Name: Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende el trasplante subretiniano de organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas en un modelo felino. Esta técnica quirúrgica permite la entrega directa de tejido al espacio subretiniano para desarrollar terapias celulares contra degeneraciones retinianas.

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Este trabajo fue financiado por NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 y SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones es un co-PI). Janice Querubin (MSU RATTS) por su ayuda con la anestesia y el cuidado general de los animales incluidos en este estudio, así como la ayuda con el entorno quirúrgico y la preparación / esterilización de instrumentos. Paige Winkler por la ayuda en recibir los organoides y colocarlos en los medios el día anterior a la implantación y por la ayuda el día de la implantación. Los autores también agradecen al Sr. Randy (LCTX) por el envío diligente de los organoides retinianos, el montaje del remitente y la descarga de los registros de temperatura y estrés G después de cada envío. Este trabajo se realizó mientras el autor Igor Nasonkin era empleado por Biotime (ahora Lineage).

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. son empleados de Lineage Cell Therapeutics, Inc. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

La implantación de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides retinianos) en el espacio subretiniano es un enfoque experimental prometedor para restaurar la visión de las enfermedades degenerativas de la retina en etapa tardía causadas por la muerte celular PR (ceguera profunda o terminal). El enfoque presentado se basa en una terapia experimental desarrollada y probada con éxito basada en el injerto subretiniano de un pedazo de tejido retiniano fetal humano23,24,25...

Millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la degeneración de la retina (DR) con la consiguiente discapacidad visual o ceguera asociada con la pérdida de los fotorreceptores sensibles a la luz (PR). La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es una causa importante de ceguera como resultado de una combinación de factores de riesgo genéticos y factores ambientales / de estilo de vida. Además, se ha encontrado que más de 200 genes y loci causan DR hereditaria (IRD)1. La retinitis pigmentosa (RP), el IRD más común, es genéticamente heterogénea con más de 3.000 mutaciones genéticas en aproximadamente 70 genes que se han descrito 2,3,4. La amaurosis congénita de Leber (ACV), que causa ceguera en la infancia, también es genéticamente heterogénea 5,6. La terapia de aumento génico ha sido desarrollada y está en ensayos clínicos para el tratamiento de un pequeño número de IRD 3,7. Sin embargo, se debe desarrollar una terapia separada para el tratamiento de cada forma genética distinta de IRD y, por lo tanto, solo tratar a un pequeño subconjunto de pacientes. Además, el aumento de genes se basa en la presencia de una población de fotorreceptores rescatables y, por lo tanto, no es aplicable para la degeneración avanzada.
Por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente y aún no satisfecha para el desarrollo de terapias que aborden y traten las DR avanzadas y la ceguera profunda a terminal. Durante las últimas 2 décadas, los implantes neuroprotésicos se han desarrollado y probado en modelos animales grandes, como el gato, antes del uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Asimismo, en los últimos 20 años se han desarrollado terapias de reemplazo de retina utilizando láminas de retina embrionaria o incluso de mamíferos maduros injertadas subretinalmente 15,16,17,18,19,20,21,22 e incluso probadas con éxito en pacientes con DR 23,24,25. Ambos enfoques utilizan la idea de introducir nuevos sensores (fotodiodos de silicio fotovoltaico en el caso de dispositivos neuroprotésicos26,27, y fotorreceptores sanos libres de mutaciones organizados en láminas, en el caso de la implantación de láminas retinianas) en retina con PR degenerados. Estudios recientes han investigado el uso de enfoques basados en células madre, como el trasplante de progenitores retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC)28,29, fotorreceptores hPSC 30 y organoides retinianos hPSC31,32,33. Los organoides retinianos permiten la formación de tejido retiniano en una placa y la derivación de láminas fotorreceptoras con miles de PR libres de mutación, que se asemejan a la capa fotorreceptora en la retina fetal humana en desarrollo 34,35,36,37,38,39,40. El trasplante de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides) en el espacio subretiniano de pacientes con enfermedades de DR es uno de los nuevos y prometedores enfoques de terapia celular en investigación, perseguido por varios equipos31,32,41,42. En comparación con el trasplante de la suspensión celular (de fotorreceptores jóvenes o progenitores retinianos), se demostró que las láminas trasplantadas de fotorreceptores fetales resultan en mejoras de la visión en ensayos clínicos23,24.
El protocolo presentado aquí describe, en detalle, un procedimiento de trasplante para la administración subretiniana de los organoides retinianos completos (en lugar de los bordes organoides33,41) como una forma potencialmente mejor de introducir láminas retinianas intactas con PR, para aumentar la supervivencia del injerto y mejorar la preservación de la hoja. Aunque se han desarrollado procedimientos para introducir una pieza plana de retina humana y también parches de EPR43,44,45, no se ha investigado el trasplante de injertos 3D más grandes. Los organoides retinianos derivados de células madre proporcionan una fuente inagotable de láminas fotorreceptoras para el desarrollo de tecnologías de restauración de la visión, están libres de restricciones éticas y se consideran una excelente fuente de tejido retiniano humano para terapias centradas en el tratamiento de la DR avanzada y la ceguera terminal46. El desarrollo de métodos quirúrgicos para la implantación subretiniana precisa de organoides retinianos con una lesión mínima en el nicho retiniano huésped (retina neural, epitelio pigmentario retiniano y vasculatura retiniana y coroides) es uno de los pasos críticos para avanzar en dicha terapia hacia aplicaciones clínicas31,32. Los modelos animales grandes como gatos, perros, cerdos y monos han demostrado ser buenos modelos para investigar métodos de administración quirúrgica, así como para demostrar la seguridad de las láminas de tejido implantadas (células del epitelio pigmentario de la retina (EPR)) e investigar el uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . El ojo grande del animal tiene un tamaño de globo similar al humano, así como una anatomía similar, incluida la presencia de una región de alta densidad de fotorreceptores, incluidos los conos (el área central), que se asemeja a la mácula humana 6,51,52.
En este manuscrito, se describe una técnica para la implantación de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides) en el espacio subretiniano de modelos animales felinos grandes (gatos de tipo salvaje y CrxRdy/+), que, junto con resultados prometedores de eficacia32,53 construye una base para un mayor desarrollo de dicha terapia de investigación hacia aplicaciones clínicas para tratar afecciones de DR.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; El filtro de jeringa de poro m con membrana PES</td><td>Cameo</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr>, <tr><td>inyector subretiniano de 23G con cánula extensible de 41 G</td>, <td>DORC</td><td>1270.EXT</td><td></td></tr><tr><td>250 y micro; L jeringa de bloqueo luer hermética al gas</td><td>Hamilton</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>6-0 Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>707G</td><td></td></tr><tr><td>6-0/7-0 sutura de poliglactina</td><td>Ethicon</td><td>J570G</td><td></td></tr><tr><td>Maleato de acepromazina 500 mg / 5 mL (Aceproject)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0.3 mg /</td><td>mL Par Pharmaceutical</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>cSLO + SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+ OCT</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Novartis</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Dexametasona 2 mg / mL (Azium)</td><td>Vetone</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Doxycyline 25 mg / 5 mL</td><td>Cipla</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Solución Fatal Plus (solución de pentobarbital)</td><td>Vortech</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Gentamicina 20 mg / 2 ml</td><td>Hospira</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio (Borosilicato estándar de un solo barril de pared delgada (Schott Duran) Tubos de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Metilprednisolona actetato 40 mg/mL</td><td>Pfizer</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OCT medio (Tissue-Tek O.C.T. Compound)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Olympic Vac-Pac Size 23</td><td>Natus</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16% solución</td><td>EMS</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de fenilefrina 10% solución oftálmica</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Prednisolona 15 mg / 5 ml</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Propofol 500 mg / 50 ml (10 mg / mL) (PropoFlo28)</td> <td>Zoetis</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Cámara de fondo de ojo de video RetCam II</td><td>Clarity Medical Systems</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Triamcinolona 400 mg / 10 mL (Kenalog-40)</td><td>Bristol -Myers Squibb Company</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Tropicamide 1% solución oftálmica</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>se puede encontrar a través de varios proveedores</td></tr><tr><td>Puerto de vitrectomía 23G</td><td>Sistemas Alcon</td><td>Accurus</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de vitrectomía</td><td>Sistemas Alcon</td><td>Accurus</td><td></td></tr><tr><td>Tijera vitreo-retiniana vertical de 80 grados con mango de compresión</td><td>Frimen</td><td>FT170206T</td><td></td></tr></tbody></table>

trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Las afecciones degenerativas de la retina (DR) asociadas con la pérdida de fotorreceptores, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinitis pigmentosa (RP) y la amaurosis congénita de Leber (LCA) causan pérdida de visión progresiva y debilitante. Existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan restaurar la visión una vez que se han perdido los fotorreceptores. El trasplante de tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) en el espacio subretiniano de un ojo con RD avanzada aporta láminas de tejido retiniano con miles de fotorreceptores sanos libres de mutaciones y tiene el potencial de tratar la mayoría / todas las enfermedades cegadoras asociadas con la degeneración de los fotorreceptores con un protocolo aprobado. El trasplante de tejido retiniano fetal en el espacio subretiniano de modelos animales y personas con DR avanzada se ha desarrollado con éxito, pero no se puede utilizar como tratamiento de rutina debido a preocupaciones éticas y suministro limitado de tejido. Los modelos animales de degeneración retiniana hereditaria (IRD) del ojo grande son valiosos para desarrollar terapias de restauración de la visión que utilizan enfoques quirúrgicos avanzados para trasplantar células / tejidos de la retina en el espacio subretiniano. Las similitudes en el tamaño del globo y la distribución de los fotorreceptores (por ejemplo, la presencia de área central de la región similar a la mácula) y la disponibilidad de modelos IRD que recapitulan estrechamente el IRD humano facilitarían la traducción rápida de una terapia prometedora a la clínica. Aquí se presenta una técnica quirúrgica de trasplante de tejido retiniano derivado de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal grande que permite la evaluación de este enfoque prometedor en modelos animales.

Este procedimiento permite la implantación exitosa y reproducible de organoides retinianos derivados de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal de ojo grande (demostrado aquí usando 2 ejemplos: gatos salvajes con fotorreceptores sanos (PR) y gatos CrxRdy/+ con PRs y retina degenerados). Siguiendo los pasos indicados en la Figura 1 , prepare y cargue los organoides retinianos derivados de hPSC en la cánula de vidrio de borosilicato del dispositivo de i...

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

El protocolo actual muestra en detalle la administración subretiniana de todos los organoides retinianos en un modelo animal grande, con el objetivo de desarrollar enfoques de terapia celular para la degeneración de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que permite la entrega de organoides directamente al tejido diana, la retina. La técnica tiene como objetivo tratar afecciones degenerativas retinianas cegadoras avanzadas, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinitis pigmentosa o la amaurosis congénita de Leber.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Peterson Jones. Para la implantación subretiniana de los organoides, use las tijeras de tenotomía Stevens para realizar una cantotomía lateral de 0,5 a 1 centímetro en un gato anestesiado en ayunas durante la noche de cuatro meses de edad, y coloque un espéculo de párpado Barraquer del tamaño adecuado en la incisión para mantener los párpados abiertos con un asistente quirúrgico que irriga regularmente la córnea con BSS durante todo el procedimiento. Use fórceps de atado corneal Castroviejo 0.5 y un pequeño hemostático de mosquito para agarrar suavemente la conjuntiva bulbar junto al limbo.Coloque dos suturas de seda 6-0 en la conjuntiva inmediatamente adyacente al limbo en las posiciones de las 4 y 8 en punto para sostener el ojo en la mirada primaria y retraer el tercer párpado. Sujete los extremos de las suturas con pequeños hemostáticos de mosquitos para ayudar a su manipulación, y coloque otra sutura en la posición de las 12 en punto en el limbo parcialmente a través del grosor del limbo, teniendo cuidado de no penetrar en el ojo. Anude libremente la sutura, cortando el extremo corto, y coloque una sutura de estancia en la conjuntiva inmediatamente adyacente al limbo en la posición de las 4 en punto para sostener el ojo y la mirada primaria.Refleje la conjuntiva bulbar entre las 10 y las 2 en punto, y use tijeras de tenotomía para incidir la conjuntiva a dos o tres milímetros del limbo. Socave la conjuntiva y despeje la cápsula de Denon para exponer la esclerótica en los sitios del puerto de vitrectomía a las dos y 10 en punto, de tres a cinco milímetros del limbo. Use calibradores para identificar los sitios para la esclerotomía, evitando los principales vasos esclerales que pueden ser prominentes en el gato.Planificación para una región de tres milímetros en el puerto de instrumentos de las 10 en punto para un cirujano diestro, pre-coloque suturas de patrón cruzado de poliglactina 6-0 o 7-0 sin atar en los sitios de las esclerotomías propuestas. Una vez que las suturas estén en su lugar, haga que el asistente agarre las suturas de estadía de las 12 en punto para ayudar a mantener el globo en posición, y use pinzas Castroviejo de 0.12 milímetros para sostener el tejido junto al sitio de la esclerotomía. Utiliza un trócar para introducir un puerto de vitrectomía de calibre 23 a través de la esclerótica en las posiciones de las 2 y 10 en punto en ángulo hacia el nervio óptico para evitar el contacto con la lente, y use pinzas de atado para empujar suavemente el puerto de irrigación para determinar si las puntas se pueden visualizar dentro del vítreo.Haga que el asistente coloque una lente de vitrectomía de irrigación Machemer en la córnea para permitir la visualización del segmento posterior del ojo, y un cortador de sonda de vitrectomía de calibre 23 a través del puerto del instrumento para realizar una vitrectomía central parcial. A continuación, introduzca la aguja de una jeringa de un mililitro que contiene un mililitro de solución de triamcinolona en el puerto del instrumento e inyecte de 250 a 500 microlitros de la suspensión de cristal. Cuando se haya administrado la solución, avance la sonda de vitrectomía a través del puerto del instrumento para cerrar la cabeza del nervio óptico con el puerto orientado hacia la superficie de la retina.Use alto vacío para ayudar a separar la cara vítrea de la retina, inserte el inyector a través del puerto del instrumento hacia la superficie de la retina y extruya la punta de la cánula. Presione suavemente la punta de la superficie de la retina y haga que el asistente dé un ligero empujón rápido sobre el émbolo de la jeringa para iniciar el desprendimiento de retina, reduciendo la presión de inyección para permitir un aumento lento del desprendimiento de retina hasta que se alcance el tamaño deseado. Use una cánula de calibre 41 del inyector para agrandar ligeramente el desprendimiento hasta que se puedan introducir tijeras retinianas y retire el puerto escleral de las 10 en punto.Luego use un cuchillo recto de 2.850 milímetros orientado hacia el nervio óptico para evitar tocar la lente para agrandar la esclerotomía en este sitio. Haga la retinotomía en la ampolla lejos del nervio óptico para evitar dañar las fibras nerviosas de la retina que se originan en la región trasplantada, y evite cortar los vasos retinianos principales para reducir el riesgo de hemorragia. Para implantar los organoides, inserte un capilar de vidrio cargado con organoides a través de la esclerotomía agrandada hacia el sitio de la retinotomía, y use la punta del capilar para abrir ligeramente la retinotomía para permitir el acceso a la abertura de la ampolla subretiniana.Haga que el asistente presione lentamente el émbolo del inyector nuevamente para inyectar los organoides en la ampolla subretiniana. BSS debe proceder organoides, los órganos, y enjuagar la retinotomía abierta. Cuando se hayan entregado todos los organoides, deje el capilar de vidrio en su lugar durante unos segundos antes de retirar lentamente el capilar del ojo, teniendo cuidado de evitar cualquier liberación repentina de líquido.Cuando se haya extirpado el capilar, cierre la esclerotomía con la sutura precolocada en un patrón cruzado. Haga que el asistente retire el puerto de infusión y ate rápidamente la sutura de esclerotomía y cierre la peritomía con las suturas de poliglactina en un patrón continuo simple. Cierre la cantotomía lateral con una sutura de poliglactina 6-0 y suturas cutáneas en forma de ocho para realizar el canto lateral y use suturas simples de piel interrumpida para cerrar el resto de la herida.Luego administre el cóctel de esteroides y antibióticos postquirúrgicos apropiado. La carga de organoides retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas puede confirmarse dentro de la cánula de vidrio del dispositivo de inyección y durante la cirugía mediante visualización directa. La presencia de los organoides dentro del espacio subretiniano puede confirmarse postoperatoriamente mediante examen oftalmológico e imágenes de fondo de ojo.Antes de la eutanasia, también se puede realizar una oftalmoscopia láser de barrido confocal y una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral para evaluar la posición de los organoides. Estas técnicas se pueden utilizar para demostrar la persistencia de organoides retinianos en el espacio subretiniano entre la retina neural y el epitelio pigmentario de la retina del ojo receptor. Los análisis histológicos e inmunohistoquímicos se pueden utilizar para ilustrar la supervivencia de los gráficos xenogénicos dentro del espacio subretiniano de un ojo grande en un animal inmunodeprimido.Solo aquellos expertos en cirugía vitreorretiniana, como oftalmólogos veterinarios capacitados o cirujanos vitreorretinianos familiarizados con las diferencias de especies en el ojo de gato en comparación con el ojo humano deben realizar este procedimiento. La técnica presentada en este video debe ser aplicable a otros modelos de animales grandes que se utilizan para traducir las técnicas quirúrgicas vitreorretinianas a las clínicas.

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