Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones
13 de marzo de 2021
Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.
Existen diferentes enfoques de cristalización para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía de rayos X y neutrones. Uno de estos enfoques es el uso del método de diálisis. En esta técnica, la solución proteica se separa de una solución precipitante por una membrana semipermeable.
Las moléculas precipitantes se difunden a través de la membrana en la cámara de proteínas. Cuando se logra la supersaturación correcta para una nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos. Aquí, demostraremos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio que utiliza cristalización de diálisis controlada por temperatura, y nuestros botones de micro diálisis para el cultivo de cristales de alta calidad para cristalografía macromolecular natural basada en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.
Para un botón de micro diálisis con cierta pipeta de volumen de microlitro 35 microlitros de solución de lisozyme en la cámara de diálisis. Este volumen adicional crea una forma ligeramente domo en la parte superior de la cámara de diálisis y evita la formación de burbujas de aire. Tome un aplicador y coloque el elástico o el anillo en su extremidad.
Coloque la membrana en la parte superior de la cámara y fijarla transfiriendo el elástico o el anillo del aplicador a la ranura del botón de diálisis. Transfiera el botón al pozo que contiene la solución de cristalización. Cubra el pozo con un resbalón de cubierta de vidrio o un trozo de cinta adhesiva.
Mantenga la muestra en 293 Kelvin en una incubadora de regulador térmico libre de vibraciones. Sabiendo que la cristalización de diálisis ofrece ventajas desde el punto de vista del crecimiento del cristal, el banco de cristalización llamado OptiCrys fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para ofrecer un control combinado totalmente automatizado de la temperatura y la composición química del experimento de cristalización biomolecular. La optimización del crecimiento del cristal por OptiCrys se basa en los diagramas de fase de concentración precipitante de temperatura.
La nucleación se produce en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis después del diagrama de fase, hasta que la concentración de proteínas alcanza la curva de solubilidad que representa el equilibrio termodinámico entre solución y cristales. Al disminuir la temperatura en el caso de la proteína con solubilidad directa o aumentando la concentración precipitante en caso de salida de salazón, la solución de cristalización permanece en la zona metástasis y no se produce ninguna nucleación. Los cristales crecen hasta que el segundo equilibrio de solución de cristal logra y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales.
Disminuir la temperatura o aumentar la concentración precipitante se repite varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. Agregue la solución proteica a la cámara de diálisis del flujo controlado por temperatura, cubra la cámara de sobremesa con la membrana de diálisis y fije la membrana con el elástico o el anillo. Voltea la cámara y colóquela encima de la cámara de diálisis.
Presiónelo suave y lentamente para eliminar todo el aire atrapado entre dos piezas, fijar el depósito en su posición atornillando suavemente en la parte superior de la cámara superior. Agregue la solución de cristalización a la cámara del depósito y cúbrala con la tapa hermética. Transferir este conjunto e insertarlo en el soporte mamario del banco de cristalización OptiCrys Crystal crecimiento es un software de supervisión de la Crystallization Bench OptiCrys.
Incluye cuatro interfaces gráficas o vistas diferentes. La vista de inicio contiene botones para navegar a las otras vistas. El propósito de la interfaz de configuración es definir un escenario de experimento que se puede ejecutar automáticamente en la vista de prueba.
La última vista es la vista de mantenimiento. Para reiniciar un experimento, la vista de mantenimiento debe estar abierta donde se encuentran todos los parámetros esenciales para el funcionamiento suave de los experimentos de cristalización. Aumentar la luminosidad de la sección de luz, la luz puede aumentar de cero, sin luz a 100 brillo máximo.
Para controlar y controlar la temperatura, se utiliza la sección del regulador de temperatura. Haga clic en el botón para encenderlo. Ajuste la temperatura en la sección de punto de ajuste y pulse Intro.
Debajo de este botón, hay dos gráficos. El rojo muestra la final, la temperatura de orden y el gráfico amarillo muestra la temperatura actual. Mezclando una solución de stock, una inyección de la solución de cristalización a la cámara del depósito es controlada por la sección Palm.
Añada la concentración de la solución de stock en la primera etapa. A continuación, busque la concentración final de cada nueva solución de mero y agréguelos a la sección de concentración final. Después de pulsar el botón calcular, averiguar el volumen de la solución de stock se calculará y añadirá en el panel de volumen delante de cada panel de concentración.
Pulse el botón de preparación del lanzamiento y espere hasta que la nueva solución premier esté lista. Para intercambiar la solución de cristalización, haga clic en el botón Entrada de solución. Para detener el proceso, pulse el botón Detener distribución.
En el lado derecho de la sección del microscopio, hay varios paneles para registrar información importante de cada experimento de crecimiento de cristal. Agregue el nombre de las proteínas correspondientes, el peso molecular y la condición de cristalización en esta sección. Defina un nombre para sus experimentos simplemente escribiéndolo en el nombre de la carpeta.
En la sección imágenes nb, seleccione el número de imágenes que se deben tomar durante el experimento. Agregue el número de imágenes y, desde el panel de la derecha, elija la escala del temporizador. Haga clic en el botón de carpeta para abrir la carpeta.
En esta carpeta, hay un archivo de texto que contiene toda la información que definió anteriormente para el experimento. Las imágenes listas para cualquier tratamiento adicional también se guardan en esta carpeta. El zoom del microscopio también se puede variar automáticamente.
Cambia el zoom usando el botón más y menos en la parte superior de la sección del microscopio para aumentar o disminuir la ampliación respectivamente. Hay tres maneras diferentes de medir el tamaño del cristal. Para medir la longitud o anchura utilice el vector de anchura.
Dependiendo de la forma del cristal, se pueden elegir las herramientas específicas de la parte izquierda de la sección del microscopio. Como un polígono o un polígono. Los valores aparecerán en la sección de medida.
En el primer conjunto de experimentos, los botones de microdiálisis se sumergieron en las soluciones de cristalización con diferentes concentraciones de sal. En este sencillo experimento de cuadrícula de cristalización, la única variable es la concentración precipitante. mientras que la temperatura se mantiene constante.
Las ligeras variaciones en la concentración de sal permiten investigar el diagrama de fase de cristalización aumentando la concentración de sal de 0,7 a 1,2 aumentos de supersaturación molar y la solución en la zona de nucleación se está alejando de la zona metástasis. En consecuencia, se observa una variación en el tamaño y el número de cristales, con el número de cristales aumentando y disminuyendo su tamaño. En el primer experimento con OptiCrys bajo la condición experimental dada, una vez que el equilibrio en la cámara de diálisis alcanza, la solución de cristalización se encuentra en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis del diagrama de fase de cristalización.
Como resultado, sólo unos pocos núcleos se generan durante la primera etapa del experimento. Con el fin de mantener el crecimiento de los cristales en la zona metástasis y controlar el proceso de crecimiento del cristal, la temperatura se cambió en diferentes intervalos de tiempo. Cada vez que se completaba el equilibrio de la solución de cristal, la temperatura era variada.
Por lo tanto, la temperatura disminuyó a 291 Kelvin, 288 Kelvin y finalmente 275 Kelvin para mantener el crecimiento de cristal seleccionado en la zona metástasis. El resultado de este experimento es un solo cristal grande, con el volumen necesario para la cristalografía macromolecular natural. Los dos próximos experimentos demuestran la reversibilidad de los experimentos de diálisis controlados por temperatura para la nucleación, el crecimiento de cristales, la disolución y el crecimiento.
En el segundo experimento con OptiCrys la composición química de la solución de cristalización se mantuvo constante a través del experimento y la temperatura varió. La temperatura inicial se fijó en 291 Kelvin. Debido a la alta supersaturación, un gran número de pequeños cristales aparecieron en la cámara de cristalización.
De acuerdo con el concepto de solubilidad proteica directa, al aumentar gradualmente la temperatura a 313 Kelvin todos los cristales debían disolverse. Finalmente, al bajar la temperatura a 295 Kelvin, la segunda nucleación iniciada en las proximidades de la zona metástasis y permitió controlar el proceso de nucleación dando lugar a la formación de un menor número de núcleos. Un mayor crecimiento del cristal permitió generar la población uniforme de cristales más grandes.
En este experimento, cambiar la composición química de la solución de cristalización a temperatura constante conduce a obtener una población uniforme de cristales más grandes. La condición de cristalización era similar al experimento anterior. La disolución de los cristales se logró reduciendo gradualmente la concentración nacl de 0,9 molar a cero.
La reducción de la concentración de sal mantiene la solución en la zona subsaturada del diagrama de fase que conduce a la disolución de los cristales. A continuación, la nueva solución de cristalización con menor resistencia iónica que antes se inyectaba en la cámara del depósito. En esta concentración precipitada aparece el menor número de cristales y los cristales alcanzan un volumen mayor que antes.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y ajusta el software de control para el cultivo de cristales grandes y de alta calidad para cristalografía macromolecular natural utilizando un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio. Este procedimiento paso a paso fue diseñado y beneficiarse del conocimiento del diagrama de fase de cristalización con el fin de separar la nucleación y el crecimiento de cristales. Además, también se presenta un protocolo para el cultivo de cristales con patrones de microcitosis utilizando botones de macrocitosis como alternativa cuando OptiCrys no está disponible.
Además de las estrategias que mencioné para OptiCrys cambiar la composición química de la solución de cristalización y la temperatura y tomar imágenes debe hacerse manualmente. Se requiere el uso de la vibración regulada térmicamente para que la incubadora mantenga la temperatura constante, lo que es un paso crítico en la metodología demostrada.
Descripción general
nEste estudio presenta un protocolo de cristalización que utiliza el instrumento automatizado OptiCrys y botones de microdiálisis para cultivar cristales grandes y de alta calidad, esenciales para la cristalografía de rayos X y de neutrones. Se centra en aprovechar el diagrama de fases de cristalización para optimizar el crecimiento de cristales.
nnComponentes Clave del Estudio
nnÁrea de Investigación
n- Crystalografía
- Crstalización de proteínas
- Configuraciones experimentales automatizadas
Antecedentes
n- Los cristales de alta calidad son cruciales para los estudios de biología estructural.
- El método de diálisis separa las soluciones proteicas de las soluciones precipitantes para promover la nucleación espontánea.
- Los diagramas de fase de cristalización orientan la optimización de las condiciones de nucleación y crecimiento.
Métodos Utilizados
n- Crucial de cristalización por diálisis con temperatura controlada
- Lisozima como ejemplo de sistema biológico
- Banco de cristalización OptiCrys para control automatizado
Resultados principales
n- Se logró una cristalización exitosa mediante condiciones optimizadas.
- El tamaño y la calidad de los cristales se monitorearon y mejoraron utilizando controles automatizados.
- El protocolo permite reproducibilidad y eficiencia en los experimentos de cristalización.
Conclusiones
n- El estudio demuestra un método confiable para cultivar cristales biomoleculares de alta calidad.
- Este enfoque es significativo para avanzar las técnicas de biología estructural.
Preguntas frecuentes
nRelevancia Ejecutiva para la Industria
La cristalografía macromolecular con neutrones requiere cristales grandes y de alta calidad debido a la debilidad de las fuentes de neutrones, lo que crea un cuello de botella en biología estructural para macromoléculas y complejos grandes. El control automatizado de los parámetros de cristalización mediante estrategias guiadas por diagramas de fases permite la producción reproducible de cristales adecuados para difracción de neutrones, apoyando directamente la reducción de riesgos del blanco en las etapas iniciales del descubrimiento. Este enfoque mejora la confianza predictiva en estudios estructurales al garantizar la generación confiable y escalable de cristales para obtener información mecanicista.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante datos estructurales de alta resolución obtenidos de cristales grandes.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar condiciones reproducibles de crecimiento de cristales para proteínas diana.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al ofrecer confianza estructural en las interacciones entre dianas y ligandos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante una calidad de cristal constante.
- Valor operativo: Estandariza el resultado de la cristalización mediante el control automatizado de la temperatura y la concentración del precipitante.
- Reutilización de la plataforma: Facilita la evaluación escalable de compuestos al generar poblaciones uniformes de cristales adecuadas para estudios de difracción.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta datos estructurales en etapa de descubrimiento con la validación preclínica mediante la producción confiable de cristales.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Apoya el diseño basado en estructuras al permitir cristales de alta calidad para la cristalografía macromolecular de neutrones.
- Avance Ajustado al Riesgo: Informa decisiones de continuar o descartar proyectos mediante conocimientos estructurales reproducibles obtenidos de la cristalización optimizada.
Integración de la tubería y del flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, al permitir flujos de trabajo de biología estructural que dependen de cristales grandes y de alta calidad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas mediante datos estructurales obtenidos de cristales cultivados en condiciones guiadas por diagramas de fases.
- Selección: Garantiza la disponibilidad del ensayo mediante el crecimiento automatizado y reproducible de cristales, con resultados cuantificables en tamaño y calidad.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas del tamaño de los cristales y de la cinética de nucleación para comparar condiciones de cristalización.
- Investigación Traducida: Se conecta con la continuidad preclínica al suministrar cristales para difracción de neutrones, permitiendo una comprensión mecanicista de la función del blanco.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para equipos de biología estructural en distintos proyectos que requieran cristales macromoleculares de alta calidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante datos estructurales de alta resolución obtenidos por cristalografía macromolecular de neutrones.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante el control automatizado de la temperatura y la composición química en la cristalización.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al reducir la incertidumbre biológica en la estructura y función del objetivo.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante datos estructurales confiables que permiten decisiones informadas sobre el avance de proyectos.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en la interpretación de diagramas de fase de cristalización y en bioquímica de proteínas.
- Instrumentación para cristalización por diálisis con control de temperatura y monitoreo en tiempo real del crecimiento de cristales.
- Normalización de protocolos de cristalización entre diferentes equipos para obtener cristales reproducibles.
- Consideraciones para la adaptación a distintos perfiles de solubilidad proteica y sistemas de precipitantes.
- Límite práctico: requiere un volumen significativo de cristal para la difracción de neutrones, lo que exige la optimización de las condiciones de crecimiento.
