Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático
5 de noviembre de 2020
El jugo pancreático es una fuente preciosa de biomarcadores para el cáncer de páncreas humano. Describimos aquí un método para el procedimiento de recolección intraoperatoria. Para superar el desafío de adoptar este procedimiento en modelos murinos, sugerimos una muestra alternativa, el líquido intersticial tumoral, y describimos aquí dos protocolos para su aislamiento.
El método descrito aquí para aislar el líquido proximal tanto en humanos como en ratones, se puede aplicar para estudiar el microambiente del cáncer de páncreas para identificar nuevos biomarcadores de enfermedad. Utilizando este sencillo protocolo, es posible traducir los hallazgos clínicos del jugo pancreático a modelos murinos de PDAC para realizar estudios mecanicistas. El jugo pancreático es un fluido corporal en gran parte inexplorado que ha demostrado ser prometedor como fuente de biomarcadores valiosos para ayudar al diagnóstico preoperatorio y al perfil del paciente.
Yo mostraré la primera parte del protocolo, y Marialuisa Barbagallo, postdoc de nuestro laboratorio, demostrará la segunda parte del protocolo. Estimar la ubicación del conducto pancreático utilizando las mediciones adquiridas durante la toma de imágenes. A continuación, palpa la superficie anterior del páncreas para identificar su ubicación precisa.
Sostenga la cabeza del páncreas en el duodeno desde abajo y elévela con la mano izquierda, marcando la ubicación del conducto pancreático con el primer dedo. Use la mano derecha para insertar una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 25 en el páncreas, justo distal al pulgar izquierdo. Decidir la profundidad de penetración y el grado de inclinación de la aguja en función de las mediciones preoperatorias y de la percepción de haber penetrado en la pared del conducto.
Retire el jugo con la jeringa. Si no es posible recuperar el jugo, reubique la aguja en un intento de canular el conducto pancreático. Una vez que se recupera el jugo pancreático, muévalo fuera del campo estéril y transfiéralo a un tubo de ensayo de vacío EDTA de tres mililitros.
Mantenga el tubo a cuatro grados centígrados hasta que la muestra se transfiera al laboratorio. Para procesar el jugo pancreático, centrifugue a 400 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para eliminar cualquier célula o residuo. Recuperar el sobrenadante, alícuota y almacenarlo a 80 grados centígrados hasta nuevos análisis.
Para aislar el líquido intersticial tumoral o TIF, por centrifugación, corte el tumor por la mitad, enjuague las dos partes con PBS y séquelas suavemente sobre papel de filtro, moviéndose lo más rápido posible para evitar la evaporación del tumor. Transfiera inmediatamente el tumor a un filtro de células de nailon de 20 micrómetros, fijado a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 400 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Recupere el TIF del fondo del tubo, luego alícuota y congélelo inmediatamente en hielo seco. Almacene a 80 grados centígrados hasta nuevo análisis. Para aislar el TIF mediante elución, corte el tumor en trozos pequeños con unas tijeras o un bisturí y enjuáguelos cuidadosamente con PBS frío.
Transfiera los trozos tumorales a un tubo de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de PBS con un cóctel de inhibidores de proteasa para evitar la degradación de los analitos. Incubar el tejido durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y realice una serie de pasos de centrifugación a cuatro grados centígrados para eliminar las células de la muestra.
Recuperar el sobrenadante después de cada centrifugación y transferirlo a un nuevo tubo. Después de la última centrifugación, alícuota y congele inmediatamente la muestra TIF en hielo seco. Guárdelo a 80 grados centígrados hasta su posterior análisis.
Este protocolo se utilizó para obtener el jugo pancreático de pacientes con PDAC y otras afecciones pancreáticas benignas. Después de filtrar las señales amplias de RMN de las macromoléculas, las señales de los metabolitos de pequeño peso molecular fueron evidentes. El análisis supervisado de OPLS-DA mostró que el perfil metabólico en el jugo pancreático fue capaz de discriminar entre pacientes con PDAC y no PDAC con una precisión del 82,4%Curiosamente, el análisis metabolómico realizado en muestras de plasma de los mismos pacientes, no arrojó el mismo poder discriminativo.
Para demostrar que el contenido de líquido intersticial tumoral refleja de manera confiable los cambios en el microambiente tumoral, se inyectaron subcutáneamente dos líneas celulares de cáncer de páncreas con tasas glucolíticas opuestas en ratones. Después de extirpar los tumores, se cuantificaron las concentraciones de glucosa y lactato. El líquido intersticial tumoral de los tumores altamente glucolíticos contenía menos glucosa y más lactato en comparación con los tumores de bajo índice glucolítico.
En este estudio se realizó un análisis metabolómico. Sin embargo, estos fluidos proximales son adecuados para muchas otras aplicaciones posteriores, como la espectrometría de masas y el perfil de microARN.
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Resumen
Este artículo presenta un método para la recopilación intraoperatoria de jugo pancreático, una fuente valiosa de biomarcadores para el cáncer de páncreas. Además, introduce una muestra alternativa, el líquido intersticial tumoral, junto con protocolos para su aislamiento en modelos murinos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Descubrimiento de biomarcadores
Antecedentes
- El jugo pancreático está poco explorado como fuente de biomarcadores.
- Tiene potencial para ayudar en el diagnóstico preoperatorio.
- Comprender el microentorno del cáncer de páncreas es crucial.
- La traducción de hallazgos de estudios en humanos a modelos murinos puede potenciar la investigación.
Objetivo del estudio
- Aislar jugo pancreático y líquido intersticial tumoral para la identificación de biomarcadores.
- Proporcionar protocolos aplicables tanto en modelos humanos como murinos.
- Facilitar estudios mecanicistas del cáncer de páncreas.
Métodos Utilizados
- Recolección intraoperatoria de jugo pancreático.
- Aislamiento del líquido intersticial tumoral.
- Técnicas de imagen para localizar el conducto pancreático.
- Palpación del páncreas para una identificación precisa.
Resultados principales
- Protocolos demostrados para el aislamiento de fluidos.
- Destacó el potencial del jugo pancreático como fuente de biomarcadores.
- Mostró la factibilidad de trasladar hallazgos clínicos a modelos murinos.
- Proporcionó una base para futuros estudios mecanicistas.
Conclusiones
- El jugo pancreático y el líquido intersticial tumoral son prometedores para la investigación de biomarcadores.
- Los protocolos pueden mejorar la comprensión del cáncer de páncreas.
- Se necesitan más estudios para explorar el potencial completo de estos líquidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de fluidos proximales permite la interrogación directa del microentorno del adenocarcinoma pancreático, ofreciendo una vía para el descubrimiento de biomarcadores que conecta observaciones clínicas y estudios mecanicistas preclínicos. Al proporcionar métodos técnicamente accesibles para la recolección de jugo pancreático y fluido intersticial tumoral en sistemas humanos y murinos, el protocolo apoya los esfuerzos de validación de dianas y desarrollo de ensayos centrados en alteraciones del microentorno. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al obtener fluidos relevantes para la enfermedad que reflejan las interacciones entre células estromales y tumorales, orientando las decisiones de avance o interrupción en los programas de descubrimiento de fármacos contra el cáncer de páncreas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de fluidos que concentran biomarcadores del microambiente tumoral.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad, útil para la validación funcional de dianas mediante biomarcadores en fluidos próximos al tumor.
- Valor científico: Apoya la reducción del riesgo mecanicista mediante el análisis comparativo de fenotipos tumorales glucolíticos a través de la cuantificación de glucosa y lactato en el LIT.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara fluidos biológicos validados para aplicaciones posteriores, como espectrometría de masas y perfilado de microARN.
- Valor operativo: Ofrece protocolos estandarizados y reproducibles de aislamiento (centrifugación y elución) adecuados para la escalabilidad de ensayos.
- Valor científico: Proporciona lecturas cuantitativas de metabolitos que permiten la detección de biomarcadores listos para cribado, con capacidad discriminatoria (precisión del 82,4 % en OPLS-DA).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Establece continuidad en sistemas relevantes para la enfermedad al trasladar hallazgos de jugo pancreático humano a modelos murinos de líquido intersticial tumoral (TIF).
- Valor operativo: Facilita la validación preclínica mediante el aislamiento de TIF a partir de modelos de tumores subcutáneos que reflejan alteraciones del microambiente.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de perfiles de biomarcadores en fluidos con el fenotipo tumoral.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos líderes, permitiendo un perfilado del microentorno que orienta estudios mecanicistas y campañas de cribado guiadas por biomarcadores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar fluidos que reflejan las interacciones estroma-tumor en el CPAD.
- Depuración: Permite la preparación de ensayos mediante el aislamiento estandarizado de líquido intersticial tumoral y jugo pancreático, obteniendo metabolitos y ácidos nucleicos cuantificables.
- Análisis: Proporciona biomarcadores mensurables (glucosa, lactato, metabolitos) para el análisis comparativo entre condiciones y la selección fenotípica.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica al demostrar que el líquido intersticial tumoral refleja el estado glucolítico del tumor en modelos murinos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el aislamiento de fluidos próximos en sistemas humanos y murinos, reduciendo las barreras de traducción entre modelos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la detección de biomarcadores del microentorno y validación de objetivos en el CPAD.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante técnicas sencillas de centrifugación y elución para el aislamiento de LIT.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar proyectos al vincular biomarcadores en fluidos con el fenotipo tumoral, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en perfiles de fluidos discriminativos por biomarcadores (precisión del 82,4 % en CPAD frente a no CPAD).
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo quirúrgico de fluidos y en la disección de tumores para el aislamiento de fluidos proximales.
- Necesita equipo de centrifugación (400 G, 4°C) y manejo estéril de fluidos para el procesamiento de jugo pancreático y TIF.
- Exige estandarización entre equipos multidisciplinarios de cirugía, patología y análisis para garantizar la integridad de las muestras.
- Implica consideraciones de adaptación para el aislamiento de TIF en modelos murinos mediante centrifugación o elución, según el tamaño del tejido y la aplicación posterior.
- Incluye limitaciones prácticas, como la dificultad técnica en la recolección de jugo pancreático en modelos murinos, lo que hace necesario utilizar el TIF como sustituto.
