Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)
27 de octubre de 2020
Debido a la baja relación señal-ruido (SNR) inherente de los sensores basados en transferencia de energía de resonancia Fӧrster (FRET), la medición de señales cAMP ha sido un desafío, especialmente en tres dimensiones espaciales. Aquí, describimos una metodología de imagen y análisis FRET hiperespectral que permite la medición de la distribución de cAMP en tres dimensiones espaciales.
Este protocolo es importante, ya que proporciona un método para medir y visualizar señales FRET o AMP cíclicas en tres dimensiones espaciales en celdas individuales. Las distribuciones cíclicas de AMP pueden ocurrir axialmente además de lateralmente, y es importante adquirir datos de imágenes de AMP cíclico FRET en tres dimensiones para muestrear estas distribuciones. El día de la toma de imágenes, los Tyrodes calientes se amortiguan a 37 grados centígrados en un baño de agua y montan un cubreobjetos sentado con las células de interés transfectadas en una cámara celular.
Asegure la parte superior de la cámara con una junta de montaje para evitar fugas y use un limpiador de trabajo delicado para eliminar cualquier exceso de medio o celdas adherentes de la parte inferior del cubreobjetos. Agregue 800 microlitros de tampón de trabajo y cuatro microlitros de etiqueta nuclear de cinco milimolares a la cámara celular y agite suavemente la cámara durante cinco a 10 segundos. Luego cubra la cámara de la celda con papel de aluminio para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.
Para obtener imágenes de las células, seleccione el objetivo de inmersión en agua 60X en un microscopio confocal equipado con un detector espectral y agregue una gota de agua al objetivo. Coloque la cámara de celdas cargada en la platina del microscopio y ajuste la perilla del filtro para seleccionar el conjunto de filtros adecuado. Seleccione el modo de campo amplio de fluorescencia y utilice los oculares para seleccionar un campo de visión que contenga células que expresen el sensor AMP cíclico FRET.
Abra el software de imagen, seleccione el modo confocal y desbloquee el botón de enclavamiento láser. Abra el menú de configuración A1. Marque las casillas correspondientes a las líneas láser de 405 y 561 nanómetros y establezca estas detecciones espectrales en SD, la resolución en 10 y los canales en 32.
Seleccione los valores de longitud de onda inicial y final para establecer el rango de longitud de onda. Abra el menú Configuración A1 para seleccionar el icono de omisión de agrupación. Seleccione la casilla número 15 y haga clic en Aceptar. Ajuste las intensidades del láser al ocho por ciento para el láser de 405 nanómetros y al dos por ciento para el láser de 561 nanómetros.
Establezca la ganancia del detector en 149 y el radio del agujero de alfiler en 2,4 unidades de disco de Airy. Establezca la velocidad de escaneo en 25 fotogramas espectrales por segundo y seleccione la dirección de escaneo unidireccional. Establezca el recuento en cuatro y el tamaño de escaneo en 1024 por 1024.
Para definir los parámetros de adquisición de la pila z, haga clic en Ver, Control de adquisición y Adquisición ND, e introduzca el destino y el nombre del archivo en la ventana emergente para guardar el archivo ND. Haga clic en el cuadro de la serie z y haga clic en En vivo en la ventana Configuración de A1 Plus para abrir una ventana de visualización en vivo. Ajuste la perilla de enfoque para enfocar las celdas mientras mira en la ventana de vista previa.
Ajuste la perilla de enfoque en el microscopio para seleccionar la parte superior de la celda y haga clic en Superior en la ventana Adquisición ND para establecer la posición actual como la parte superior. Ajuste la perilla de enfoque en el microscopio para seleccionar la parte inferior de la celda y haga clic en Inferior para establecer la posición actual como la parte inferior. Introduzca un micrómetro para el tamaño del paso.
Seleccione Parte superior inferior para la dirección de escaneo z y haga clic en ejecutar para adquirir una pila z. Una vez completada la adquisición de la pila z, utilice una pipeta para añadir suavemente el reactivo de interés a la cámara sin alterar las células. Después de 10 minutos, cambie el nombre del archivo y adquiera una segunda imagen de pila z.
Después de la creación de imágenes, cree nuevas carpetas con los mismos nombres de archivo que las imágenes espectrales de la pila z y abra el archivo de imagen espectral de interés. Haga clic en Archivo, Importar/Exportar y Exportar documento ND. En la ventana emergente, seleccione la carpeta recién creada, TIFF para el tipo de archivo, Imagen mono para cada canal y mantenga la profundidad de bits.
Haga clic en exportar para exportar los archivos individuales a la carpeta y abrir el software de desmezcla espectral lineal. Abra la desmezcla lineal. m y haga clic en Ejecutar.
Busque y seleccione la carpeta que contiene la secuencia de archivos TIFF exportados y haga clic en Aceptar para abrir la ventana de longitud de onda y corte z. Copie el nombre del archivo del primer archivo sin el segmento Z y el número de canal de la carpeta y péguelo en el primer paso del cuadro Intro del nombre de la imagen, introduzca el número de canales en el cuadro Introduzca el número de bandas de longitud de onda y el número de segmentos Z en el cuadro Introduzca el número de segmentos Z y haga clic en Aceptar. Luego, en la ventana emergente, busque y seleccione la longitud de onda. mat y haga clic en Abrir.
Busque y seleccione el archivo mat de la biblioteca en la nueva ventana emergente y haga clic en Abrir de nuevo para iniciar la desmezcla del corte. Para calcular la eficiencia de FRET, abra el multiFRRCF.
m y escriba el número de ensayos experimentales que se van a analizar en el cuadro Cuántas carpetas se van a recortar. Haga clic en Aceptar. Busque para seleccionar las carpetas sin mezclar y vuelva a hacer clic en Aceptar. En la nueva ventana emergente, establezca el factor de escala en 12,4, el umbral en 56, la frecuencia X, Y y Z en cinco, cinco y uno respectivamente, y el algoritmo de suavizado en Gaussiano.
A continuación, haga clic en Ejecutar para realizar las mediciones FRET y el recorte. Para asignar la eficiencia de FRET a los niveles de AMP cíclico, abra el Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m y haga clic en Ejecutar.
Navegue y seleccione la primera imagen FRET en escala de grises y haga clic en Aceptar. A continuación, abra las imágenes de AMP cíclico de FRET para inspeccionar la distribución de las señales de AMP cíclicas en tres dimensiones. En estas imágenes, se pueden observar vistas tridimensionales de datos de imágenes hiperespectrales sin procesar en falso color adquiridos mediante microscopía confocal al inicio y 10 minutos después del tratamiento con forskolina. En este análisis, un fluoróforo aceptor fue completamente fotodestruido, lo que permitió obtener firmas espectrales del donante y del aceptor con estequiometría uno a uno.
Se utilizaron células no transfectadas marcadas con un colorante nuclear para obtener el espectro puro del fluoróforo del colorante. La combinación de los espectros de los fluoróforos donante, aceptor y colorante nuclear permite la creación de una biblioteca de tres componentes. Aquí, se pueden observar las fuentes de tres firmas espectrales de fondo.
Aunque estas señales se distribuyen de manera no uniforme dentro de la muestra y no se pueden restar sin más, la adición de las firmas espectrales de estas señales a la biblioteca espectral y el uso de la desmezcla lineal para separar las señales proporciona un enfoque para eliminar estas señales de confusión de las señales donante y aceptora antes de calcular sus eficiencias FRET. La biblioteca espectral de seis componentes se puede utilizar para realizar la desmezcla espectral lineal para cada corte en la imagen axial. Aquí, se pueden observar los cambios en la eficiencia de FRET y los niveles de AMP cíclico en diferentes cortes de plano XY, lo que permite una comparación entre las condiciones de referencia y las condiciones 10 minutos después del tratamiento con forskolina.
Esta técnica también podría utilizarse para cuantificar la eficiencia FRET de otros reporteros en tres dimensiones, tanto en células como en tejidos.
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Descripción general
Este estudio aborda los desafíos de medir señales de AMPc en tres dimensiones espaciales utilizando sensores basados en transferencia de energía por resonancia de Fӧrster (FRET). Presenta una novedosa metodología de imagen hiperspectral FRET que permite la visualización y medición de la distribución de AMPc dentro de células individuales.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Señalización del AMP cíclico
- Tecnología de imagen por FRET
- Dinámica celular en tres dimensiones
Antecedentes
- Bajo ratio señal-ruido (SNR) en sensores FRET tradicionales
- Importancia de las mediciones tridimensionales de AMPc
- Aplicaciones en vías de señalización celular
Métodos Utilizados
- Imagen hiperespectral para análisis de FRET
- Microscopía confocal para imágenes
- Técnicas de separación espectral lineal
Resultados principales
- Medición exitosa de la distribución de AMPc en tres dimensiones
- Visualización de las respuestas celulares al tratamiento con forskolina
- Utilidad demostrada del desmezclado lineal para la separación de señales
Conclusiones
- Esta metodología proporciona un marco robusto para estudiar la dinámica del AMPc con alta resolución.
- Mejora la comprensión de las vías de señalización en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cartografía espacial precisa de la dinámica de los mensajeros secundarios es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en las vías de los receptores acoplados a proteínas G y de la adenilil ciclasa. Este enfoque de FRET hiperspectral permite la resolución tridimensional de las señales de AMPc, reduciendo la ambigüedad mecanicista en estudios de compartimentalización subcelular. El método respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular los patrones espaciales de AMPc con respuestas celulares funcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la resolución de la compartimentalización del AMPc en tres dimensiones espaciales.
- Valor operativo: Proporciona una validación funcional del blanco a través de la visualización de patrones de señalización específicos de la vía en células vivas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la correlación de distribuciones espaciales de AMPc con resultados fenotípicos tras perturbaciones farmacológicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Genera lecturas cuantitativas y con resolución espacial de la eficiencia de FRET adecuadas para formatos de cribado de alto contenido.
- Reproducibilidad: Utiliza la desmezcla espectral lineal para minimizar la autofluorescencia y la interferencia espectral, mejorando la fiabilidad de la señal entre réplicas.
- Escalabilidad: Compatible con la adaptación a placas de múltiples pocillos para cribar los efectos de compuestos sobre la dinámica subcelular de AMPc.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable a células endoteliales microvasculares pulmonares, lo que apoya estudios traslacionales en vías de señalización vascular.
- Reducción mecanicista de riesgos: Aclara si los cambios observados en el AMPc se deben a una modulación real de la vía o a artefactos de imagen provocados por superposición espectral.
- Continuidad preclínica: Permite el seguimiento longitudinal de la dinámica del AMPc desde el descubrimiento hasta la validación funcional en sistemas relevantes para la enfermedad.
Integración de la Secuencia y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos iniciales, al proporcionar lecturas cuantitativas con resolución espacial de la actividad de mensajeros secundarios.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cartografía de la dinámica del AMPc en respuesta a agonistas del receptor acoplado a proteína G o moduladores de la adenilil ciclasa.
- Selección: Proporciona datos tridimensionales de AMPc listos para ensayos, con menos falsos positivos derivados de interferencias espectrales.
- Análisis: Genera mapas de eficiencia de FRET y de concentración de AMPc que permiten comparaciones entre diferentes condiciones de tratamiento y perturbaciones genéticas.
- Investigación Traducional: Se vincula con trabajos preclínicos mediante su uso en células endoteliales primarias y su adaptabilidad a modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad central de imagenología reutilizable para el estudio de la señalización espacial en múltiples sistemas de mensajeros secundarios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la señalización de AMPc al resolver las distribuciones axial y lateral.
- Valor operativo: Estandariza las mediciones de FRET mediante la separación basada en bibliotecas espectrales y parámetros de adquisición reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos espacialmente contextualizados sobre la interacción con el blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la fidelidad de la señalización subcelular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes hiperespectrales, separación espectral y validación de biosensores FRET.
- Depende de microscopía confocal con detector espectral y capacidad de detección de 32 canales.
- Necesita estandarización entre equipos para la generación de bibliotecas espectrales y los parámetros de separación espectral.
- La adaptación a otros tipos celulares puede requerir optimización de la densidad de marcado y de los parámetros del z-stack.
- Las limitaciones prácticas incluyen los riesgos de fotoblanqueo durante la adquisición prolongada de z-stacks y las exigencias computacionales del procesamiento espectral.
