Name: Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende las técnicas de papel secante y maceta enferma para evaluar la resistencia del garbanzo a Rhizoctonia bataticola. Estos ensayos permiten estudiar la interacción planta-patógeno y seleccionar genotipos tolerantes.

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Los proyectos en el laboratorio M.S.K cuentan con el apoyo de la financiación básica del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal. VI reconoce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Agradecemos a las estudiantes en prácticas, a la señorita Rishika, al Sr. Jayachendrayan y a la señorita Durgadevi por la ayuda técnica durante el rodaje de vídeo y al Sr. Sandeep Dixit, a la señorita Anjali y al Dr. Avanish Rai por evaluar críticamente los datos en bruto y los archivos manuscritos. Agradecemos al Sr. Rahim H Tarafdar y al Sr. Sunder Solanki su ayuda en el laboratorio. Reconocemos al Consorcio DBT-eLibrary (DeLCON) y a la Biblioteca NIPGR por proporcionar acceso a los recursos electrónicos y al Fondo de Crecimiento de Plantas NIPGR para el apoyo/espacio para el crecimiento de la planta.

1. Aislamiento de R. bataticola y almacenamiento
<ol><li>Detalles del genotipo de garbanzos y los síntomas de la RR<ol>
<li>Utilice plantas de garbanzos (genotipo, JG 62) que generalmente muestran síntomas típicos de DRR, como raíz primaria seca y quebradiza sin raíces laterales y microesclerotia debajo de la corteza y dentro de la pith1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recogida y lavado<ol>
<li>Desarraiga las plantas que muestran síntomas como raíz primaria foliar de color paja seca y raíz primaria quebradiza con microsclerotia bajo la capa de epidermis. Durante el desarraigo, una parte importante de las raíces permanecerá dentro del suelo ya que las raíces infectadas son frágiles. Retire los restos de tierra gruesos unidos a la raíz. Cortar las raíces por separado y recogerlas en sobres de papel (27,5 cm x 12 cm) con la etiqueta adecuada y colocarlas en una caja de recogida de muestras.</li>
		<li>Después de transportar muestras al laboratorio, coloque las raíces en un vaso de precipitados de 200 ml y cúbralas con malla (malla de nylon con el tamaño de poro de 3 mm de diámetro), y lave bien las raíces con agua corriente del grifo para eliminar las partículas de suelo adherentes.</li>
		<li>Use agua de ósmosis inversa (RO) para enjuagar una vez al final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esterilización superficial<ol>
<li>Romper las raíces en cuatro trozos con 2 cm de longitud cada una con una cuchilla de bisturí y ponerlas en un vaso limpio de 200 ml.</li>
		<li>Montar agua RO autoclavada, 2% NaOCl, tarro de descarte y papel de hinchazón autoclavado (5 cm2) dentro de la cámara de flujo laminar.</li>
		<li>Lavar las raíces con 50 ml de agua RO autoclaveda tres veces y luego con 50 mL de 2% NaOCl durante 10 min. Lavar las raíces con 50 ml de agua RO tres veces más para eliminar el NaOCl.</li>
		<li>Blot secar las raíces colocando las raíces en papel hinchado autoclavado y dejar hasta que las raíces se sequen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medios de comunicación e incubación<ol>
<li>Retire los bordes de las raíces con una hoja de bisturí esterilizada. Divida las raíces con la cuchilla y utilice los fórceps esterilizados para colocarlas en un agar dextrosa de patata (PDA) media petri placa que contiene sulfato de estreptomicina (50 mg L-1) y ampicilina (50 mg L-1).</li>
		<li>Cierre la placa, selle con parafilma e incubar en una incubadora a 28oC durante dos días en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Método de punta hyphal<ol>
<li>Después de dos días de incubación, lleve las placas a la cámara de flujo laminar. Corte la punta del crecimiento hiphal8 bajo un estereomicroscopio (estereomicroscopio educativo Leica EZ4) y transfiéralo a una placa PDA fresca con sulfato de estreptomicina y ampicilina.</li>
		<li>Incubar las placas en la incubadora a 28oC durante diez días en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almacenamiento y mantenimiento del inóculo fúngico R. bataticola<ol>
<li>Haga inclinaciones PDA en tubos de ensayo y transfiera un tapón de agar fúngico desde una placa de cultivo de diez días de edad utilizando el bucle de inoculación esterilizado por llama. Selle la tapa del tubo de ensayo con parafilm.</li>
		<li>Incubar las inclinaciones a 28oC durante diez días en la oscuridad.</li>
		<li>Selle la tapa con parafilm y guárdela a 4oC en el frigorífico para su uso futuro.</li>
		<li>Subcultura cada seis meses para mantener el hongo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenimiento de la virulencia<ol>
<li>Infectar las plantas con puro inóculo fúngico preparado como se menciona en la técnica de la olla enferma3. Aislar el mismo hongo de las plantas infectadas (posttes de Koch)9 y utilizarlo para otros experimentos. NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa aislada de campo del hongo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Técnica de papel de hinchazón
NOTA: La técnica del papel hinchado implica la preparación de inóculo de hongos líquidos, preparación de plántulas y evaluación de enfermedades.
<ol><li>Preparación del líquido R. bataticola inoculum NOTA: El inóculo fúngico líquido R. bataticola contiene micelia y microsclerotia. Ambas estructuras actúan como inóculo primario.<ol>
<li>Preparar 500 ml de medios PDB en un matraz de 1.000 ml y autoclavelo a 121 lb durante 15 min.</li>
		<li>Después de que el medio se enfríe, inocular el caldo con un bucle lleno de tapón de agar fúngico de un cultivo de inclinación fúngica e incubar a 28 oC durante cinco días en una coctelera a 180 rpm en la oscuridad.</li>
		<li>Montar un embudo de vidrio autoclaved o plástico (10 cm), matraz cónico de un litro y dos capas de malla (10 cm2 tamaño) (malla de nylon con el tamaño de los poros de 3 mm de diámetro) en la mesa. Filtra los micelios y microesclerotias fúngicas usando la malla. Seque el hongo en papel hinchado autoclavado.</li>
		<li>Pesar 100 g de micelio para 50% de inóculo y mantener a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la planta de garbanzos<ol>
<li>Seleccione 50 semillas sanas (en este estudio, se utilizó el genotipo JG 62 susceptible de DRR), colóquelas en un vaso de precipitados de 100 ml y cúbralas con una malla.</li>
		<li>Lave primero las semillas con agua del grifo para eliminar los restos del suelo.</li>
		<li>Tome el vaso de precipitados con semillas en la cámara de flujo laminar y lávelas con 50 ml esterilizadas de agua RO tres veces durante 1 min por lavado.</li>
		<li>Esterilice las semillas con 50 ml de 2% de NaOCl acuoso durante 2 min con agitación continua y lave las semillas con 50 ml de agua esterilizada cinco veces durante 1 min cada una.</li>
		<li>Llenar una bolsa de polietileno (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una mezcla de perlita expandida de grado hortícola, musgo de turba irlandesa y vermiculita exfoliada en igual proporción, es decir, 1/3:1/3:1/3), sembrar las 50 semillas esterilizadas en superficie de dos cm de profundidad, y mantener en una cámara/habitación de crecimiento con 28 oC ± temperatura de 2oC, fotoperiodo de 16 h con una intensidad de luz de 150 ma 2 s a1s y humedad relativa del 70%. Regarlos con agua RO y arrancar las plantas ocho días después de la siembra.</li>
		<li>Lave las raíces en el agua del grifo para eliminar las partículas de Soilrite. Enjuague las raíces con agua RO esterilizada y guárdalas en el agua RO en un vaso de precipitados de 1000 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de papel hinchado en bandejas<ol>
<li>Tome un papel hinchado y córtelo en trozos (30 cm × 23 cm) en números suficientes para cumplir con las réplicas.</li>
		<li>Empaque las hojas en una bolsa de polietileno autoclaveable y autoclavelas a 121 libras durante 15 minutos y guárdalas en un horno de aire caliente para secarlo.</li>
		<li>Doble cada hoja de papel hinchada por la mitad.</li>
		<li>Coloque el papel sobre una bandeja de plástico limpia y limpia, como se muestra en la Figura 2i-iv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculación de plantas por inmersión<ol>
<li>Disolver 100 g de inóculo fúngico en agua RO autoclaveada de 200 ml en un vaso de precipitados de 200 ml para obtener un 50% de inóculo.</li>
		<li>Sumerja las raíces de la planta en el inóculo preparado durante 1 min con movimiento intermitente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la fijación uniforme del inóculo fúngico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar las plantas en el papel hinchado<ol>
<li>Humedezca el lado inferior del papel de hinchazón colocado en la bandeja con agua RO estéril. Coloque las plantas en el papel de una manera donde sólo las raíces están cubiertas por el papel, y las tomas se dejan fuera.</li>
		<li>Ciérralo doblando la parte superior del papel hinchado y moje todo el papel para proporcionar suficiente agua para sostener el crecimiento de la planta.</li>
		<li>Regar la bandeja una vez al día y mantener las bandejas a 28 oC. Observe los síntomas como necrosis, pudrición de la raíz y amarilleo de las hojas diariamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Técnica de la olla enferma
NOTA: La técnica de la olla enferma implica la preparación de un inóculo virulento y una maceta enferma, el mantenimiento del nivel de humedad y la evaluación de los síntomas de la enfermedad.
<ol><li>Preparación del sustrato<ol>
<li>Tome un kg de cualquier semilla de garbanzo disponible comercialmente. Retire las semillas infectadas (semillas con crecimiento de hongos, manchas de infección y daños por insectos). Colóquelos en vaso de plástico de 5 L y lávelos con agua del grifo a fondo de 3 a 4 veces para eliminar los desechos principales.</li>
		<li>Lavar las semillas con 2 L de agua RO tres veces y remojar las semillas de 1 kg en un vaso de precipitados de 5 L con tres veces más de agua durante cinco h.</li>
		<li>Una vez que las semillas absorben el agua, vuelva a lavarlas con agua RO tres veces para eliminar los exudados de la semilla.</li>
		<li>Retire el agua por completo y empaque las semillas en botellas de mermelada (300 ml, 12 cm de altura, 6 cm de diámetro y 155 g de peso) a aproximadamente 1/4de capacidad (100 g por botella de mermelada) y cierre las botellas con tapas. Empaque diez botellas de mermelada en una bolsa de plástico autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave dos veces a 121 libras durante 15 minutos continuamente.</li>
		<li>Secar las semillas a 40oC en un horno durante la noche para eliminar las gotas de agua dentro de la botella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la cultura enferma<ol>
<li>Encienda la cámara de flujo laminar de nivel BSL-2. Limpie bien el suelo con 70% de etanol y encienda UV durante 15 minutos. A continuación, mantenga las semillas dentro de la cámara de flujo laminar.</li>
		<li>Tomar 10 días de edad recién aislado cultivo de R. bataticola (parte 1). Luego, tome tres tapones de agar fúngico (4 mm de diámetro) usando una punta de pipeta estéril o un barrenador de corcho, y colóquelos en botellas de mermelada asépticamente. Cubra las botellas con tapas y selle con parafilm.</li>
		<li>Agitar las botellas para mezclar el disco de hongos con las semillas de garbanzo uniformemente.</li>
		<li>Incubar las botellas a 30oC durante 15 días o la oscuridad.</li>
		<li>Tome botellas de mermelada con crecimiento de hongos negros(Figura 4iii)y transfiera el cultivo enfermo (semillas con microsclerotia) de botellas de mermelada a una placa petri de vidrio utilizando fórceps estériles. Secarlos a temperatura ambiente durante dos días en una placa de petri de vidrio.</li>
		<li>Polvo de la masa fúngica utilizando un mortero y pestillo, y almacenar el polvo a 4 oC.</li>
		<li>Autoclave Soilrite dos veces a 121 lbs durante 15 min.</li>
		<li>Seque la mezcla de Soilrite autoclaved bajo una sombrilla.</li>
		<li>Mezclar el polvo de hongos con Soilrite al 50% p/p, llenar las ollas con la mezcla y mantenerlas a temperatura ambiente durante un día.</li>
		<li>Sembrar una semilla de garbanzo susceptible de DRR esterilizada por superficie (macetas redondas de 10 cm)(Tabla de Materiales)y mantener un nivel de humedad del 80% de capacidad de campo (FC).</li>
		<li>Observe los síntomas como necrosis y pudrición de la raíz desarraigando las plantas después de la germinación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluación de la eficiencia de la maceta enferma NOTA: Las plantas muestran síntomas foliares amarillos cuando las raíces están completamente podridas.<ol>
<li>Desarrollar una puntuación de la enfermedad basada en los números de la lesión (manchas necróticas)(Figura suplementaria 2C)y la gravedad de la podredumbre de la raíz. Las macetas enfermas que muestran el 90% de la muerte de las plantas se pueden utilizar más.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examen de genotipos<ol>
<li>Preparar el cultivo enfermo en grandes cantidades y mezclarlo con Soilrite esterilizado o suelo de campo (5% p/p) en macetas de 30 cm de altura. Regar las ollas para humedecer la superficie y dejarlas intactas durante siete días.</li>
		<li>Sembrar una semilla esterilizada en superficie por maceta redonda de 10 cm y tres semillas por macetas redondas de 30 cm y regarlas adecuadamente.</li>
		<li>Observe los síntomas de pudrición foliar amarilla y de la raíz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequía combinada e infección por R. bataticola<ol>
<li>Imponer estrés por sequía siguiendo los protocolos mencionados en Sinha et al. (2019).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar

La técnica del papel hinchado proporciona un enfoque sencillo para examinar los genotipos de garbanzos en condiciones de laboratorio. La inoculación por inmersión permite la investigación de la interacción de forma temporal con un fácil control sobre la carga de inóculo(Figura complementaria 1) y facilita el cribado in vitro. Además, incluso se pueden utilizar plántulas jóvenes. El cultivo de hongos de cinco días de edad (Figura 1B) puede producir suficiente inóculo para inf...

La podredumbre de la raíz seca (DRR) es una de las enfermedades económicamente significativas en el garbanzo1,2. Es una enfermedad específica de la raíz causada por Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrofomina phaseolina). Las plantas infectadas carecen de raíces laterales y poseen raíces quebradizas y follaje amarillo1,3. Se ha informado que el estrés por DRR bajo sequía es una amenaza emergente para el cultivo de garbanzos1,2,3. Además, se ha informado que la incidencia de la RR se ha agravado en condiciones de sequía en condiciones de campo1,2,3. DrR es más frecuente en las zonas de secano que en los campos de regadío4. La utilización de variedades resistentes es la manera de superar la enfermedad y eludir el uso defungicidas 1,13. Debido a que el germoplasma de garbanzos disponible en todo el mundo alberga una variación genética para el rasgo5,el cribado e identificación de genotipos resistentes/susceptibles son críticos para la cría molecular para la mejora de los cultivos.
Los ensayos de enfermedades robustos, fáciles y rentables son esenciales para investigar los patrones de infección por R. bataticola en el garbanzo. El ensayo de enfermedad primaria utilizado para observar la respuesta de los genotipos de garbanzos a la infección por R. bataticola es la técnica de papel hinchado1,4. Es una técnica simple y se puede ejecutar utilizando inóculo de hongos líquidos, plántulas con raíces y papel de hinchazón estéril. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado al máximo porque no hay ningún protocolo paso a paso disponible en la literatura.
Mientras tanto, la técnica de la olla enferma implica la preparación de un posible cultivo enfermo y la imposición de estrés por sequía. Dado que el estrés por sequía agrava la incidencia de la enfermedad de la RR3, es esencial estudiar la interacción planta-patógeno bajo estrés por sequía6,7. La técnica de la olla enferma proporciona la plataforma para un estudio simultáneo, promoviendo mejores posibilidades para el cribado del germoplasma y la comprensión de la base mecanicista de la interacción. Los cambios patomorfológicos, como el aumento de la longitud de la raíz y la reducción del número de raíz lateral, inherentes a la enfermedad de RR, se pueden abordar utilizando la técnica de la maceta enferma1,3,7.
En este documento, se presenta un protocolo detallado para el papel hinchado y las técnicas de maceta enferma, que se puede utilizar para estudiar la interacción entre el garbanzo y R. bataticola y el germoplasma de garbanzos de pantalla. Los detalles de los materiales utilizados en el estudio se indican en la Tabla de materiales.

<table><tbody><tr><td>Hongo- Rhizoctonia bataticola</td><td>Legumbre de inóculo patógeno</td><td>Colección de cultivo de tipo indio n.º 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Mezcla de soilrite</td><td>Medio de suelo en el laboratorio</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, India</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Papel secante para apoyar el crecimiento de las plantas</td><td>Maceta http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 Himedia</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cultivo</td><td>de plantas Macetas de 10 y 30 cm Macetas</td><td>de vivero de uso rutinario, por ejemplo, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Agar/caldo de patata dextrosa</td><td>Cultive y mantenga el hongo</td><td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, EE. UU.</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Cultive el hongo</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubadora y agitador</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Cámara de crecimiento</td><td>Cultivo de plantas en condiciones controladas Modelo</td><td>No. A1000, Conviron, Canadá</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Flujo de aire laminar</td><td>Realización de ejercicios asépticos</td><td>Telstar, Bio II advance, Armario de clase II, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/,</td></tr><tr><td>http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td><td>Malla Filtrado del micelio fúngico</td><td>Mosquitera de nylon</td><td>Malla con un tamaño de poro de 0,6-1 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Medios de autoclave y semillas de garbanzo</td><td>Autoclave</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>Microscopios</td><td>Visualización de la infección y micelio fúngico</td><td>SMZ25 / SMZ18, Microscopios estereoscópicos de investigación, Microscopio estereoscópico</td> <td>educativo Leica EZ4https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Balanza de</td><td>pesaje Pesaje de hongos y productos químicos</td><td>Balanza de pesaje electrónica Sartorius, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Tinción de hongos</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN Azul de anilina</td><td>Tinción de hongos</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

La enfermedad de la putrefacción de la raíz seca (DRR) es una amenaza emergente de estrés biótico para el cultivo de garbanzos en todo el mundo. Es causada por un patógeno fúngico transmitido por el suelo, Rhizoctonia bataticola. En la literatura, los protocolos paso a paso completos y detallados sobre los ensayos de enfermedades son escasos. Este artículo proporciona detalles completos sobre los pasos involucrados en la configuración de una técnica de papel hinchado para la detección rápida de genotipos para la resistencia a la RR. La técnica del papel hinchado es fácil y menos costosa. Otro método, basado en el enfoque de la olla enferma, es una imitación de la infección natural y se puede aplicar para estudiar los componentes que interactúan (planta, patógeno y medio ambiente) involucrados en el triángulo de la enfermedad.
Además, en la naturaleza, la RR se produce principalmente en las zonas de cultivo de garbanzos de secano, donde la humedad del suelo retrocede a medida que avanza el crecimiento de los cultivos. Se sabe que el estrés por sequía predispone a las plantas de garbanzos a la enfermedad de la RR. La comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía puede allanar el camino para la identificación de variedades élite resistentes a la RR desde la reserva de germoplasma de garbanzos. Este artículo proporciona una metodología escalonada para la preparación de una olla enferma y el posterior ensayo de la enfermedad. En general, la información presentada en este documento ayudará a los investigadores a preparar el inóculo fúngico R. bataticola, mantener este patógeno, establecer la técnica de papel de hinchazón, preparar el cultivo enfermo y la olla enferma, y evaluar la infección por patógenos en plantas de garbanzos.

Este estudio tenía como objetivo demostrar técnicas como el papel hinchado y las técnicas de la olla enferma para facilitar la comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía. Para lograr esto, las plantas que presentan síntomas de DRR1,3,4 fueron recogidos de un campo de garbanzos, y el hongo fue aislado utilizando el método de punta hipórica8. <...

Este estudio presenta metodologías para estudiar los mecanismos patomorfoológicos y moleculares subyacentes a la interacción entre garbanzo yrizoctonia bataticola. El método del papel hinchado es útil para estudiar rápidamente las respuestas del genotipo del garbanzo, mientras que el método de la olla enferma se puede utilizar para imponer simultáneamente la sequía y la infección por R. bataticola y la pantalla tolerante a los genotipos.

Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

El objetivo principal de este estudio es demostrar una metodología detallada de los ensayos de la enfermedad de la podredumbre de la raíz seca, como la técnica del papel hinchado y la técnica de la olla enferma. Estas técnicas serán útiles para estudiar la interacción entre la planta de garbanzos y Rhizoctonia bataticola. Comprender la interacción de la planta de garbanzos con el patógeno fúngico Rhizoctonia bataticola es de importancia agrícola.Para ello, se necesitan ensayos versátiles y altamente reproducibles. Aquí, se demuestran dos ensayos que son ampliamente utilizados en nuestro laboratorio. Uno de ellos está hinchado en papel, y el otro es un ensayo basado en la olla enferma.Para ejecutar el ensayo de papel hinchado, prepare Rhizoctonia bataticola honggus inoculum ampliando desde el cultivo inclinado a la placa Petri y luego al cultivo líquido. Preparar el vivero de garbanzos, sembrando semillas en una olla grande. Desarraigalos y colóquelos en el inóculo líquido y colóquelos en papel hinchado.Observe los síntomas de la enfermedad, a saber, necrosis en la raíz, pudrición de la raíz y coloración amarillenta de las hojas ocho días después de la inoculación. Aquí se muestra una pocas palabras, los pasos en la técnica de papel hinchado. Para ejecutar el ensayo de la olla enferma, inocular la comida de garbanzo con hongos.Después de la incubación a 30 grados centígrados durante 15 días, se obtiene cultivo enfermo. Luego, mételos en polvo y mezcle con la mezcla de olla. Sembrar semillas en la olla de control y en la olla enferma.En los días siguientes, observe los síntomas, a saber, necrosis en la raíz, pudrición de la raíz y coloración amarillenta de las hojas en las plantas infectadas, 10 días después de la siembra. La olla enferma se puede ampliar y se puede utilizar para exámenes a gran escala. Aquí se muestra una pocas palabras de pasos en la técnica de la olla enferma.La rizoctonia bataticola es un patógeno en desarrollo. Este hongo produce hifas y microsclerotia, que actúan como inuclo primario durante la infección de la planta. La cultura pura que se aplica a través del método aislado se utiliza para los ensayos.El punto clave para estos ensayos exitosos es la carga óptima de inóculo. La demostración de la técnica del papel hinchado comienza aquí. Para preparar el líquido Rhizoctonia bataticola inoculum, Inocular el caldo de 500 ml con el tapón de agar fúngico de tres días de edad de cultivo de placas frescas e incubar el matraz en una incubadora a 28 grados centígrados durante cinco días.Filtra el micelio fúngico gris oscuro con microsclerotia. Suspenda en agua autoclavada y retire el soporte. Una vez más, filtrar el micelio y eliminar la humedad por la mancha secar el micelio durante unos minutos.Suspenda 100 gramos de inóculo fúngico en 200 ml de agua autoclavada en una botella de mermelada y mezcle correctamente. Desarrollar vivero de garbanzos mediante la siembra de semillas esterilizadas superficiales en solerant. Desarraigue las plantas ocho días después de la siembra, lávelas y enjuáguelas con RO autoclave. Tome un papel hinchado y dóblelo una vez y colóquelo la mitad en la bandeja.Hazlo mojado con agua autoclavada. Tome las plantas y sumérjase en el inóculo durante 30 segundos con un movimiento intermitente hacia arriba y hacia abajo. Colocar las plantas de tal manera que las raíces estén cubiertas dentro de la hoja y folia se mantenga fuera.Dobla la otra mitad y dobla el papel. Para el control, sumergir las plantas en agua autoclavada, mantener las bandejas en una cámara de crecimiento durante ocho días. Resultados. Observe los síntomas tales como coloración amarillenta de la hoja, pudrición de la raíz, necrosis en la raíz, y la reducción en el número de raíz lateral.La demostración de la técnica de la olla enferma comienza aquí. Tome un kilogramo de semillas comerciales de garbanzos. Lave las semillas con agua del grifo y lave de nuevo con el agua RO.Remoje las semillas durante cinco horas. Una vez más, lavar las semillas con agua RO añadir 300 gramos en una botella de mermelada. Autoclave a 121 LVS durante 15 minutos dos veces continuamente.Después de enfriar, transfiera la botella a través del flujo laminar. Inocular las botellas con tres tapones de agar fúngico de aproximadamente cuatro milímetros de tamaño cuadrado y agitar bien para mezclar correctamente. Envuelva las botellas e incubarlas en una incubadora a 30 grados centígrados durante 15 días.Observe las botellas con crecimiento micelial oscuro alrededor de las semillas de garbanzo y retire las semillas. Secarlos a temperatura ambiente y en polvo. Mezclar Rhizoctonia bataticola en polvo con solorita y mantenerlos a temperatura ambiente durante cinco días.La superficie esteriliza las semillas GT62 y las siembra a dos centímetros de profundidad. Resultados. Observar la mortalidad del 90% en la olla enferma. 10 días después de la siembra, observe los síntomas como necrosis en las raíces y reducción del número de raíz lateral y amarillento de las hojas en los días siguientes.La olla enferma también se puede preparar en tierra de campo. Infección por sequía y rizoctonia bataticola. Imponer estrés por sequía en la olla enferma mediante la retención del agua.Aquí se muestran las plantas sometidas a control, sequía, patógenos y sequía simultánea y estrés patógeno. Observe los síntomas, a saber, más necrosis, pudrición de la raíz, y la reducción en el número de raíz lateral, y la longitud de la raíz en el tratamiento de estrés combinado en comparación con el tratamiento solo patógeno. Conclusiones. La técnica del papel de goteo se puede llevar a cabo en condiciones In Vitro.La técnica de la maceta enferma se puede ejecutar en condiciones in Vivo. En el puerto enfermo, el estrés abiótico, a saber, el estrés por sequía, se puede imponer junto con la infección por patógenos. Usando estas técnicas, uno puede estudiar el patrón de infección de patógenos.La mayoría de los cambios fisiológicos ocurren durante la interacción entre garbanzo y rizoctonia bataticola, y también examinan los genotipos de garbanzos para detectar resistencia. El ensayo de papel hinchado es muy útil para generar muestras de calidad para estudios de microscopía y biología molecular. El ensayo de la olla enferma, que imita las condiciones naturales de infección, es aplicable para el cribado del germoplasma de garbanzos.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

La cuantificación del crecimiento de patógenos es una poderosa herramienta para caracterizar diversas respuestas inmunitarias de Arabidopsis thaliana (en adelante: Arabidopsis). El método descrito aquí presenta un ensayo optimizado de infiltración de jeringas para cuantificar la Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 crecimiento en hojas adultas de Arabidopsis.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

El sistema de cocultivo hidropónico descrito soporta plantas intactas con mallas de malla metálica y las convierte en cocultivas con bacterias. El tejido de las plantas, las bacterias y las moléculas secretadas pueden ser recogidas separadamente para análisis de aguas abajo, permitiendo simultáneamente que se investiguen las respuestas moleculares tanto de los huéspedes de la planta como de los microbios o microbios que interactúan.

Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

Presentado es un protocolo para un análisis de la competencia de placa determinar si un compuesto específico es probable que contenga bacterias y hongos que inhiben el crecimiento de Rhizoctonia solani.

Un análisis de la competencia la placa como una evaluación preliminar rápida de supresión de la enfermedad

El manejo del marchitamiento por Fusarium de la sandía requiere el conocimiento de las razas de patógenos presentes. Aquí, describimos los métodos de inoculación de inmersión de raíz, semilla de grano infestado y inoculación de inmersión en bandeja modificados para demostrar su eficacia en la tipificación racial del hongo patógeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Un contraste de tres técnicas de inoculación utilizadas para determinar la raza de Fusarium oxysporum f.sp. desconocido niveum Aislantes

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

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Un protocolo simple para mapear los rasgos de arquitectura del sistema radicular de la planta

Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.

Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Aquí, describimos una herramienta avanzada diseñada para el monitoreo de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de plántulas de Arabidopsis . La novedosa metodología proporciona imágenes no invasivas de fluorescencia de clorofila en tiempo real a alta resolución espacial y temporal.

Ensayo no invasivo para la determinación cinética de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis

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Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Aprende las técnicas de papel secante y maceta enferma para evaluar la resistencia del garbanzo a Rhizoctonia bataticola. Estos ensayos permiten estudiar la interacción planta-patógeno y seleccionar genotipos tolerantes.

Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

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