Name: Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a preparar cortes agudos de hipocampo-entorrinal en ratón para estudiar oscilaciones espontáneas de red mediante electrofisiología. Este método permite registrar potenciales de campo local y analizar la dinámica neuronal.

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El autor quiere agradecer a Steve Siegelbaum por su apoyo. La financiación es proporcionada por 5R01NS106983-02, así como 1 F31 NS113466-01.

El autor no tiene nada que revelar.

Hay varios pasos en este protocolo de corte diseñado para promover la salud de los tejidos y favorecer la aparición de la actividad espontánea de la red naturalista: el ratón se perfunde transcardialmente con solución de corte de sacarosa refrigerada; las rodajas de corteza horizontal-entorrinaal (HEC) se cortan a un espesor de 450 μm del hipocampo intermedio o ventral; las rodajas se recuperan en la interfaz de acsf calentado y aire humidificado, rico en carbohidratos; durante las grabaciones, las rodajas se sobrefunden...

La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.
La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelular1,2,3,4,5. Los métodos de corte cerebral se han aprovechado para obtener información sobre los mecanismos celulares y de circuito subyacentes a estas oscilaciones de la red neuronal. El trabajo fundacional de Maier et al. demostró que los complejos afilados de onda-ondulación (SWR) pueden emerger espontáneamente en rodajas del hipocampo ventral6,7. Estudios posteriores de múltiples investigadores han aclarado gradualmente muchos aspectos de los SWR, incluyendo el papel de los neuromoduladores en la regulación del estado de red del hipocampo8,9,10 y los mecanismos sinápticos que impulsan la reactivación in vitro de conjuntos neuronales previamente activos durante el comportamiento in vivo11. Los experimentos de corte cerebral también han proporcionado información sobre la oscilación del rango gamma (30-100 Hz), un estado de red hipocampal distinto que se cree que admite la codificación de memoria y la recuperación12,13. Por último, reconociendo el papel central del hipocampo y las estructuras asociadas en la fisiopatología de la epilepsia del lóbulo temporal14,15,los investigadores han utilizado preparaciones de rebanadas de hipocampo para investigar la generación y propagación de la actividad epileptiforme. Carter y otros demostraron que las rodajas combinadas de corteza hipocampal-entorrinal preparadas a partir de animales crónicamente epilépticos pueden generar espontáneamente descargas epileptiformes in vitro16. Posteriormente, Karlócai et al. exploró los mecanismos subyacentes a las descargas epileptiformes en rodajas de hipocampo mediante el uso de líquido cefalorraquídeo artificial modificado (ACSF) con concentraciones de iones alteradas (mg2+ reducido o K+elevado) o medicamentos añadidos (4AP o gabazina)17.
Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques de rebanadas de hipocampo que difieren de maneras clave: (1) la región del hipocampo contenida en la rebanada (dorsal, intermedia o ventral); 2) la presencia o ausencia de tejidos extrahippocampales como la corteza entorrina; (3) la orientación utilizada para cortar rodajas (coronales, sagitales, horizontales u oblicuas); y (4) las condiciones en las que se mantiene el tejido después del corte (sumergido completamente en ACSF o mantenido en la interfaz de ACSF y aire humidificado y rico en carbohidratos).
La elección de qué enfoque de corte debe determinarse mediante el objetivo experimental. Por ejemplo, las rodajas transversales o coronales del hipocampo dorsal mantenido en condiciones sumergidas se han utilizado muy eficazmente para la investigación de circuitos intrahippocampales y plasticidad sináptica18,19,20. Sin embargo, tales preparaciones no generan espontáneamente oscilaciones de red tan fácilmente como las rebanadas del hipocampo ventral21,22,23. Aunque un estado de actividad persistente de SWR puede ser inducido por estimulación tetánica en rodajas transversales del hipocampo dorsal y ventral24,los SWR espontáneos se observan más fácilmente en las rodajas ventrales7,25.
Una distinción fisiológica y anatómica inherente entre el hipocampo dorsal y ventral está respaldada por estudios realizados tanto in vivo como in vitro26. Las grabaciones en ratas revelaron ritmos theta fuertemente coherentes a lo largo del hipocampo dorsal e intermedio, pero mala coherencia entre la región ventral y el resto del hipocampo27. Los SWR in vivo se propagan fácilmente entre el hipocampo dorsal e intermedio, mientras que los SWR que se originan en el hipocampo ventral a menudo permanecen locales28. Las proyecciones asociacionales originadas a partir de neuronas piramidales CA3 que residen en el hipocampo dorsal e intermedio proyectan largas distancias a lo largo del eje longitudinal del hipocampo. Las proyecciones ca3 procedentes de regiones ventrales siguen siendo relativamente locales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de ser cortadas durante el proceso de corte29,30. Por lo tanto, las rodajas ventrales pueden conservar mejor la red recurrente necesaria para generar sincronia de población. La propensión de las rodajas ventrales a generar actividades espontáneas de red in vitro también puede reflejar una mayor excitabilidad intrínseco de las neuronas piramidales o una inhibición GABAérgica más débil en el hipocampo ventral en comparación con las regiones más dorsales31. De hecho, las rodajas de hipocampo ventral son más susceptibles a la actividad epileptiforme32,33. Así, muchos estudios de oscilaciones fisiológicas espontáneas de red8,9,11,24 o patológicas16,34,35,36 han utilizado tradicionalmente un enfoque de corte horizontal, a veces con un ligero ángulo en la dirección fronto-occipital, que produce rodajas de tejido paralelas al plano transversal del hipocampo ventral.
La conectividad de red se ve inevitablemente afectada por el procedimiento de corte, ya que muchas celdas del sector se cortarán. El ángulo y el grosor de la rebanada y el tejido retenido en la preparación deben considerarse para optimizar la conectividad en los circuitos de interés. Muchos estudios han utilizado rodajas horizontales combinadas de corteza hipocampal-entorrinales (HEC) para explorar interacciones entre las dos estructuras en el contexto de oscilaciones fisiológicas o patológicas de la red. Roth et al. realizaron grabaciones duales desde el subcampo CA1 del hipocampo y la capa V de la corteza entorrinal medial para demostrar la propagación de la actividad SWR a través de la rebanadaHEC 37. Muchos estudios de actividad epileptiforme han utilizado la preparación de la rebanada HEC para investigar cómo se propagan las descargas epileptiformes a través de la red corticohippocampal16,35,36,38. Es importante tener en cuenta que la preservación del bucle corticohippocampal intacto no es un requisito previo para los SWR espontáneos, descargas epileptiformes o oscilaciones gamma; las oscilaciones de red se pueden generar en rodajas transversales del hipocampo dorsal o ventral sin tejidos parahippocampales unidos21,22,23, 25,39,40,41. Un factor más importante para la generación espontánea de oscilaciones de red en rodajas de hipocampo puede ser el grosor de cada rebanada, ya que una rebanada más gruesa (400-550 μm) preservará más conectividad en la red recurrente CA2/CA321,22,25.
Aunque se han utilizado rodajas HEC horizontales en ángulo (cortadas con un ángulo aproximado de 12° en la dirección fronto-occipital) para estudiar la conectividad funcional del bucle corticohippocampal11,16,34,35,42,tales preparaciones en ángulo no son necesarias para la actividad espontánea de la red43,44,45. Sin embargo, el uso de un plano de corte en ángulo permite al investigador hacer selectivamente rodajas que conserven mejor las lamellas orientadas transversalmente del hipocampo ventral o intermedio, dependiendo de si se aplica un ángulo hacia abajo o hacia arriba(Figura 1). Este enfoque es conceptualmente similar al utilizado por Papatheodoropoulos et al., 2002, que diseccionó cada hipocampo libre y luego utilizó un helicóptero de tejido para crear rodajas transversales a lo largo de todo el eje dorsal-ventral21. A la luz de las distinciones funcionales antes mencionadas entre el hipocampo ventral y dorsal-intermedio, los investigadores deben considerar el origen anatómico de las rodajas al diseñar experimentos o interpretar resultados. El uso de una rampa de agar durante el procedimiento de corte es una manera sencilla de producir preferentemente rodajas del hipocampo intermedio o ventral.
Las rodajas de hipocampo se pueden mantener en una cámara sumergida (con el tejido completamente sumergido en ACSF), o una cámara de estilo interfaz (por ejemplo, cámara Oslo o Haas, con rodajas cubiertas sólo por una fina película de medios que fluyen). El mantenimiento de la interfaz mejora la oxigenación del tejido, que promueve la supervivencia neuronal y permite niveles altos sostenidos de actividad interneuronal. Tradicionalmente, las condiciones de registro sumergidas utilizan un caudal de ACSF más lento que no proporciona una oxigenación adecuada del tejido para una expresión estable de las oscilaciones a nivel de red. En las rodajas de hipocampo sumergido oscilaciones gamma inducidas por carbachol sólo se observan transitoriamente46,47, mientras que se pueden mantener establemente en las cámaras de grabación de interfaz10,48,49. Como tal, muchos estudios de actividad espontánea compleja in vitro se han basado en cámaras de registro de interfaz para investigar complejos de ondulación de ondulación aguda6,7,8,9,10,25,37,oscilaciones gamma10,13,y actividad epileptiforme16,38,45,47.
En una cámara de grabación de estilo sumergido, se puede utilizar un objetivo de microscopio de inmersión para visualizar células individuales y dirigirse selectivamente a células de aspecto saludable para grabaciones. La preparación sumergida también permite un control fino sobre el entorno celular, ya que la inmersión facilita la rápida difusión de fármacos u otros compuestos al tejido. Por lo tanto, una metodología modificada en la que se mantienen oscilaciones estables de la red en condiciones sumergidas representa un enfoque experimental potente. Este enfoque se ejemplifica con el trabajo de Hájos et al., en el que las rodajas de hipocampo se recuperan en una cámara de sujeción simplificada de estilo interfaz durante varias horas antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida modificada con un alto caudal de ACSF (~6 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno al tejido12,48,49. En estas condiciones, se pueden mantener altos niveles de actividad interneuron y oscilaciones espontáneas estables de la red en una cámara de grabación sumergida. Este enfoque modificado permite a los investigadores realizar grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras guiadas visualmente y caracterizar la contribución de los tipos celulares identificados morfológicamente a las oscilaciones gamma inducidas por carbachol12. Los SWR también pueden ocurrir espontáneamente en rodajas de hipocampo sumergidas con un caudal rápido de ACSF11,48,49. Maier et al. demostraron que las rodajas de hipocampo que se recuperaban en una cámara de interfaz antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida mostraban de forma fiable swrs espontáneos, mientras que las rodajas que se recuperaban sumergidas en un vaso de precipitados antes de ser transferidas a una cámara de grabación sumergida mostraban respuestas de campo evocadas más pequeñas, niveles más bajos de corrientes sinápticas espontáneas, y sólo muy rara vez mostraban SWR espontáneos43. Schlingloff et al. utilizaron esta metodología mejorada para demostrar el papel de las células de cesta que expresan parvalbumina en la generación de SWRespontáneos 44.
El siguiente protocolo presenta un método de corte a través del cual las neuronas espontáneamente activas en rodajas de hipocampo horizontal pueden recuperarse en condiciones de interfaz y posteriormente mantenerse en una cámara de grabación sumergida adecuada para manipulaciones farmacológicas u optogenéticas y grabaciones guiadas visualmente.

<table><tbody><tr><td>Impresora 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de incubación de cortes de cerebro agudos</td><td>NIH 3D Print Exchange</td><td>3DPX-001623</td><td>Diseñado por ChiaMing Lee, disponible en https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sal de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl pellets molidos</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Becton, Dickinson</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Alfa Aesar</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>vaso de precipitados (250 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>vaso de precipitados (400 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>batidora</td><td>Oster</td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn,</td><td>becton pequeño, capilares de vidrio de</td> borosilicato Dickinson <td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>con filamento (Diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interno 0,86 mm, longitud 10 cm)</td>Son <td>preferibles los capilares pulidos al fuego</td> de <td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td>.</tr><tr><td>solución de cloruro de calcio (1 M)</td><td>Cámara G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>gas carbógeno comprimido (95% oxígeno / 5% dióxido de carbono)</td><td>Airgas</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>oxígeno comprimido</td><td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>estimulador aislado de voltaje constante</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>Cubreobjetos DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>(22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>adhesivo de cianoacrilato</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td><td>Lo ideal es utilizar la forma con pincel para la adquisición de datos de precisión</td></tr><tr><td>software</td><td>Axograph N</td><td>/A</td><td>Cualquier software equivalente (por ejemplo, pClamp) funcionaría.</td></tr><tr><td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop Dell</td><td></td><td>N/A</td> El <td>número de catálogo dependerá de la computadora específica: cualquier computadora funcionará siempre que pueda ejecutar software de adquisición de electrofisiología.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>temporizador digital</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4 canales Temporizador trazable</td></tr><tr><td>almohadillas absorbentes desechables</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de disector</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>cuchillas de afeitar de doble filo</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>dual automatic controlador de temperatura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>cámara de grabación optimizada de doble superficie o flujo laminar</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>La cámara presentada en este protocolo está hecha a medida. Un equivalente comercial sería el RC-27L de Warner Instruments.</td></tr><tr><td>bastidor para equipos</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70"</td><td>Un bastidor no es estrictamente necesario, pero es útil para organizar la electrofisiología</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiéter)- N,N,N',N'-ácido teetraacético (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>escala fina</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204DR</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas Flaming/Marrón</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de vidrio (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5&prime;-trifosfato sodio sal hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>cubos de hielo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>vaporizador de isoflurano</td><td>Servicios anestésicos generales</td> Cinta de laboratorio <td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>papel para lentes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>fuente de luz</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>solución de cloruro de magnesio (1 M)</td><td>Calidad Biológico</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>magnético barras de agitación</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-56</td><td>El número de catálogo dependerá del tamaño de la barra de agitación.</td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Luigs & Micromanipulador Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>(manual)Microscopio</td><td></td> <td>Scientifica LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula</td><td></td> Olympus BX51WI <td></td> Monitor Fine Science Tools 10089-11 <td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> MultiClamp 700B Amplificador de microelectrodos Molecular Devices MULTICLAMP 700B <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>La MultiClamp 700B debe incluir cabeceras, soportes para pipetas y un modelo de celda.</td></tr><tr><td>N-(2-hidroxietil)piperazina-N&prime;-(ácido 2-etanosulfónico), (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>aguja (calibre 20, 1,5 pulgadas de longitud)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>filamento de nylon</td><td>YLI Wonder Invisible Thread</td><td>212-15-004</td><td>tamaño 0,004. Este gato. # es de Amazon.com</td></tr><tr><td>malla de nylon</td><td>Warner Instruments Corporation</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>bomba perstáltica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>Sal de fosfocreatina di(tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>Soportes para pipetas</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr> alambre de <tr><td>platino</td><td>World Precision</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>filamento de ácido poliláctico (PLA)</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>gluconato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>hojas de afeitar VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>pinza de rodillo</td><td>World Precision Instruments</td><td>escala 14041</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>arpa de rodajas</td><td>Warner</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sodio monobásico anhidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>espátula</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>espátula/cuchara, grande</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>hojas de bisturí estériles</td><td>Feather</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>agitador / placa calefactora</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>válvulas llave de paso, 1 vía</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>válvulas llave de paso, 3 vías</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Acros Organics</td><td>AC177142500</td><td></td></tr><tr><td>soporte para abrazaderas giratorias Tijeras quirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>, afiladas/desafiladas</td><td>Fine Science Tools</td><td>Jeringa 14001-12</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td>Jeringa de <td>309659</td><td></td> <td>Becton, Dickinson</td></tr><tr><td>(60 mL con punta Luer-Lok)</td>Pinza de tres puntas <td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>pinza de tres puntas</td><td>Pinza de tejido Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>, grande</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>pinza de tejido, pequeña</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>tubo</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 pulgada, OD 3/16 pulgada</td></tr><tr><td></td><td>tubo Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 pulgada, OD 1/4 pulgada</td></tr><tr><td>grasa de vacío</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de cuchilla vibratoria</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>mesa de amortiguación de vibraciones con jaula de Faraday</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>matraz aforado (1 L)</td><td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>matraz aforado (2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua caliente</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

El corte cerebral agudo de roedores ofrece un enfoque experimental tractable para obtener información sobre la organización y función de los circuitos neuronales con resolución unicelular mediante electrofisiología, microscopía y farmacología. Sin embargo, una consideración importante en el diseño de experimentos in vitro es hasta qué punto diferentes preparaciones de rebanadas recapitulan patrones naturalistas de actividad neuronal como se observa in vivo. En el cerebro intacto, la red de hipocampos genera una actividad poblacional altamente sincronizada que refleja el estado conductual del animal, como lo ejemplifican los complejos de ondulación de onda aguda (SWR) que se producen durante la vigilia de los estados consumados o el sueño no REM. Los SWR y otras formas de actividad de la red pueden surgir espontáneamente en rodajas de hipocampo aisladas en condiciones apropiadas. Con el fin de aplicar el potente kit de herramientas de corte cerebral a la investigación de la actividad de la red de hipocampo, es necesario utilizar un enfoque que optimice la salud de los tejidos y la preservación de la conectividad funcional dentro de la red del hipocampo. Los ratones se fusionan transcardialmente con líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa fría. Las rodajas horizontales que contienen el hipocampo se cortan a un espesor de 450 μm para preservar la conectividad sináptica. Los sectores se recuperan en una cámara de estilo interfaz y se transfieren a una cámara sumergida para grabaciones. La cámara de grabación está diseñada para la superfusión de doble superficie de líquido cefalorraquídeo artificial a un alto caudal para mejorar la oxigenación de la rebanada. Este protocolo produce tejido sano adecuado para la investigación de la actividad compleja y espontánea de la red in vitro.

Aquí se presentan grabaciones representativas de sectores HEC preparados como se describe en este protocolo. Después de la recuperación en una cámara de retención de interfaz (Figura 1C), los sectores se transfieren individualmente a una cámara de grabación sumergida (Figura 2B). La cámara de grabación se suministra con ACSF saturado de carbógeno utilizando una bomba peristáltica(Figura 2A). La bomba primero extrae ACSF de un vaso d...

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Con este protocolo, los investigadores pueden investigar los mecanismos subyacentes a las oscilaciones de la red del hipocampo en preparaciones agudas de cortes de cerebro de ratón. En esta preparación, los registros se realizan en condiciones sumergidas en cortes generando oscilaciones espontáneas de la red, lo que permite realizar técnicas farmacológicas y optogenéticas, y visualizar registros de una sola célula. Para la perfusión transcárdica, inmediatamente antes de retirar el ratón de la cámara de isoflurano, llene la tapa de una placa de Petri con tres a cinco milímetros de solución de sacarosa enfriada y llene el fondo de la placa de Petri con aproximadamente un centímetro de solución de sacarosa enfriada.Transfiera rápidamente el ratón anestesiado a la almohadilla absorbente izquierda y use tres piezas de cinta adhesiva para asegurar las extremidades delanteras y la cola. Con unas pinzas de tejido grandes y unas tijeras quirúrgicas, cubra la piel y haga una incisión longitudinal desde la parte inferior del esternón hasta la parte superior del pecho. Use las pinzas para tirar hacia arriba del esternón y use las tijeras para cortar el diafragma.Use las tijeras para cortar la

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo se describen los procedimientos para la preparación de rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas del cerebro asociadas con el envejecimiento y relacionadas con la edad las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

Este video muestra un protocolo detallado para preparar cortes horizontales de cerebro del hipocampo de ratones, centrándose en preservar la integridad de las vías de las fibras del hipocampo. El proceso consiste en dividir y asegurar cuidadosamente el cerebro, utilizando un vibratomo para cortar y mantener las condiciones óptimas del tejido con un líquido carbogenado, lo que da como resultado cortes de cerebro del hipocampo listos para una mayor experimentación.

Obtención de cortes horizontales de cerebro de hipocampo de ratón

El video muestra un procedimiento para registrar el potencial de campo local (LFP) en cortes de corteza hipocampal-entorrinal de ratón. La estimulación eléctrica se proporciona en el estrato radial CA3 del hipocampo, lo que provoca cambios en el potencial postsináptico en el estrato piramidal CA1. Se registra el cambio combinado en el potencial de membrana de las neuronas CA1, denominado potencial de campo local.

Registro del potencial de campo local en cortes de corteza hipocampal-entorrinal de ratón

Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Aprende a preparar cortes agudos de hipocampo-entorrinal en ratón para estudiar oscilaciones espontáneas de red mediante electrofisiología. Este método permite registrar potenciales de campo local y analizar la dinámica neuronal.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

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