Name: Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprende a aislar células progenitoras adiposas de tejido adiposo epidídimo de ratón mediante FACS con alta viabilidad. Este método validado permite análisis de secuenciación de ARN de célula única.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconocemos el Centro de Citometría de Flujo de Flujo de Núcleo de Análisis celular microscopía de Mayo Clinic para obtener ayuda con la clasificación de FACS.

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron realizados bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Preparación de soluciones 
<ol><li>Preparar solución de colágeno 2% (w/v) disolviendo la colágenasa II 2 g en la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks de 100 ml. Aliquot 200 μL cada uno para cada uso.</li>
	<li>Prepare el medio de neutralización mezclando 84 mL F-12 medio, 15 ml de suero de caballo y 1 mL de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Prepare el amortiguador de la citometría de flujo disolviendo 500 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y 400 μL de 0,5 M EDTA en 100 ml de solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. Disección de la almohadilla de grasa epidímica y la disociación tisular
<ol><li>Eutanasia humana (dislocación isoflurano/cervical) un ratón macho. En este protocolo, se utilizó un ratón FVB de cuatro meses de antigüedad.</li>
	<li>Aplicar/rociar 70% etanol en el abdomen y exponer la cavidad abdominal inferior usando tijeras y fórceps limpios.</li>
	<li>Localice la almohadilla de grasa epidímica (proximal/unida a los testículos). Sostenga la unión entre los testículos y la almohadilla de grasa epididímica con fórceps contundentes y tire suavemente para liberar la almohadilla de grasa epididímica.</li>
	<li>Retire los testículos cortando con tijeras e incubar la almohadilla de grasa epidídmica en 5 ml de HBSS complementado con 3% BSA en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Centrífuga a 150 x g durante 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Tome almohadilla flotante de grasa epidímica del tubo cónico de 50 ml y mince finamente el tejido usando tijeras limpias.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de colágeno 2% en 3,8 ml de HBSS en un tubo de cultivo de 13 ml. Añadir el tejido picado e incubar en una incubadora giratoria a 5 rpm durante 1 h a 37 °C. En lugar de una incubadora giratoria, la incubadora de cultivo celular a 37 °C se puede utilizar alternativamente con agitaciones ocasionales.</li>
	<li>Transfiera contenido completo a un tubo cónico de 50 ml y añada 10 ml de medio de neutralización. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces.</li>
	<li>Prepare otro tubo cónico de 50 ml equipado con un colador de células de 70 μm. Filtre el tejido digerido en el nuevo tubo utilizando el colador celular.</li>
	<li>Transfiera el flujo a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 350 x g durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y los pellets celulares resuspend con 5 ml de DPBS. Centrífuga a 350 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 50 μL de tampón de citometría de flujo. Mezcle bien pipeteando suavemente y mantenga las células sobre hielo. Debido al volumen de los pellets celulares y la pequeña cantidad de sobrenadante residual, el volumen total de células en el búfer de citometría de flujo será mayor que 50 μL (aproximadamente 100 μL).</li>
</ol>3. Etiquetado de anticuerpos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
<ol><li>Después de mezclar bien las células con pipeteo suave, transfiera 54 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Agregue 6 μL de reactivo de bloqueo FcR y mezcle bien pipeteando suavemente. Incubar a 4 °C durante 10 min. Guarde las células sobrantes después de tomar 54 μL y guárdelas en el hielo para usarlas como control no manchado en los pasos 3.5 y 3.6.</li>
	<li>Durante la incubación en el paso 3.1, prepara un cóctel de anticuerpos combinando 11 μL cada uno de anticuerpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC y anticuerpos anti-CD45-FITC en un tubo de microcentrífuga. Mezcle bien con tuberías suaves y mantenga el hielo protegido de la luz.</li>
	<li>Después de la incubación con reactivo de bloqueo FcR durante 10 minutos, añadir 40 μL del cóctel de anticuerpos y mezclar bien mediante pipeteo suave. Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo complementado con 1 μg/ml de DAPI en las células manchadas. Mezcle bien con suaves células de pipeteo y filtro utilizando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga las células en el hielo.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo a las células restantes en el paso 3.1 y mezclar bien mediante pipeteo suave. Filtre las células usando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga estas células sobre hielo y utilícelas como control sin manchar en el siguiente paso.</li>
	<li>Lleve las células manchadas y el control sin manchar al instrumento de análisis o clasificación FACS.<ol>
<li>Identifique y aísle la población APC+/FITC-/DAPI- con las estrategias de gating mostradas en la Figura 1. Estas células representan células Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- viables. Los desechos y los agregados celulares se agotan utilizando gráficas de dispersión hacia delante (FSC) y laterales (SSC). A continuación, DAPI- población está cerrada, seguido de gating de APC+/FITC- población. Los controles no manchados deben utilizarse para ayudar a establecer parámetros de gating.</li>
		<li>Recoja las células en 500 μL de tampón de citometría de flujo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. En el futuro, todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles para minimizar una contaminación. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células se recogen de un ratón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuente las células usando un hemociclograma para evaluar la viabilidad celular. Dado que los agregados celulares pueden interferir con más análisis posteriores, la presencia de agregados celulares también se evalúa para garantizar una presencia mínima (<5% del número de células viables) de estos agregados.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) está ganando rápidamente tracción como una poderosa herramienta para estudiar simultáneamente diversas poblaciones celulares a nivel de una sola célula. Debido a los altos costos asociados con la preparación de muestras y la secuenciación de alto rendimiento, es imperativo optimizar las entradas celulares (alta viabilidad y pureza) para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Algunos protocolos de preparación celular se basan en la eliminación de células muer...

El tejido adiposo desempeña un papel clave en el metabolismo energético. El exceso de energía se almacena en forma de lípidos, y el tejido adiposo es capaz de expansión o retracción significativa dependiendo del estado nutricional y la demanda energética. La expansión del tejido adiposo puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de los adipocitos (hipertrofia) y/o de un aumento en el número de adipocitos (hiperplasia); este último proceso estrictamente regulado por la proliferación y diferenciación de las células progenitoras adiposas1,2. Durante la obesidad, el tejido adiposo se expande excesivamente, y la disfunción tisular – incluyendo hipoxia, inflamación y resistencia a la insulina – a menudo desarrolla3,4. Estas complicaciones son factores de riesgo para muchas enfermedades crónicas como hipertensión, diabetes, enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular y cáncer5. Por lo tanto, limitar la expansión incontrolada del tejido adiposo y mitigar las patologías del tejido adiposo son las principales prioridades de investigación biomédica. Durante la expansión del tejido adiposo, las células madre derivadas del tejido adiposo residentes (ASC) proliferan y diferencian secuencialmente en preadipocitos (células progenitoras comprometidas) y luego en adipocitos maduros6. Estudios recientes de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) muestran que estas poblaciones de células progenitoras adiposas (APC) (ASC y preadipocitos) exhiben heterogeneidad molecular y funcional sustancial7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, los ASC muestran una capacidad de diferenciación adipogénica reducida, al tiempo que exhiben mayores capacidades de proliferación y expansión, en comparación con los preadipocitos7. Se notifican nuevas diferencias moleculares en las poblaciones de ASC y preadipocitos, aunque la relevancia funcional de estas diferencias sigue sin estar clara7. Juntos, estos datos resaltan la complejidad del grupo de células progenitoras adiposas y subrayan la necesidad de desarrollar y estandarizar herramientas para comprender y manipular mejor estas poblaciones celulares críticas.
Este protocolo detalla el aislamiento de la alta viabilidad Sca1+ poblaciones de células progenitoras adiposas de almohadillas de grasa epidídmica del ratón que son adecuadas para análisis sensibles aguas abajo, incluyendo estudios unicelulares (secuenciación de SCRNA) y cultivo celular. El aislamiento y la disociación de las almohadillas de grasa epidídmica se realizaron como se describió anteriormente7,13 con ligeras modificaciones que mejoran la viabilidad de los APCs aislados. En resumen, las células disociadas de las almohadillas de grasa epidídmica están manchadas con anticuerpos contra Sca1, un marcador tanto para ASC como para preadipocitos6,7,y otros marcadores de linaje (Lin): Ter119 (células eritroides), CD31 (células endoteliales) y CD45 (leucocitos). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- las células se ordenan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Es importante destacar que este protocolo fue validado por el aislamiento y análisis exitosos de células progenitoras Sca1+/Linviables - adiposas notificadas en un estudio reciente de secuenciación de ARN de una sola célula que identificó subpoblaciones funcionalmente heterogéneas dentro de ASC y preadipocitos7.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultivo de 13 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td>Tubo de</tr><tr><td>ensayo de 5 mL con tapón a presión para filtro de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 y micro; filtro de células m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Sca1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yoduro de propidio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

La obesidad y los trastornos metabólicos como la diabetes, las enfermedades cardíacas y el cáncer están asociados con la remodelación dramática del tejido adiposo. Las células progenitoras adiposas residentes en tejidos (APC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido adiposo y pueden contribuir a la patología tisular. El creciente uso de tecnologías de análisis unicelular ,incluida la secuenciación de ARN unicelular y la proteómica unicelular, está transformando el campo celular madre/progenitor al permitir una resolución sin precedentes de los cambios en la expresión celular individual en el contexto de cambios en toda la población o en todo el tejido. En este artículo, proporcionamos protocolos detallados para diseccionar el tejido adiposo epidídmico del ratón, aislar células derivadas de tejido adiposo único y realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer para Sca1viable +/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. Estos protocolos permitirán a los investigadores preparar APCs de alta calidad adecuados para análisis posteriores, como la secuenciación de ARN de una sola célula.

En este experimento se utilizaron ratones FVB machos de cuatro meses de edad. Después de la exclusión de escombros y dobletes utilizando parcelas FSC/SSC, las células viables (DAPI- población) fueron cerradas, seguidas por la selección de APC+/FITC- población (Figura 1). Las puertas DAPI, APC y FITC se dibujaron sobre la base del control sin manchar. Las estrategias de Gating se muestran en la Figura 1.
<p class="jove_content...

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Este protocolo permite aislar células progenitoras adiposas de alta calidad del tejido adiposo del epidídimo de ratón para un análisis sensible posterior. Esta técnica produce células progenitoras adiposas altamente viables y ha sido validada en un reciente estudio de secuenciación de ARN de una sola célula. Después de sacrificar al ratón macho, localice la almohadilla de grasa del epidídimo y tire de ella suavemente con pinzas romas para deliberarla.Utilice unas tijeras para extraer los testículos e incubar la almohadilla de grasa del epidídimo en cinco mililitros de HBSS suplementado con 3%BSA en un tubo cónico de 50 mililitros durante 15 minutos. Después de la incubación, centrifugar el tubo a 150 x g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Retire la almohadilla de grasa epididimaria flotante del tubo cónico y píquela finamente con unas tijeras limpias.Añadir 200 mililitros de solución de colagenasa al 2% a 3,8 mililitros de HBSS en un tubo de cultivo de 13 mililitros. Luego agregue el tejido picado e incélelo en una incubadora giratoria a cinco RPM durante una hora a 37 grados centígrados. Transfiera todo el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de medio de neutralización.Mezcle suavemente invirtiendo el tubo dos o tres veces. Prepare otro tubo cónico de 50 mililitros equipado con un filtro de células de 70 micrómetros y filtre el tejido digerido en el nuevo tubo. Transfiera el flujo a un tubo de 15 mililitros y centrífugas a 350 x g por 10 minutos a cuatro grados centígrados.Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con cinco mililitros de DPBS. A continuación, centrifuga el tubo durante otros 10 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de citometría de flujo.Mezcle las células pipeteándolas suavemente y manténgalas en hielo. El volumen total de las células en el tampón de citometría de flujo será de aproximadamente 100 microlitros. Después de mezclar las celdas, transfiera 54 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.Agregue seis microlitros de reactivo de bloqueo de FCR y pipetee suavemente para mezclar. A continuación, incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Mantenga las células sobrantes en hielo para usarlas como control sin teñir.Durante la incubación, prepare un cóctel de anticuerpos combinando 11 microlitros de anticuerpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC y anti-CD45-FITC en un tubo de microcentrífuga. Pipetear suavemente la mezcla y mantenerla en hielo protegida de la luz. Después de la incubación con el reactivo bloqueante FCR, agregue 40 microlitros del cóctel de anticuerpos y mezcle bien con un pipeteo suave.Incuba las células a cuatro grados centígrados durante otros 10 minutos. Añada 500 microlitros de tampón de citometría de flujo complementado con un microgramo por mililitro de DAPI en las células de tinción. Mezcle bien y filtre las células con un tubo de ensayo de cinco mililitros con una tapa a presión de colador de celdas.A continuación, mantenga las células en hielo. Agregue 500 microlitros de tampón de citometría de flujo a las células no teñidas y mezcle pipeteando suavemente. Use un tubo de ensayo de cinco mililitros con una tapa a presión de filtro de células para filtrar las células y mantenerlas en hielo.Transporte las células teñidas y el control sin tinción al instrumento de análisis o clasificación FACS. Identificar y aislar a la población APC positiva, FITC-negativa, DAPI-negativa utilizando las estrategias de compuerta descritas en el manuscrito del texto. Utilice los controles sin manchar para ayudar a establecer los parámetros de compuerta.Después de la exclusión de los escombros y dobletes utilizando parcelas FSC-SSC, las células viables se comprimieron seguidas de la selección de la población APC positiva y FITC-negativa. Las compuertas DAPI, APC y FITC se dibujaron en función del control no manchado. Los siguientes resultados muestran el aislamiento de células progenitoras adiposas de ratones FVB machos de cuatro meses de edad.Después de una hora de clasificación, la calidad del aislamiento se evaluó cuantitativamente mediante análisis de citometría de flujo, que demostró que las células mantuvieron una alta viabilidad y pureza. Después de este protocolo, se pueden realizar análisis posteriores sensibles, como la secuenciación de ARN de una sola célula, la PCR cuantitativa en tiempo real y la citometría de flujo. Esto permitirá una mayor caracterización de las células progenitoras adiposas.Las células progenitoras adiposas son poblaciones heterogéneas que requieren más estudios de células individuales. Este método permite aislar las células adecuadas para estudios de una sola célula.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video demuestra una técnica para aislar y cultivar células madre adiposas (ADSC) derivadas de la cresta neural marcadas con fluorescencia a partir de tejido adiposo del arco periaórtico murino. Tras el aislamiento, las NCADSC se detectan, se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia y, posteriormente, se cultivan en una placa, lo que promueve la proliferación celular.

Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo periaórtico murino

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Aprende a aislar células progenitoras adiposas de tejido adiposo epidídimo de ratón mediante FACS con alta viabilidad. Este método validado permite análisis de secuenciación de ARN de célula única.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Explorar más videos