Name: Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprende a optimizar el crecimiento de cristales de macromoléculas mediante diálisis controlada por temperatura con el sistema automatizado OptiCrys. Este protocolo mejora la calidad cristalina para cristalografía de rayos X y neutrones.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MBS reconoce el apoyo de LABEX VALO GRAL en virtud del contrato de 2015. NJ reconoce el Programa Internacional de Investigación doctoral (Irtelis) de la CEA para la Beca de Doctorado. Los autores reconocen la financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie número 722687. Los autores también están agradecidos al Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) y al Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) por sus conversaciones e ideas útiles. IBS reconoce su integración en el Instituto Interdisciplinario de Investigación de Grenoble (IRIG, CEA).

<ol><li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+crystallography%3A+opportunities%2C+challenges%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li>
<li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction%3A+D-xylose+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li>
<li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3AStructural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li>
<li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+protein+crystallography%3A+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li>
<li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li>
<li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li>
<li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22REVIEW+Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).</li>
<li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li>
<li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li>
<li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization%3A+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li>
<li>Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li>
<li>Garciá-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li>
<li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li>
<li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li>
<li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+and+phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li>
<li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+temperature+to+crystallize+proteins%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+and+Design%22%5BJournal%5D)">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li>
<li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase%2C+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme%2C+complexed+with+8-azaxanthin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li>
<li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li>
<li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3AStructural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Diferentes variables físicas, químicas y biológicas influyen en la cristalización de proteínas al afectar la solubilidad proteica21. Entre estas variables, la temperatura y la composición química de la solución de cristalización se utilizan aquí en combinación con la técnica de diálisis para mejorar y cultivar grandes cristales de alta calidad de biomacromolecules para estudios de difracción de neutrones. Mediante el conocimiento de diagramas de fase, la cristalización se hace más predecible. Aunque el cribado de diferentes condiciones de cristalización en un enfoque en serie también es posible, el objetivo principal de utilizar los enfoques racionales presentados es separar y controlar la cinética de la nucleación de cristal y el crecimiento.
Al igual que todos los estudios de cristalización, las muestras de proteínas puras y homogéneas de alta calidad y las soluciones de cristalización sin polvo aumentan la tasa de éxito del experimento. La filtración y la centrifugación de las soluciones son pasos esenciales en los protocolos descritos. Conocer las propiedades fisicoquímicas de las proteínas estudiadas como el peso molecular (para elegir la membrana de diálisis adecuada), el punto isoeléctrico y la solubilidad proteica son cruciales para el diseño de un experimento óptimo de crecimiento de cristal. Además, se debe tener en cuenta la estabilidad de las proteínas a diferentes temperaturas o con diferentes productos químicos para prevenir la pérdida de la muestra y aumentar la probabilidad de éxito. Teniendo en cuenta el rango de temperatura de OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K), una amplia gama de proteínas se puede cristalizar con él. Pero vale la pena destacar que las proteínas que son principalmente termoestables, como las proteínas de fuentes termofílicas, serían las que más se benefician en los experimentos de crecimiento de cristal de gran volumen controlados por temperatura ofrecidos por este instrumento.
Utilizando una cámara de diálisis de bajo volumen (cuando se utilizan OptiCrys) o botones de microdiálisis y examinando varias temperaturas y condiciones de cristalización (por ejemplo, rejillas de concentración precipitada o pH), es posible obtener información sobre la ubicación del límite de la zona metástasis (equilibrio cinético entre nucleación y zonas metastásicas). Esto es invaluable al diseñar un experimento exitoso de crecimiento de cristales, especialmente para los nuevos candidatos a proteínas en cristalización. Sin esta información los experimentos pueden comenzar desde un área del diagrama de fase con alta supersaturación, demasiado lejos del límite de la zona metástasis para controlar fácilmente la nucleación cristalina. Aunque se puede intentar la disolución del precipitado proteico, por ejemplo aumentando la temperatura en caso de solubilidad directa, para proteínas con menor termosabilidad, mantener la muestra a alta temperatura durante un período de tiempo más largo puede hacer irreversible la precipitación proteica. Por lo tanto, la mejor estrategia consiste en utilizar una condición inicial con una sobresaturación más baja situada cerca del límite de metastabilidad, donde se puede controlar la nucleación y evitar la precipitación proteica. En línea con esto, la preselección de cristalización disminuye la probabilidad de tener un precipitado proteico en la cámara de diálisis y aumenta la tasa de éxito del experimento.
Después de diseñar un experimento, preparar cámaras de diálisis (OptiCrys) o botones de microdiálisis es otro paso importante. La prevención de la formación de burbujas de aire en la cámara/botón de diálisis aumenta la posibilidad de cristalización exitosa, especialmente cuando se utilizan pequeños volúmenes. La presencia de burbujas de aire en la cámara de diálisis también puede cambiar la cinética del proceso de cristalización y reducir la reproducibilidad del experimento (porque se ha modificado la superficie de contacto proteína/solución). No sólo la proteína, sino también la solución de cristalización pueden afectar el éxito del experimento. El uso de nuevos tubos de 50 ml para el sistema de bombeo cada vez que uno quiere iniciar un nuevo experimento y tubo de lavado después de cada experimento disminuye la posibilidad de contaminación y evita la creación de cristales de sal en el aparato.
El uso de botones de microdiálisis es una alternativa cuando OptiCrys no está disponible. Las estrategias para optimizar la cristalización y el seguimiento del crecimiento de cristal mencionados anteriormente, deben llevarse a cabo manualmente. Por lo general, esto requiere estar fuera de una incubadora termoregulada, lo que puede ser problemático cuando la regulación de la temperatura es un paso crítico en la metodología descrita. Esto no facilita el cambio de la composición química de las soluciones de cristalización, o el monitoreo del crecimiento del cristal por imágenes, por lo que el proceso de crecimiento del cristal no se puede controlar en tiempo real.
El conocimiento del diagrama de fase es la base del uso del banco de cristalización, OptiCrys, para cultivar sistemáticamente cristales grandes y de alta calidad de forma automatizada. El control de parámetros fisicoquímicos como la temperatura, la concentración precipitante y el pH durante la cristalización mueve el equilibrio proteína-solución en una trayectoria cinética bien definida a través del diagrama de fase. Esto se complementa con el uso de una membrana de diálisis para ajustar el transporte masivo y crear un gradiente controlado en la cámara de cristalización que afecta al tamaño y la calidad de los cristales. Por lo tanto, el uso de datos termodinámicos y trayectorias cinéticas es esencial para controlar el proceso de cristalización con el fin de cultivar cristales de alta calidad. Gracias a OptiCrys, los diagramas de fase sistemáticos en un espacio multidimensional se pueden estudiar con un enfoque en serie utilizando significativamente menos material que antes. Para demostrar esta metodología, proporcionamos aquí un caso de estudio con una proteína modelo, lisozyme de clara de huevo de pollo. Mediante el uso y masterización del protocolo presentado aquí se puede adaptar para sistemas proteicos reales5,14,17,18.

Comprender la relación estructura-función de las proteínas y el mecanismo de las vías fisiológicas a menudo se basa en conocer las posiciones de los átomos de hidrógeno (H) y cómo se transfiere la carga dentro de una proteína1,2. Dado que los átomos de hidrógeno dispersan los rayos X débilmente, sus posiciones sólo se pueden determinar con datos de difracción de rayos X de muy alta resolución (>1 Å)3,4. Por el contrario, la cristalografía de neutrones se puede utilizar para obtener una posición precisa de átomos de hidrógeno en macromoléculas biológicas como hidrógeno y átomos de deuterio (H2,isótopo de hidrógeno) tienen longitudes de dispersión de aproximadamente la misma magnitud que el oxígeno, nitrógeno y carbono5. Sin embargo, el flujo de neutrones de las fuentes de neutrones disponibles es más débil que el de los haces de rayos X, por lo que a menudo debe compensarse con2,3. Esto se puede lograr intercambiando H con H2 y/o aumentando el volumen de cristales para reducir la dispersión incoherente de los hidrógenos y aumentar la relación señal-ruido de las imágenes de difracción.
Hay varios enfoques de cristalización (el diagrama de fase esquemática correspondiente se muestra en la Figura 1)para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía bio-macromolecular de rayos X y neutrones6. En la difusión de vapor, una gota preparada a partir de una mezcla de una proteína y una solución de cristalización se equilibra con el tiempo, a través de la evaporación del agua u otras especies volátiles, contra un reservorio que contiene una mayor concentración de precipitante de la misma solución de cristalización. El aumento de la concentración de proteínas y precipitantes en la gota conduce a la sobresaturación necesaria para la nucleación espontánea seguida del crecimiento cristalino en estos núcleos6,7. Aunque la difusión de vapor es la técnica más utilizada para el cultivo de cristales4,el proceso de cristalización no se puede controlar con precisión8. En el método de difusión de interfaz libre, la solución de cristalización se difunde en una solución de proteína concentrada, dirigiendo muy lentamente el sistema hacia la sobresaturación. Este método se puede considerar como un método de lote con una velocidad de mezcla lenta6,9,10,11,12. En el método por lotes, la proteína se mezcla rápidamente con una solución de cristalización que conduce a una supersaturación rápida y a su vez nucleación uniforme con muchos cristales3,7. Este método representa aproximadamente un tercio de todas las estructuras actualmente depositadas en el Banco de Datos de Proteínas. El método de diálisis también se utiliza para el cultivo de cristales proteicos de alta calidad y bien diffracting. En el método de diálisis, las moléculas de difusa precipitante de un reservorio a través de una membrana semi-permeable en una cámara separada con la solución proteica. La cinética del equilibrio depende de varios factores, como la temperatura, el tamaño del poro de membrana y el volumen y concentración de muestras de proteínas y agentes de cristalización6.
Los diagramas de fase de cristalización se pueden utilizar para describir diferentes estados de una proteína en función de diferentes variables físicas o químicas3. Como se ilustra en la Figura 1,cada técnica de cristalización se puede visualizar como el uso de una trayectoria cinética diferente para llegar a las zonas de nucleación y metástasis de tal diagrama6,10,13. Esto proporciona información sobre la solubilidad proteica y la concentración de proteínas a la que se observa un equilibrio termodinámico entre el cristal y la solución, encontrando así las condiciones óptimas para la nucleación y el crecimiento3,14. En un diagrama de fase bidimensional, la concentración de proteínas se traza como una función de una variable y las otras variables se mantienen constantes15. En dicho diagrama de fase, cuando la concentración de proteínas está por debajo de la curva de solubilidad, la solución se encuentra en la región subsaturada y no se produce nucleación ni crecimiento de cristales. Por encima de esta curva se encuentra la zona de sobresaturación donde la concentración de proteínas es superior al límite de solubilidad3,14. Esto se divide además en tres regiones: la zona metástasis, la zona de nucleación espontánea y la zona de precipitación. En la zona metastásica, la sobresaturación no es suficiente para que la nucleación ocurra en un tiempo razonable, pero el crecimiento de los cristales de semillas puede tener lugar. La agregación y precipitación se favorecen en la zona de precipitación, donde la sobresaturación es demasiado alta14,15.
Cuando se logra una supersaturación suficiente para la nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos10. El crecimiento de los cristales conduce a una reducción en la concentración de proteínas hasta que se alcanza el límite de solubilidad. Mientras la supersaturación permanezca en las proximidades de la curva de solubilidad, no habrá ningún cambio significativo en el tamaño de los cristales. Sin embargo, se ha demostrado que las variaciones en la temperatura y composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, la concentración de precipitante) afectarán a la solubilidad proteica y pueden conducir al inicio de un mayor crecimiento de cristal8,13,16.
Como la diálisis es ventajosa para el crecimiento de cristales de buena calidad, el banco de cristalización OptiCrys ilustrado en la Figura 2, fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para controlar la cristalización de una manera totalmente automatizada8. Para ello, se escribió un software con LabVIEW que permite el control y seguimiento de la temperatura de una configuración de diálisis del depósito que fluye en contacto con los elementos Peltier, a través de un controlador electrónico y un enfriador. El mismo software también regula automáticamente la composición química de la solución de cristalización (por ejemplo, el intercambio de agentes de cristalización) utilizando un sistema fluido multicanal. Además, una cámara digital y un microscopio invertido se utilizan para visualizar y grabar el proceso de cristalización. Dos cámaras de cristalización con volúmenes de 15 μL y 250 μL están disponibles para el cultivo de cristales para diferentes propósitos. Como el proceso de cristalización es reversible, la detección de diferentes condiciones es posible con sólo unos pocos microlitros de la solución proteica siempre y cuando la muestra no se dañe8. Como resultado, el uso de este método minimiza la cantidad de material proteico utilizado.
Del trabajo anterior8,es evidente que durante el proceso de crecimiento del cristal, las observaciones in situ deben llevarse a cabo a intervalos de tiempo regulares. Estos pueden variar de unos segundos a varios días, dependiendo del evento en observación (precipitación, nucleación o crecimiento de cristal).
La optimización del crecimiento de cristales con OptiCrys se basa en diagramas de fase de concentración precipitantes a temperatura. En el caso de proteínas con solubilidad como función directa de la temperatura, es posible hacer uso del régimen de salazón18. Aquí es donde el aumento de la fuerza iónica de la solución, que se puede visualizar utilizando diagramas de fase precipitantes a proteínas, disminuye la solubilidad de la proteína. Asimismo, las proteínas con solubilidad inversa pueden hacer uso del régimen de salazón18. La nucleación se produce en la zona de nucleación, en las proximidades de la zona metástasis, y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis del diagrama de fase hasta que la concentración de proteínas alcanza el límite de solubilidad. Como se muestra en la Figura 3A, con temperatura de composición química constante se puede disminuir para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis para evitar nuevas nucleación. Los cristales crecen hasta que se logra el segundo equilibrio cristal/solución y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales. La temperatura se reduce varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. En la Figura 3B,a temperatura constante, el aumento de la concentración precipitante mantiene la solución en la zona metástasis. Este proceso se puede repetir varias veces para obtener cristales grandes. Cambiar la temperatura y manipular las condiciones de la solución de cristalización, mediante el control de los niveles de sobresaturación, son dos potentes herramientas para separar la nucleación y el crecimiento de cristales que son controlados precisa y automáticamente por OptiCrys5,8,14.
En la literatura y el PDB están disponibles ejemplos de cristalización controlada por temperatura, temperatura y concentración precipitada, así como datos relativos de difracción obtenidos. Entre ellos se encuentran la γ-cristalina humana E, la lectina PA-IIL, la pirofosfatasa inorgánica de levadura, la urate oxidasa, la anhidrasis carbónica humana II, la quinasa YchB y lactato deshidrogenasa5,14,17,18.
Aunque OptiCrys fue comercializado por NatX-ray, hay muchos laboratorios que no tienen acceso a este instrumento o al enfoque en serie que ofrece. La alternativa a esta técnica es utilizar botones de microdiálisis plástica disponibles comercialmente con varios volúmenes. Con estos, la temperatura y la composición química se pueden ajustar y variar manualmente. La inspección de los botones de microdiálisis no se puede realizar in situ y, en su lugar, debe realizarse manualmente con un microscopio óptico. El control de temperatura se puede lograr manteniendo la muestra en una incubadora de temperatura controlada sin vibraciones. Es esencial mantener la temperatura constante para garantizar que los experimentos de cristalización sean reproducibles. Variación significativa de la temperatura también puede conducir a daños o destrucción de cristales5.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y el uso de software de control para el crecimiento de cristales grandes y de alta calidad adecuados para la cristalografía de proteínas de neutrones. Este procedimiento paso a paso fue diseñado para aprovechar el diagrama de fase de cristalización con el fin de seleccionar una posición inicial y una ruta cinética para controlar el tamaño y la calidad de los cristales generados. Además, se presenta un protocolo detallado para el cultivo de cristales con botones de microdiálisis que utiliza la misma razón para obtener cristales grandes y de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>200 y micro; l Botón de diálisis</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-330</td><td>Botón de diálisis</td></tr><tr><td>24 placas de pocillos</td><td>Jena Bioscience</td><td>CPL-132</td><td>Placa de cristalización</td></tr><tr><td>2-Switch</td><td>FLUIGENT</td><td>2SW001</td><td>Switch</td></tr><tr><td>30 &mu; l Botón de diálisis</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-324</td><td>Botón de diálisis</td></tr><tr><td>50 mL Corning Tubos de centrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828-500EA</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Clara de huevo de gallina Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Proteína liofilizada</td></tr><tr><td>en polvo Discos de membrana de diálisis 6-8 kDa Espectro MWCO</td><td></td><td>132478</td><td>membrana de diálisis</td></tr><tr><td>membrana de diálisis Tubo 6-8 kDa MWCO</td><td>Spectrum</td><td>132650T</td><td>Membrana de diálisis</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Minispin Centrífuga de sobremesa Unidad de</td></tr><tr><td>flujo</td><td>FLUIGENT FLU-XL</td><td></td><td>Caudalímetro</td></tr><tr><td>Flowboard</td><td>FLUIGENT</td><td>FLB</td><td>Flowboard</td></tr><tr><td>Sistema de control de caudal microfluídico EZ</td><td>FLUIGENT</td><td>EZ-01000002 Controlador de</td><td>presión/vacío</td></tr><tr><td>MilliporeSigma 0.22 &micro; m jeringa Filtros</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0.22 &mu; Filtro de tamaño de poro</td></tr><tr><td>m M-Switch</td><td>FLUIGENT</td><td>MSW002</td><td>Válvula rotativa</td></tr><tr><td>Opticrys</td><td>NatX-ray</td><td>PRT008</td><td>Banco de cristalización</td></tr><tr><td>Portaobjetos de cubierta circular siliconados</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>Portaobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>cuadro de distribución químico</td></tr><tr><td></td><td>FLUIGENT</td><td>SWB002</td><td>centralita</td></tr><tr><td>Incubadora termorregulada</td><td>Memmert</td><td>IPP30</td><td>Incubadora termorregulada</td></tr></tbody></table>

optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

El uso de cristalografía macromolecular de neutrones (NMX) se está expandiendo rápidamente con la mayoría de las estructuras determinadas en la última década gracias a la construcción de nuevas líneas de haz NMX y a una mayor disponibilidad de software de refinamiento de estructuras. Sin embargo, las fuentes de neutrones disponibles actualmente para NMX son significativamente más débiles que las fuentes equivalentes para la cristalografía de rayos X. A pesar de los avances en este campo, siempre serán necesarios cristales significativamente más grandes para los estudios de difracción de neutrones, particularmente con la tendencia a estudiar macromoléculas y complejos cada vez más grandes. Por lo tanto, son necesarias nuevas mejoras en los métodos y la instrumentación adecuados para el crecimiento de cristales más grandes para que el uso de NMX se expanda.
En este trabajo, introducimos estrategias racionales y un banco de crecimiento de cristal (OptiCrys) desarrollado en nuestro laboratorio que combina la observación en tiempo real a través de una cámara de vídeo montada en microscopio con un control automatizado preciso de las soluciones de cristalización (por ejemplo, concentración precipitante, pH, aditivo, temperatura). A continuación, demostramos cómo este control de la temperatura y la composición química facilita la búsqueda de condiciones óptimas de cristalización utilizando proteínas solubles modelo. El conocimiento exhaustivo del diagrama de fase de cristalización es crucial para seleccionar la posición inicial y la ruta cinética para cualquier experimento de cristalización. Mostramos cómo un enfoque racional puede controlar el tamaño y el número de cristales generados en función del conocimiento de diagramas de fase multidimensionales.

En las Secciones 2.3 y 2.4, se presentan tres ejemplos de crecimiento optimizado del cristal, mostrando el uso del instrumento y un diseño experimental para el cultivo de grandes cristales. Para esta demostración, hemos utilizado la lisozyme como una proteína modelo, aunque los experimentos de crecimiento de cristal se han realizado con éxito con muchos otros sistemas proteicos utilizando este método (ver arriba). Mediante el uso y el dominio del protocolo presentado aquí se puede adaptar para otros candidatos a proteínas.
En la sección 2.3 demostramos que las estrategias de cristalización racional establecidas podrían ser beneficiosas para el cultivo de cristales con volúmenes de dispersión suficientes para la cristalografía de proteínas de neutrones. Aquí, demostramos que las estrategias racionales de optimización propuestas también permiten la generación de una población uniforme de cristales de cualquier tamaño específico necesario para los enfoques de determinación de la estructura aguas abajo.
Estos dos experimentos están diseñados para enfatizar la importancia de los diagramas de fase en el control de la nucleación de cristal y el crecimiento. Aquí, el control de la temperatura y la composición química de las soluciones de cristalización en combinación con el monitoreo del proceso de cristalización en tiempo real se utilizan para estudiar el diagrama de fase cualitativa. Utilizando este método, la nucleación y el crecimiento de cristales se pueden optimizar racionalmente de una manera reversible. El uso de este enfoque en serie también reduce la cantidad de proteínas y el tiempo necesario para controlar el tamaño y la calidad de los cristales.
En el método de diálisis, una solución proteica se separa de una solución de cristalización por una membrana semi-permeable6 (Figura 5). Esta membrana de diálisis permite que moléculas pequeñas como aditivos, tampón e iones pasen a través de la membrana pero no macromoléculas como las proteínas6,20. Esta característica permite modificar la solución de cristalización durante el transcurso del experimento6. El intercambio de la solución se puede realizar manualmente, por ejemplo en botones de microdiálisis, o de forma automatizada utilizando un instrumento desarrollado para este fin, OptiCrys8.
En el primer conjunto de experimentos, se utilizaron botones de microdiálisis para la cristalización de la lisozyme de clara de huevo de pollo. Los botones de microdiálisis estaban inmersos en soluciones de cristalización con diferentes concentraciones de sal. En este sencillo experimento de cuadrícula de cristalización, la única variable es la concentración precipitante, mientras que la temperatura se mantiene constante (293 K). Como se muestra en la Figura 4,ligeras variaciones en la concentración de sal inducen un cambio en el tamaño y el número de cristales observados, permitiendo la investigación del diagrama de fase de cristalización. En la Figura 4,panel 1, la solución de cristalización contiene NaCl de 0,7 M y un número limitado de cristales más grandes han aparecido en los botones. Al aumentar la concentración de sal de 0,7 a 1,2 M, la sobresaturación aumenta y la solución en la zona de nucleación se aleja de la zona metástasis(Figura 4,paneles 1 a 6). Como resultado, el número de cristales aumenta y su tamaño disminuye.
En el primer experimento con un instrumento totalmente automatizado que permite la cristalización de diálisis controlada por temperatura, OptiCrys(Figura 9),el experimento de crecimiento de cristal se adaptó para generar un gran crecimiento de cristal. El experimento se lanzó a una temperatura inicial de 295 K con una solución de cristalización que contiene 0,75 M NaCl y 0,1 M Na acetato buffer pH 4. En estas condiciones experimentales, la solución de cristalización llegó a la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis del diagrama de fase(Figura 9,flecha 1). Como resultado, sólo unos pocos núcleos fueron generados durante la primera etapa del experimento. Con el fin de cultivar cristales seleccionados aún más (que se muestra en la Figura 9),el flujo de trabajo de optimización del crecimiento de cristal se dirigió hacia la zona metástasis por temperatura variable tan pronto como se alcanzó el equilibrio cristalino-solución.
Cada vez que se alcanzaba el equilibrio entre el cristal y la solución, la temperatura se bajaba, primero a 291 K, luego a 288 K y finalmente a 275 K, para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis. El resultado de este experimento es un único cristal grande adecuado tanto para rayos X macromoleculares como para cristalografía de neutrones.
Para la mayoría de las proteínas, el diagrama de fase cuantitativa preciso (o simplemente un diagrama cualitativo) aún no se ha obtenido debido a la falta de dispositivos experimentales capaces de medir con precisión la concentración de proteínas (o simplemente de observar /detectar el proceso de cristalización en tiempo real) durante los experimentos de cristalización18. Como resultado, a menudo no es posible diseñar el experimento de tal manera que la cristalización comienza en el área óptima del diagrama de fase, en las proximidades de la zona metástasis.
Por lo tanto, un estudio de optimización de cristalización debe tener lugar antes de que se lleve a cabo el experimento dedicado al crecimiento de un cristal de gran volumen. En este estudio, utilizando variaciones de temperatura (en composición química constante) por un lado y variaciones en la composición química (a temperatura constante) por otro lado, son necesarias para identificar la zona metástasis y delinear las condiciones óptimas para iniciar un gran experimento de crecimiento de cristal.
Con este fin, se presentan otros dos experimentos que fueron diseñados para demostrar la reversibilidad de los experimentos de cristalización de diálisis controlados por temperatura con OptiCrys para la nucleación, el crecimiento de cristales, la disolución y el re-crecimiento. El flujo de trabajo de optimización del crecimiento de cristales se controló de modo que se culta una población uniforme de menos cristales de lysozyme más grandes, utilizando la variación de la temperatura o la concentración precipitada.
En el segundo experimento con OptiCrys, la composición química de la solución de cristalización se mantuvo constante durante todo el experimento (0,9 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4) con temperatura variable. La temperatura inicial se fijó en 291 K. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 10. Debido a la alta supersaturación, un gran número de pequeños cristales aparecieron en la cámara de cristalización(Figura 10,paneles 1 y 2). De acuerdo con el concepto de solubilidad proteica directa, al aumentar gradualmente la temperatura a 313 K, todos los cristales fueron disueltos(Figura 10,paneles 3, 4 y 5). Finalmente, al bajar la temperatura a 295 K, se inició la segunda nucleación en las proximidades de la zona metástasis y permitió la formación controlada de un menor número de núcleos. Un mayor crecimiento del cristal dio lugar a la generación uniforme de una población de cristales más grandes(Figura 10,panel 7).
Como se muestra en la Figura 11,la variación de la composición química de la solución de cristalización, a una temperatura constante de 291 K, también se puede utilizar para obtener una población uniforme de cristales más grandes. Al igual que el experimento anterior, la condición inicial era 0,9 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4. La concentración nacl se redujo gradualmente de 0,9 M a cero para disolver los cristales(Figura 11,paneles 4 y 5). En este punto, NaCl fue reemplazado por completo por una solución de búfer de 0,1 M CH3COONa pH 4. La reducción de la concentración de sal mantiene la solución en la zona subsaturada del diagrama de fase, lo que conduce a la disolución de los cristales. A continuación, se inyectó en la cámara del depósito una nueva solución de cristalización con menor resistencia iónica, a 0,75 M NaCl en 0,1 M CH3COONa pH 4. En esta concentración precipitada, aparecieron los primeros núcleos(Figura 11,panel 6) después de 90 minutos. El número de cristales generados fue menor y los cristales alcanzan un volumen mayor(Figura 11,panel 7) que antes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figura 1: Diagrama de fase esquemática. Las trayectorias cinéticas para tres técnicas de cristalización están representadas en un régimen de salazón. Cada método logra la nucleación y cristalización de manera diferente, visualizada por una vía cinética diferente a través del diagrama de fase para llegar a las zonas de nucleación y metástasis. La curva de solubilidad separa las regiones de subsaturación y sobresaturación. La supersaturación se divide en tres zonas: metástasis, nucleación y precipitación. En la zona de nucleación, la nucleación espontánea ocurre mientras que en la zona metástasis se produce el crecimiento del cristal. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figura 2: Representación esquemática del banco de cristalización (OptiCrys). La fuente de luz LED se encuentra en la parte superior de la célula de flujo de diálisis controlada por temperatura. Un microscopio invertido y la cámara digital se muestran en la parte superior derecha de la imagen con la flecha roja. El círculo rojo representa la ubicación del tubo del enfriador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama esquemático de fase de cristalización de proteínas bidimensionales en función de la temperatura (A) y la concentración precipitada (B). (A) En el caso de una proteína con solubilidad directa, la disminución de la temperatura mantiene la solución de cristalización en la zona metástasis. La variación de temperatura se puede repetir varias veces para controlar el proceso de crecimiento del cristal hasta que se obtienen cristales con el volumen deseado. (B) Cambiar la concentración de la solución precipitante también se puede utilizar para mantener la solución de cristalización en la zona metástasis para el cultivo de cristales. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figura 4: Cristales de lysozyme obtenidos utilizando el método de diálisis. Este experimento se realizó a una temperatura constante de 293 K en 0,1 M tampón de acetato sódico pH 4. El aumento de la concentración de NaCl de 0,7 M a 1,2 M aumenta la tasa de nucleación y da como resultado un mayor número de cristales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figura 5: Visión general del proceso de cristalización de proteínas por el método de diálisis. (A) Al añadir la proteína a la cámara del botón de diálisis, (B) se crea una forma de domo en la parte superior de la cámara. (C) Se utiliza un aplicador para transferir el anillo O a la ranura del botón de diálisis con el fin de fijar la membrana de diálisis en su lugar. (D) El botón de diálisis está listo para la inmersión en la solución de depósito. (E) La solución de cristalización pasa a través de la membrana semipermeable y los cristales comienzan a formarse dentro de la cámara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figura 6: Vista esquemática de la configuración de diálisis de flujo controlada por temperatura. (A) La muestra de proteínas se añade a la cámara de diálisis. (B) La membrana de diálisis se fija en la sobrecámara con un anillo en T mediante el uso de un aplicador. (C) La sobrecámara se gira y fija en la parte superior de la cámara de diálisis. Las flechas blancas indican dónde se colocan los tornillos en la sobrecámara. (D) La cámara del depósito se gira en el sentido de las agujas del reloj (E) y se fija en la parte superior de la sobrecámara. (F) La cámara del depósito está cubierta por una tapa hermética con conectores a un sistema de bombeo y (G) la celda de flujo se coloca en el soporte de latón. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figura 7: Preparación e inyección de la solución de cristalización en el depósito por el sistema fluido (A). Los tubos que contienen sal y agua están conectados al controlador de presión/vacío (B) y a la válvula giratoria (C). Mediante el uso de la presión, el controlador de presión/vacío crea un flujo constante de los líquidos desde los tubos hasta la válvula giratoria. Cada líquido que pasa a través del medidor de flujo (D) y el interruptor se inyecta en el tubo de mezcla (F). Una vez que todos los líquidos se han añadido al tubo de mezcla, el interruptor mediante algunas modificaciones inyecta la solución final del tubo de mezcla en el depósito (G). El líquido fluye a través del sistema en la dirección de las flechas en el diagrama marcado en orden ascendente (de 1 a 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figura 8: Vista de mantenimiento del software de supervisión. Esta vista se utiliza para controlar diferentes parámetros como la temperatura, la luz, la solución de cristalización y el zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figura 9: El diagrama de fase en función de la temperatura (las imágenes seleccionadas deben seguirse en orden ascendente). Se obtiene un solo cristal de lizima grande cambiando sistemáticamente la temperatura de 295 K a 275 K. En cada paso, el crecimiento del cristal se detiene al alcanzar la curva de solubilidad. Reducir la temperatura manteniendo la solución en la zona metástasis reinicia el crecimiento del cristal. Las imágenes tienen diferentes niveles de aumento. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figura 10: Optimización del crecimiento de cristales en composición química constante mediante control de temperatura (las imágenes seleccionadas deben ser rastreadas en orden ascendente). Iniciar el proceso de nucleación en la zona de nucleación a 291 K, lejos de la zona metástasis, resulta en la formación de numerosos cristales. Aumentar la temperatura a 313 K luego disuelve los cristales hasta que no se vean núcleos visibles en la cámara de diálisis. Por último, la disminución de la temperatura a 295 K reinicia el proceso de nucleación por segunda vez, lo que conduce a un número limitado de cristales más grandes. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figura 11: Optimización del crecimiento del cristal a temperatura constante utilizando variaciones en la concentración precipitada (las imágenes seleccionadas deben ser rastreadas en orden ascendente). La disminución de la concentración precipitante de 0,9 M a 0 M disuelve los cristales obtenidos durante el primer evento de nucleación. El proceso de cristalización se reinicia mediante la inyección del mismo precipitante pero con menor resistencia iónica, 0,75 M, lo que conduce a la formación de unos cristales más grandes. Esta figura está adaptada desde Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.

Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Existen diferentes enfoques de cristalización para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía de rayos X y neutrones. Uno de estos enfoques es el uso del método de diálisis. En esta técnica, la solución proteica se separa de una solución precipitante por una membrana semipermeable.Las moléculas precipitantes se difunden a través de la membrana en la cámara de proteínas. Cuando se logra la supersaturación correcta para una nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos. Aquí, demostraremos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio que utiliza cristalización de diálisis controlada por temperatura, y nuestros botones de micro diálisis para el cultivo de cristales de alta calidad para cristalografía macromolecular natural basada en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.Para un botón de micro diálisis con cierta pipeta de volumen de microlitro 35 microlitros de solución de lisozyme en la cámara de diálisis. Este volumen adicional crea una forma ligeramente domo en la parte superior de la cámara de diálisis y evita la formación de burbujas de aire. Tome un aplicador y coloque el elástico o el anillo en su extremidad.Coloque la membrana en la parte superior de la cámara y fijarla transfiriendo el elástico o el anillo del aplicador a la ranura del botón de diálisis. Transfiera el botón al pozo que contiene la solución de cristalización. Cubra el pozo con un resbalón de cubierta de vidrio o un trozo de cinta adhesiva.Mantenga la muestra en 293 Kelvin en una incubadora de regulador térmico libre de vibraciones. Sabiendo que la cristalización de diálisis ofrece ventajas desde el punto de vista del crecimiento del cristal, el banco de cristalización llamado OptiCrys fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para ofrecer un control combinado totalmente automatizado de la temperatura y la composición química del experimento de cristalización biomolecular. La optimización del crecimiento del cristal por OptiCrys se basa en los diagramas de fase de concentración precipitante de temperatura.La nucleación se produce en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis después del diagrama de fase, hasta que la concentración de proteínas alcanza la curva de solubilidad que representa el equilibrio termodinámico entre solución y cristales. Al disminuir la temperatura en el caso de la proteína con solubilidad directa o aumentando la concentración precipitante en caso de salida de salazón, la solución de cristalización permanece en la zona metástasis y no se produce ninguna nucleación. Los cristales crecen hasta que el segundo equilibrio de solución de cristal logra y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales.Disminuir la temperatura o aumentar la concentración precipitante se repite varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. Agregue la solución proteica a la cámara de diálisis del flujo controlado por temperatura, cubra la cámara de sobremesa con la membrana de diálisis y fije la membrana con el elástico o el anillo. Voltea la cámara y colóquela encima de la cámara de diálisis.Presiónelo suave y lentamente para eliminar todo el aire atrapado entre dos piezas, fijar el depósito en su posición atornillando suavemente en la parte superior de la cámara superior. Agregue la solución de cristalización a la cámara del depósito y cúbrala con la tapa hermética. Transferir este conjunto e insertarlo en el soporte mamario del banco de cristalización OptiCrys Crystal crecimiento es un software de supervisión de la Crystallization Bench OptiCrys.Incluye cuatro interfaces gráficas o vistas diferentes. La vista de inicio contiene botones para navegar a las otras vistas. El propósito de la interfaz de configuración es definir un escenario de experimento que se puede ejecutar automáticamente en la vista de prueba.La última vista es la vista de mantenimiento. Para reiniciar un experimento, la vista de mantenimiento debe estar abierta donde se encuentran todos los parámetros esenciales para el funcionamiento suave de los experimentos de cristalización. Aumentar la luminosidad de la sección de luz, la luz puede aumentar de cero, sin luz a 100 brillo máximo.Para controlar y controlar la temperatura, se utiliza la sección del regulador de temperatura. Haga clic en el botón para encenderlo. Ajuste la temperatura en la sección de punto de ajuste y pulse Intro.Debajo de este botón, hay dos gráficos. El rojo muestra la final, la temperatura de orden y el gráfico amarillo muestra la temperatura actual. Mezclando una solución de stock, una inyección de la solución de cristalización a la cámara del depósito es controlada por la sección Palm.Añada la concentración de la solución de stock en la primera etapa. A continuación, busque la concentración final de cada nueva solución de mero y agréguelos a la sección de concentración final. Después de pulsar el botón calcular, averiguar el volumen de la solución de stock se calculará y añadirá en el panel de volumen delante de cada panel de concentración.Pulse el botón de preparación del lanzamiento y espere hasta que la nueva solución premier esté lista. Para intercambiar la solución de cristalización, haga clic en el botón Entrada de solución. Para detener el proceso, pulse el botón Detener distribución.En el lado derecho de la sección del microscopio, hay varios paneles para registrar información importante de cada experimento de crecimiento de cristal. Agregue el nombre de las proteínas correspondientes, el peso molecular y la condición de cristalización en esta sección. Defina un nombre para sus experimentos simplemente escribiéndolo en el nombre de la carpeta.En la sección imágenes nb, seleccione el número de imágenes que se deben tomar durante el experimento. Agregue el número de imágenes y, desde el panel de la derecha, elija la escala del temporizador. Haga clic en el botón de carpeta para abrir la carpeta.En esta carpeta, hay un archivo de texto que contiene toda la información que definió anteriormente para el experimento. Las imágenes listas para cualquier tratamiento adicional también se guardan en esta carpeta. El zoom del microscopio también se puede variar automáticamente.Cambia el zoom usando el botón más y menos en la parte superior de la sección del microscopio para aumentar o disminuir la ampliación respectivamente. Hay tres maneras diferentes de medir el tamaño del cristal. Para medir la longitud o anchura utilice el vector de anchura.Dependiendo de la forma del cristal, se pueden elegir las herramientas específicas de la parte izquierda de la sección del microscopio. Como un polígono o un polígono. Los valores aparecerán en la sección de medida.En el primer conjunto de experimentos, los botones de microdiálisis se sumergieron en las soluciones de cristalización con diferentes concentraciones de sal. En este sencillo experimento de cuadrícula de cristalización, la única variable es la concentración precipitante. mientras que la temperatura se mantiene constante.Las ligeras variaciones en la concentración de sal permiten investigar el diagrama de fase de cristalización aumentando la concentración de sal de 0,7 a 1,2 aumentos de supersaturación molar y la solución en la zona de nucleación se está alejando de la zona metástasis. En consecuencia, se observa una variación en el tamaño y el número de cristales, con el número de cristales aumentando y disminuyendo su tamaño. En el primer experimento con OptiCrys bajo la condición experimental dada, una vez que el equilibrio en la cámara de diálisis alcanza, la solución de cristalización se encuentra en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis del diagrama de fase de cristalización.Como resultado, sólo unos pocos núcleos se generan durante la primera etapa del experimento. Con el fin de mantener el crecimiento de los cristales en la zona metástasis y controlar el proceso de crecimiento del cristal, la temperatura se cambió en diferentes intervalos de tiempo. Cada vez que se completaba el equilibrio de la solución de cristal, la temperatura era variada.Por lo tanto, la temperatura disminuyó a 291 Kelvin, 288 Kelvin y finalmente 275 Kelvin para mantener el crecimiento de cristal seleccionado en la zona metástasis. El resultado de este experimento es un solo cristal grande, con el volumen necesario para la cristalografía macromolecular natural. Los dos próximos experimentos demuestran la reversibilidad de los experimentos de diálisis controlados por temperatura para la nucleación, el crecimiento de cristales, la disolución y el crecimiento.En el segundo experimento con OptiCrys la composición química de la solución de cristalización se mantuvo constante a través del experimento y la temperatura varió. La temperatura inicial se fijó en 291 Kelvin. Debido a la alta supersaturación, un gran número de pequeños cristales aparecieron en la cámara de cristalización.De acuerdo con el concepto de solubilidad proteica directa, al aumentar gradualmente la temperatura a 313 Kelvin todos los cristales debían disolverse. Finalmente, al bajar la temperatura a 295 Kelvin, la segunda nucleación iniciada en las proximidades de la zona metástasis y permitió controlar el proceso de nucleación dando lugar a la formación de un menor número de núcleos. Un mayor crecimiento del cristal permitió generar la población uniforme de cristales más grandes.En este experimento, cambiar la composición química de la solución de cristalización a temperatura constante conduce a obtener una población uniforme de cristales más grandes. La condición de cristalización era similar al experimento anterior. La disolución de los cristales se logró reduciendo gradualmente la concentración nacl de 0,9 molar a cero.La reducción de la concentración de sal mantiene la solución en la zona subsaturada del diagrama de fase que conduce a la disolución de los cristales. A continuación, la nueva solución de cristalización con menor resistencia iónica que antes se inyectaba en la cámara del depósito. En esta concentración precipitada aparece el menor número de cristales y los cristales alcanzan un volumen mayor que antes.Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y ajusta el software de control para el cultivo de cristales grandes y de alta calidad para cristalografía macromolecular natural utilizando un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio. Este procedimiento paso a paso fue diseñado y beneficiarse del conocimiento del diagrama de fase de cristalización con el fin de separar la nucleación y el crecimiento de cristales. Además, también se presenta un protocolo para el cultivo de cristales con patrones de microcitosis utilizando botones de macrocitosis como alternativa cuando OptiCrys no está disponible.Además de las estrategias que mencioné para OptiCrys cambiar la composición química de la solución de cristalización y la temperatura y tomar imágenes debe hacerse manualmente. Se requiere el uso de la vibración regulada térmicamente para que la incubadora mantenga la temperatura constante, lo que es un paso crítico en la metodología demostrada.

optimization-crystal-growth-for-neutron-macromolecular

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Sistemas automatizados y protocolos para la preparación rutinaria de un gran número de pantallas y nanoliter gotitas de cristalización para los experimentos de difusión de vapor se describen y discuten.

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

Aquí presentamos un protocolo para la producción controlada de microcristales de proteína. El proceso utiliza un dispositivo automatizado que permita manipulación controlada de varios parámetros de cristalización. La cristalización de proteínas es realizados por adición controlada y automatizada de soluciones de la cristalización mientras que vigilar e investigar la distribución de radio de las partículas en la gota de cristalización.

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

Se presenta un nuevo portamuestras para cristalografía de rayos X macromolecular junto con un protocolo de manipulación adecuado. El sistema permite el crecimiento de cristales, el remojo de cristales y la recopilación de datos de difracción in situ a temperatura ambiente y criogénica sin necesidad de manipulación o montaje de cristales.

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

El objetivo de este artículo es dar al espectador una sólida comprensión de cómo transformar su protocolo de difusión de vapor de pequeño volumen, para cultivar cristales grandes de una sola proteína, en un método de microcristalización por lotes de gran volumen para cristalografía en serie.

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

La cristalografía de proteínas de neutrones es una técnica estructural que permite la localización de átomos de hidrógeno, proporcionando así importantes detalles mecanicistas de la función de la proteína. Presentamos aquí el flujo de trabajo para el montaje de un cristal de proteína, la recopilación de datos de difracción de neutrones, el refinamiento de la estructura y el análisis de los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones.

Recopilación y procesamiento de datos de cristalografía de neutrones para modelar átomos de hidrógeno en estructuras de proteínas

Se describe un versátil dispositivo microfluídico que permite la cristalización de una enzima utilizando el método de contradifusión, la introducción de un sustrato en los cristales por remojo y la determinación de la estructura 3D de la enzima: complejo de sustratos mediante un análisis en serie de cristales dentro del chip a temperatura ambiente.

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

La relación señal-ruido de los datos es una de las consideraciones más importantes para realizar mediciones de difracción de rayos X a partir de microcristales. La línea de haz VMXm proporciona un entorno de bajo ruido y microhaces para tales experimentos. Aquí, describimos los métodos de preparación de muestras para montar y enfriar microcristales para VMXm y otras líneas de haz de cristalografía macromolecular de microenfoque.

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

El protocolo presentado describe un enfoque sencillo para la detección de las condiciones de cristalización de proteínas y el crecimiento de cristales utilizando una placa de diálisis de alto rendimiento de 96 pocillos. El uso de tubos dializadores para el crecimiento a gran escala de microcristales también se demuestra para aplicaciones de cristalografía en serie y MicroED.

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

La estructura 3-D de una molécula proporciona un conocimiento único de cómo funciona la molécula. El principal método para la determinación de la estructura en casi atómica resolución cristalografía de rayos X. En este sentido, demostrar los métodos actuales de obtención de cristales tridimensionales de cualquier macromolécula, dado que son adecuados para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos X.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Aprende a optimizar el crecimiento de cristales de macromoléculas mediante diálisis controlada por temperatura con el sistema automatizado OptiCrys. Este protocolo mejora la calidad cristalina para cristalografía de rayos X y neutrones.

Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

Explorar más videos