil para formar complejos huésped-huésped de CB7 y un biomarcador importante UA, y para cuantificar UA con un límite de detección de 0.2 μM a través de agregaciones mediadas por CB7 de Au NP en medios acuosos utilizando un espectrómetro modular, que es prometedor para aplicaciones diagnósticas y clínicas.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de oro de 40 nm</td><td>NanoComposix</td><td>AUCN40-100M</td><td>NanoXact, 0,05 mg/ mL, desnudo (citrato)</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Corning Falcon</td><td>14-432-22</td><td>50 mL volumen</td></tr><tr><td>Cucurbitácea[7]uril</td><td>Fabricado en</td><td></td> laboratorio <td>ver ref. 19</td></tr><tr><td>Cloruro de oro (III) trihidrato</td><td>Sigma aldrich</td><td>520918</td><td>&ge; 99,9% base de metales traza</td></tr><tr><td>Jeringa desechable Luer lock</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07945-15</td><td>3 mL de volumen</td></tr><tr><td>Adaptador Luer a MicroTight</td><td>LuerTight</td><td>P-662</td><td>360 &mu; m diámetro exterior Tubo a jeringa Luer Tubo</td></tr><tr><td>de PEEK</td><td>IDEX</td><td>1572</td><td>360 &mu; m diámetro exterior, 150 &mu; m diámetro interior</td></tr><tr><td>cortador de tubos de PEEK</td><td>IDEX</td><td>WZ-02013-30</td><td>Cortador de tubos de cromatografía de polímeros capilares para 360 y micro; espectrómetro Raman de tubo de m a 1/32" de diámetro exterior</td></tr><tr><td></td><td>Ocean Optics</td><td>QE pro</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sigma aldrich</td><td>S4641</td><td>ACS reactivo, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Sonda estándar Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digi-Sense</td><td>WZ-08516-55</td><td>Bomba de</td></tr><tr><td>jeringa</td> tipo K <td>Aladdin</td><td>ALADDIN2-220</td><td>2 jeringas, volumen máximo de la jeringa 60 mL</td></tr><tr><td>Termómetro de termopar</td><td>Digi-Sense</td><td>WZ-20250-91</td><td>Termómetro de termopar de entrada única con calibración trazable al NIST</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td>Con un Eppendorf SmartBlock para tubos de 50 mL</td></tr><tr><td>Ácido úrico</td><td>Sigma aldrich</td><td>U2625</td><td>&ge; 99%, cristalino</td></tr></tbody></table>

detección cuantitativa de sers de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas

Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril

Este trabajo describe un método rápido y altamente sensible para la detección cuantitativa de un biomarcador importante, el ácido úrico (UA), a través de la espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) con un límite de detección bajo de ~ 0.2 μM para múltiples picos característicos en la región de huellas dactilares, utilizando un espectrómetro modular. Este esquema de biodetección está mediado por la complejación huésped-huésped entre un macrociclo, cucurbitácea[7]uril (CB7) y UA, y la posterior formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de los nanoagregados Au NP: CB7 autoensamblados. También se ha realizado una síntesis fácil de Au NP de tamaños deseables para sustratos SERS basada en el enfoque clásico de reducción de citratos con una opción que se facilitará utilizando un sintetizador automatizado construido en laboratorio. Este protocolo se puede extender fácilmente a la detección multiplexada de biomarcadores en fluidos corporales para aplicaciones clínicas.

En la síntesis au np presentada, los espectros UV-Vis muestran un cambio de los picos LSPR de 521 nm a 529 nm después de 10 pasos de crecimiento (Figura 4A, B), mientras que los datos DLS muestran una distribución de tamaño estrecha a medida que el tamaño de au NP aumenta de 25.9 nm a 42.8 nm (Figura 4C, D). Los tamaños promedio de G0, G5 y G10 medidos a partir de imágenes TEM (Figura 4E) son 20.1 ±...

Se formó un complejo huésped-huésped de cucurbitácea[7]uril y ácido úrico en una solución acuosa antes de agregar una pequeña cantidad a la solución Au NP para la detección cuantitativa de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) utilizando un espectrómetro modular.

Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas

This work describes a rapid and highly sensitive method for the quantitative detection of an important biomarker, uric acid (UA), via surface-enhanced ...

Este protocolo ofrece un método versátil para detectar y cuantificar el ácido úrico con alta sensibilidad. Por lo tanto, es un protocolo para aplicaciones diagnósticas y clínicas. Este protocolo puede cuantificar rápidamente biomarcadores en una matriz compleja, como los fluidos corporales.Esta técnica puede extenderse potencialmente para diagnosticar enfermedades que utilizan el ácido úrico como biomarcador, como la gota, la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares. También se puede utilizar para detectar y cuantificar otras sustancias peligrosas para el monitoreo ambiental. Al intentar el protocolo por primera vez, los investigadores pueden tener dificultades para formar agregados estables de CB7 y nanopartículas de oro.Se recomienda mezclar las nanopartículas de oro en soluciones CB7 mediante sonicación, ya que otras técnicas podrían afectar a la cinética de agregación. Un video que muestra los pasos críticos de la adición de la mezcla CB7 puede aumentar las posibilidades de éxito y la reproducibilidad para los investigadores cuando son nuevos en el sistema. Para la síntesis de semillas de oro, disuelva 98,5 miligramos de áurico en 10 mililitros de agua desionizada en un vial de vidrio para obtener una solución de cloruro áurico de 25 milimolares y 64,5 miligramos de polvo de citrato de sodio en 500 microlitros de agua desionizada en un vial de vidrio.A continuación, diluya un mililitro de la solución de cloruro áurico con 99 mililitros de agua en una botella de 250 mililitros con tapa azul para obtener una solución de cloruro áurico de 0,25 milimolares y añada 99,5 mililitros de la solución de cloruro áurico de 0,25 milimolares a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 250 mililitros equipado con un condensador. A continuación, caliente la solución a 90 grados centígrados agitando vigorosamente durante 15 minutos antes de inyectar 500 microlitros de la solución de citrato de sodio en el matraz, sin dejar de agitar hasta que la solución se vuelva de color rojo rubí. Para iniciar el crecimiento sembrado de las nanopartículas de oro, transfiera 25 mililitros de la solución de semilla de oro a un tubo de 50 mililitros y enfríe la solución a 70 grados en un ThermoMixer.Mientras la solución se enfría, llene una jeringa desechable Luer lock de tres mililitros con 2,5 mililitros de solución de cloruro áurico de 25 milimolares y llene otra jeringa desechable Luer lock de tres milímetros con 2,5 mililitros de solución de citrato de sodio de 60 milimolares. Coloque las jeringas en bombas de jeringa y use adaptadores Luer a MicroTight para conectar un tubo de PEEK de 150 micromolares de diámetro interno a las jeringas. Inserte el tubo en el tubo de centrífuga que contiene la solución de semillas de oro enfriada en el ThermoMixer y configure ambas bombas de jeringa para dispensar 167,5 microlitros de solución durante 20 minutos.Ajuste la velocidad de rotación del ThermoMixer a 600 rotaciones por minuto y pulse Start en la bomba de jeringa que contiene la solución de cloruro áurico de 25 milimolares. Después de dos minutos, presione Start en la bomba de jeringa que contiene la solución de citrato de sodio de 60 milimolares. Después de 30 minutos, retire una alícuota de la solución de nanopartículas de oro para su análisis.Para preparar una solución de CB7 de 0,4 milimolares, añada 4,65 miligramos de CB7 a un vial de vidrio de 15 mililitros y 10 mililitros de agua al vial. Después de tapar herméticamente, sonique el vial a temperatura ambiente hasta que el sólido CB7 se disuelva por completo. Para preparar una solución de ácido úrico de 0,4 milimolares, agregue 2,69 miligramos de ácido úrico a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y agregue 40 mililitros de agua al tubo.Después de tapar herméticamente, agite la mezcla en un ThermoMixer ajustado a 70 grados centígrados y 800 revoluciones por minuto durante dos horas. Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, diluya un mililitro de la solución de ácido úrico de 0,4 milimolares con nueve mililitros de agua en un frasco de vidrio de 15 mililitros para obtener una solución de ácido úrico de 0,04 milimolares. Después de tapar herméticamente, sonique el vial durante 30 segundos.Para preparar los complejos de ácido úrico CB7, agregue 750 microlitros de la solución CB7 de 0,4 milimolar y 750 microlitros de la solución de ácido úrico de 0,4 milimolares a un tubo de 1,5 mililitros y sonique la mezcla durante 30 segundos. A continuación, mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos para asegurar la formación de los complejos anfitrión-huésped. Haga clic en el icono de los asistentes de la aplicación de espectroscopia en el software del sistema Raman y seleccione Raman.Inicie una nueva adquisición y establezca el tiempo de integración en 30 segundos, los escaneos en promedio en cinco y el furgón en cero. A continuación, almacene el espectro de fondo e introduzca la longitud de onda del láser. Para la formación de sustrato SERS, agregue 900 microlitros de la solución de nanopartículas de oro de 40 nanómetros y 100 microlitros de solución compleja de ácido úrico CB7 preformada a un tubo de 1,5 mililitros y sonique hasta que la solución cambie de rojo rubí a púrpura.Transfiera la solución de muestra a una semi-micro cubeta y coloque la cubeta en el soporte de muestras Raman. Cierre la tapa e inicie la medición. A continuación, configure el guardado automático para registrar cinco espectros SERS consecutivos.Los espectros ultravioleta visibles para las nanopartículas de oro sintetizadas muestran un cambio de los picos de resonancia del plasmón de la superficie localizada de 521 a 529 nanómetros después de 10 pasos de crecimiento, mientras que los datos de dispersión dinámica de la luz muestran una distribución de tamaño estrecha a medida que el tamaño de las nanopartículas aumenta de 25,9 a 42,8 nanómetros. Los tamaños promedio de G0, G5 y G10 medidos a partir de imágenes electrónicas de transmisión son de aproximadamente 20, 33 y 40 nanómetros respectivamente. En estos análisis representativos, se formaron complejos huésped-huésped de CB7 y ácido úrico con CB7 vacío que median la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de los nanoagregados de nanopartículas de oro CB7 respaldadas por las señales características de ácido úrico en el espectro SERS.Por el contrario, no se pueden observar señales SERS de ácido úrico en ausencia de CB7, lo que ilustra el papel clave de CB7 en el desencadenamiento de la agregación de nanopartículas de oro. La alta sensibilidad del esquema de detección presentado en este protocolo se demuestra mediante la observación de señales SERS claras desde los picos de ácido úrico a 640 y 1130 centímetros recíprocos hasta el límite de detección de 0,2 micromolares. Además, se obtuvieron correlaciones muy fuertes entre la intensidad del SERS y las concentraciones logarítmicas de ácido úrico por ley de potencia para ambos picos con regiones lineales encontradas en el rango de 0,2 a 2 micromolares.El ácido úrico tiene una baja solubilidad en agua, por lo que es necesario asegurarse de que el polvo de ácido úrico tenga un suave antes del siguiente paso. Se pueden realizar análisis de datos avanzados, lo que permite cuantificar múltiples biomarcadores presentes en la matriz.

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Investigación

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Chemistry

Química

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Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas (Video) | JoVE Journal

Detección cuantitativa de SERS de ácido úrico a través de la formación de nanouniones plasmónicas precisas dentro de agregados de nanopartículas de oro y cucurbitáceas

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