Name: Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a evaluar la transformación oncogénica en células epiteliales mamarias humanas mediante ensayos de proliferación, crecimiento independiente de anclaje y cultivo 3D. Esta técnica permite estudiar el comportamiento celular in vitro.

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El laboratorio AG está financiado por el Consejo Español de Seguridad Nuclear. T.A. y A.G. son miembros de un grupo de investigación reconocido por la Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT tiene un contrato financiado por la Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer. El contrato de G.F. es financiado por una subvención de cellex Foundation.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos experimentales descritos en este documento proporcionan herramientas útiles para evaluar la transformación oncogénica de las células cultivadas in vitro. Cada técnica evalúa aspectos específicos del proceso de transformación y, por lo tanto, se debe prestar especial atención al extraer conclusiones de un solo análisis. La acumulación de curvas de crecimiento es un enfoque que exige información ya disponible al cultivar células para otros fines. Esto hace que esta técnica sea más barata y fácil de aplicar e...

Se requieren varios eventos sucesivos para el desarrollo de neoplasias. En 2011, Hanahan y Weinberg describieron 10 capacidades que permiten transformar el crecimiento, la supervivencia y la difusión de las células: las llamadas "Marcas del Cáncer"1. La metodología descrita aquí compila tres herramientas diferentes para evaluar la transformación celular in vitro centrándose en algunas de las características distintivas de las células tumorales. Estas técnicas evalúan la tasa de proliferación celular, el comportamiento de las células cuando se cultivan en 3D y su capacidad para formar colonias con independencia de anclaje.
Los modelos celulares son cruciales para probar la hipótesis in vitro. Se han desarrollado diferentes enfoques para generar modelos experimentales de transformación celular para el estudio del cáncer2,3,4. Dado que el cáncer de mama es el cáncer más común entre las mujeres en todo el mundo y es responsable de aproximadamente el 15% de las muertes por cáncer entre las mujeres5,proporcionar modelos celulares adecuados de células epiteliales mamarias es de suma importancia para la investigación posterior. En este artículo, hemos ilustrado el potencial de tres técnicas para evaluar la transformación celular utilizando un modelo experimental de transformación de células epiteliales primarias de senos (BPEC) descrita inicialmente por Ince y sus colegas en 20076 y posteriormente implementada en nuestro laboratorio7. Este modelo experimental se basa en la alteración secuencial de tres genes dirigidos (SV40 Grandes T y antígenos t pequeños aquí conocidos como Ttag, hTERTy HRAS)al genoma de BPEC no transformados. Además, el método utilizado para la derivación de BPEC favorece el mantenimiento de células epiteliales mamarias con marcadores luminales o mioepteliales, dando como resultado un cultivo celular heterogéneo que conserva algunos de los rasgos fisiológicos de la glándula mamaria.
En la glándula mamaria, las células epiteliales mamarias luminales, que son responsables de la producción de leche, se encuentran cerca del lumen, mientras que las células mioepteliales se eliminan alrededor de las células luminales y se encargan de los movimientos de contracción que conducen la leche al pezón. La pérdida de una organización adecuada entre estos linajes celulares es una característica de la transformación tumoral8 que se puede evaluar in vitro después de la detección inmunofluorescente de marcadores de linaje distintivos en cultivos celulares 3D. Otra característica importante de las células tumorales es su capacidad para crecer sin un apego a otras células y a la matriz extracelular1. Cuando las células sanas se ven obligadas a crecer en suspensión, se activan mecanismos como los anoikis u2012 un tipo de muerte celular inducida en respuesta al desprendimiento de la matriz extracelular de la matriz extracelular9. La evasión de la muerte celular es una de las señas de identidad distintivas del cáncer y, por lo tanto, las células transformadas son capaces de inactivar los anoikis y sobrevivir de una manera independiente del ancla. Esta capacidad se puede evaluar in vitro con el ensayo independiente del anclaje utilizando agar blando. Además, una característica inherente de los tejidos tumorales es su capacidad de señalización proliferativa sostenida, que puede controlarse fácilmente en condiciones in vitro midiendo el aumento del número de células a lo largo del tiempo, no sólo en los ensayos de suspensión, sino también mediante el seguimiento de la tasa de crecimiento de los cultivos monocapa adherentes.
A pesar del mejor modelo para probar el potencial tumorigénico es la inoculación de células tumorales en modelos murinos y la evaluación del desarrollo tumoral in situ, es importante minimizar el número de animales empleados en procedimientos experimentales tanto como sea posible. Por lo tanto, tener pruebas adecuadas para evaluar la transformación in vitro es una prioridad. Aquí, proporcionamos un conjunto de herramientas para evaluar el potencial tumorigénico de las células epiteliales mamarias parcialmente y totalmente transformadas que se pueden implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios que trabajan con modelos de transformación celular.

<table><tbody><tr><td>1 ml Pipetas serológicas</td><td>Labclinics PLC91001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfs Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>Dark se prefieren las eppendorfs para el almacenamiento a largo plazo de MTT</td></tr><tr><td>10 &mu; l Puntas de pipeta sin filtro</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr>Frasco <td></td><td></td><td>de vidrio de 100 ml</td><td>Con tapón, esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>1000 &mu; l Puntas de pipeta con filtro</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; l Puntas de pipeta sin filtro</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos cónicos</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipetas serológicas</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Puntas de pipeta con filtro</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipetas serológicas</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>Se utiliza para la fijación de estructuras 3D antes del marcaje inmunofluorescente</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Se utiliza para el ensayo de anclaje</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Claudina 4</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID:AB_301650</td><td>Dilución de trabajo 1:100, huésped: conejo</td></tr><tr><td>Anti-Citoqueratina 14 [RCK107] anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID:AB_307087</td><td>Dilución de trabajo 1:100, huésped: ratón</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón Cyanine Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Dilución de trabajo 1:500, huésped: cabra</td></tr><tr><td>Anti-conejo Alexa Fluor 488 anticuerpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Dilución de trabajo 1:500, huésped: cabra</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular de 24 pocillos Plate</td><td>Labclinics PLC30024</td><td></td><td>Se utiliza para cultivos 3D en Matrigel. Cultivo celular de fondo plano</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos Labclinics</td><td></td><td>PLC30006</td><td>utilizado para el ensayo de anclaje</td></tr><tr><td>Incubadora de células (37 &ordm; C y 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coladores de celdas</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>11587522 Tamaño de malla: 40 &mu; m</td></tr><tr><td>Software CellSense</td><td>Olympus</td><td></td><td>Se utiliza para la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera de Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Se utiliza para complementar el medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Clase II Cabina de seguridad biológica</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, espesor 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-amindiofenil)-1H -indol-6-carboxamidina</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>Se utiliza para inactivar la acción de la tripsina</td></tr><tr><td>Software de Fiji (ImageJ)</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Descarga gratuita, no se necesita licencia</td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td></td>de <td>vidrio Pasteur</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>Se utiliza para la inmunofluorescencia de estructuras 3D</td></tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td> resistentes al calor <td>Se utiliza para la manipulación de agar después del autoclave</td></tr><tr><td>Baño calefactor (37 &ordm; C)</td><td></td><td></td> <td>Se utiliza para templar soluciones antes del subcultivo celular</td></tr><tr><td>Baño calefactor (42 &ordm; C)</td><td></td><td></td> <td>Se utiliza para mantener el agar caliente</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> calefactora <td>Se utiliza para la deshidratación de Matrigel</td></tr><tr><td>Cámara húmeda</td><td></td><td></td><td>Se utiliza para la incubación de anticuerpos durante la inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la manipulación de Matrigel</td></tr> Microscopio óptico invertido <tr><td>de caja</td><td></td><td></td><td></td>de hielo</tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson 354234</td><td></td><td>Tienda en -20 &ordm; C y manténgalo frío cuando esté en uso. Denominado matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>Se utiliza para la fijación de estructuras 3D antes del marcaje inmunofluorescente</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 y p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Se utiliza para calcular la duplicación de la población y para obtener la ecuación de tasa de crecimiento</td></tr><tr><td>MilliQ agua</td><td></td><td></td><td>Conocido como agua ultrapura</td></tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> de uñas <td>Se utiliza para sellar muestras después del montaje</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Se utiliza para cubrir la solución de anticuerpos durante la incubación</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (sin calcio y magnesio)</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Estéril. Se utiliza para el subcultivo</td></tr><tr><td>celular de tabletas de PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Diluido en agua miliQ. No requiere esterilidad. Se utiliza para la inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Pipetea Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 Frascos</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>Se utiliza para el cultivo de BPEC</td></tr><tr><td>Scepter Contador de células automatizado</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternativamente, utilice un hemocitómetro</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Se utiliza para cortar puntas</td>de <td></td><td></td> pipeta y parafilm</tr><tr><td>Filtros estériles 0,22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Se utiliza para filtrar la solución de MTT</td></tr><tr><td>Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>Almacene en -20 &ordm; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Utilizado para la inmunofluorescencia de estructuras 3D</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 10X</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>Diluido en PBS para obtener una solución 3X</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC Medio</td> de <td>cultivo Stemgent</td><td>00-0051</td><td>Utilizado para el cultivo primario de BPEC</td></tr><tr><td>WIT-T Medio de</td><td>cultivo Stemgent</td><td>00-0047</td><td>Utilizado para la transformación del cultivo BPEC</td></tr></tbody></table>

evaluación in vitro de la transformación oncogénica en células epiteliales mamarias humanas

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

La tumorigenesis es un proceso de varios pasos en el que las células adquieren capacidades que permiten su crecimiento, supervivencia y diseminación en condiciones hostiles. Diferentes pruebas buscan identificar y cuantificar estas señas de identidad de las células cancerosas; sin embargo, a menudo se centran en un solo aspecto de la transformación celular y, de hecho, se requieren múltiples pruebas para su caracterización adecuada. El propósito de este trabajo es proporcionar a los investigadores un conjunto de herramientas para evaluar la transformación celular in vitro desde una perspectiva amplia, lo que permite sacar conclusiones sólidas.
Una activación de señalización proliferativa sostenida es la característica principal de los tejidos tumorales y puede ser fácilmente monitoreada en condiciones in vitro calculando el número de duplicaciones de población logradas con el tiempo. Además, el crecimiento de las células en cultivos 3D permite su interacción con las células circundantes, que se asemeja a lo que ocurre in vivo. Esto permite la evaluación de la agregación celular y, junto con el etiquetado inmunofluorescente de marcadores celulares distintivos, obtener información sobre otra característica relevante de la transformación tumoral: la pérdida de una organización adecuada. Otra característica notable de las células transformadas es su capacidad para crecer sin un apego a otras células y a la matriz extracelular, que se puede evaluar con el ensayo de anclaje.
Se proporcionan procedimientos experimentales detallados para evaluar la tasa de crecimiento celular, realizar el etiquetado inmunofluorescente de marcadores de linaje celular en cultivos 3D y para probar el crecimiento celular independiente del anclaje en el agar blando. Estas metodologías están optimizadas para las células epiteliales primarias de mama (BPEC) debido a su relevancia en el cáncer de mama; sin embargo, los procedimientos se pueden aplicar a otros tipos de celda después de algunos ajustes.

Se eligió un modelo experimental de transformación celular con la introducción de tres elementos genéticos en BPEC para generar resultados representativos de la transformación oncogénica6,7 (Figura 3). Los BCE no transformados (N) se derivaron del tejido mamario libre de enfermedades descrito por Ince y sus colegas6 y se cultivaron siguiendo el protocolo indicado aquí. Después de supe...

Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Esta metodología utiliza la integración de diferentes indicadores para evaluar el grado de transformación de cualquier modelo celular. Esta técnica proporciona a los investigadores un conjunto de herramientas que requieren mucho tiempo pero son fáciles de usar para evaluar la transformación celular in vitro. Esto permite que el método se utilice en la mayoría de los laboratorios.La demostración del procedimiento correrá a cargo de Teresa Anglada, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, y Joan Repulles, especialista en microscopía. Cuando el cultivo de células epiteliales primarias de mama alcance el 90% de confluencia, transfiera el sobrenadante del matraz de cultivo a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de suero fetal bovino y lave las células con PBS. Tratar las células con un mililitro de tripsina durante cinco minutos a 37 grados centígrados.Cuando las células se hayan desprendido, inactive la tripsina con el medio reservado y recoja las células por centrifugación. Agite el tubo para volver a suspender el pellet y agregue uno o dos mililitros de medio fresco para contar. Después de determinar la concentración de células, agregue 300.000 células a un nuevo tubo y lleve el volumen final a cinco mililitros con medio de cultivo fresco adicional.Siembre las células en un nuevo matraz T25 y devuélvalas a la incubadora de cultivo celular. A continuación, utilice la fórmula para calcular el número de duplicaciones de población acumuladas. Para evaluar la tasa de proliferación de las células, represente el número acumulado de duplicaciones de población durante un intervalo de tiempo específico.Una pendiente aumentada indica una mayor tasa de proliferación celular. Para establecer un cultivo celular en 3D, enjuague los pocillos con una superficie de 1,9 centímetros cuadrados con PBS estéril frío y cubra el fondo de cada pocillo con 100 microlitros de matriz de membrana basal. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante unos 20 minutos para permitir que la matriz se solidifique.Mientras tanto, recoja células mamarias como se acaba de demostrar y diluya las células a una concentración media de 400.000 células por mililitro. Mezcle las células con medio fresco suplementado con un 8% de matriz de membrana basal en una proporción de uno a uno y agregue 500 microlitros de las células a cada pocillo de matriz solidificada. Incubar las células a 37 grados centígrados durante unos minutos, luego agregar 500 microlitros de medio suplementado con una matriz de membrana basal al 4% a cada pocillo.Coloque las células en la incubadora de cultivos celulares durante 14 días. Las células sembradas se agruparán y proliferarán formando estructuras parecidas a acinos. Para la detección de proteínas inmunofluorescentes en las células mamarias cultivadas en 3D, utilice una punta de pipeta P200 recortada para eliminar la matriz de la membrana basal de cada pocillo y untar aproximadamente 50 microlitros de matriz desagregada de cada pocillo en portaobjetos de vidrio individuales.Cuando las muestras se hayan secado por completo, fije las células con una solución de metanol-acetona uno a uno a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la fijación, bloquee las muestras con solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de la solución de trabajo del anticuerpo primario de interés y cubra los portaobjetos con una tira de película de envoltura de laboratorio para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en una cámara húmeda.A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante una hora por lavado y etiquete las muestras con la solución de anticuerpos secundarios adecuada como se acaba de demostrar. Al final de la incubación, lave las muestras dos veces en PBS durante dos horas por lavado antes de contratinirlas con DAPI diluido en medio de montaje antidecoloración y cubrir cada portaobjetos con un cubreobjetos. A continuación, analice la distribución de la señal fluorescente para cada acino en un microscopio confocal.Para realizar un ensayo independiente del anclaje, primero cubra el fondo del número apropiado de pocillos de una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de agar al 0,6% en una solución media y deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de cinco veces 10 a la cuarta célula por mililitro como se muestra y filtre las células a través de un colador de 40 micras en un tubo estéril de 50 mililitros. Sosteniendo el tubo en un ángulo de 45 grados, agregue un volumen igual de 0.6% de agar en solución media por la pared del tubo.Y después de una mezcla completa, coloque un mililitro de las células en suspensión de agar en cada pocillo de la placa de seis pocillos previamente preparada. Utilice un microscopio invertido para confirmar que las células se han dispersado homogéneamente por todo el agar. Cuando el agar se haya solidificado por completo, agregue con cuidado un mililitro de medio de enfriamiento a cada pocillo sin perturbar el agar e incube las células durante tres semanas, cambiando el medio dos veces por semana.Al final del período de formación de colonias, reemplace el medio con un mililitro de un miligramo por mililitro MTT por pocillo para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivos celulares. Al día siguiente, retire el MTT de cada pocillo y adquiera imágenes de cada pocillo en el microscopio invertido. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, abra las imágenes en ImageJ y haga clic en imagen, ajustar, umbral y aplicar para obtener una máscara binaria a través del umbral de la imagen original.Cuando se hayan obtenido colonias bien delimitadas, seleccione complementos y biovoxxel para iniciar el analizador de partículas extendido para identificar las colonias MTT positivas. Durante un intervalo de tiempo específico, las células parcial y totalmente transformadas logran un mayor número de duplicaciones de población en comparación con las células no transformadas, lo que indica que la tasa de división celular aumenta con el proceso de transformación. Durante el período de cultivo celular 3D de dos semanas, las células se agregan y proliferan, aumentando el tamaño de los acinos.La polarización adecuada de cada acino puede evaluarse con precisión mediante la detección de proteínas inmunofluorescentes junto con la localización de señales tridimensionales mediante microscopía confocal. Si bien todos los acinos formados por células mamarias no transformadas están correctamente organizados, se observa una pérdida de polarización en los acinos formados por células parcial y totalmente transformadas. Después de tres semanas de cultivo en agar embebido, las células con una capacidad de crecimiento independiente del anclaje dan lugar a colonias compuestas por múltiples células.Solo las células metabólicamente activas son capaces de escindir el anillo MTT de tetrazolio, lo que da como resultado cristales de formazano MTT púrpura después de 24 horas. La medición del diámetro de la colonia mediante análisis automático de imágenes permite el filtrado de colonias de baja proliferación o células individuales. El número de colonias formadas por células no transformadas es insignificante en comparación con las de células parcial y totalmente transformadas.El tamaño de la colonia también se puede utilizar para discriminar entre células con diferentes grados de transformación. Estos ensayos se pueden utilizar para examinar líneas celulares antes de cualquier inoculación, ya que solo las líneas celulares que han dado positivo in vitro deben inocularse en ratones.

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Un método para procesar humano material de descarte mamaria quirúrgica se describe. Tejido procesado, en forma de organoides, se pueden almacenar indefinidamente congelados o ponen en cultivo para crecimiento a largo plazo. Este método permite el examen experimental de la normalidad biología celular epitelial humana, y los efectos de las perturbaciones exógenas.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

El ensayo Focus Formación ofrece un método sencillo para evaluar el potencial de transformación de un oncogén candidato.

Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones.  Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Aprende a evaluar la transformación oncogénica en células epiteliales mamarias humanas mediante ensayos de proliferación, crecimiento independiente de anclaje y cultivo 3D. Esta técnica permite estudiar el comportamiento celular in vitro.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

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