Name: Un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprende a crear un modelo de inestabilidad lumbar en ratones C57BL/6 mediante resección quirúrgica de procesos espinosos y ligamentos. Este método reproducible permite estudiar la degeneración del disco intervertebral y los cambios estructurales óseos en investigación ortopédica.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607) y Essential Drug Research and Development (2019ZX09201004-003-032) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China.

Las investigaciones descritas se ajustan a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái. Todas las manipulaciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia profunda y los animales no experimentaron dolor en ninguna etapa durante el procedimiento.
1. Preparación previa a la operación
<ol><li>Esterilización de instrumentos: Esterilizar a vapor los instrumentos quirúrgicos en un autoclave (121 °C durante 15 min) antes de la cirugía. Empaque los instrumentos en un recipiente metálico y mantenlos hasta que se utilicen en la cirugía.</li>
	<li>Configuración de la plataforma de cirugía: Asigne un área de banco de al menos 60 cm x 60 cm para la operación. Limpie la superficie de la zona con un 75% de alcohol y cubra con una toalla médica desechable. Coloque un paquete de instrumentos quirúrgicos estériles, reactivos, artículos quirúrgicos en una toalla médica desechable dentro de la parte superior 1/3 del área. Deje el 2/3 restante de área limpia para el funcionamiento quirúrgico. Agregue un hotpad debajo de la almohadilla quirúrgica para obtener apoyo térmico.</li>
	<li>Preparación de animales<ol>
<li>Coloque al animal (ratones C57BL/6J, macho, de 8 semanas) en la cámara de inducción. Encienda el vaporizador a un nivel de inducción del 4% para isofluranos y 4 L/min para oxígeno. Después de que el animal esté completamente anestesiado, mantenga el anestésico con el cono nasal y el parto anestésico a un nivel de 1,5% para isoflurano y 0,4 L/min para oxígeno durante la cirugía. Monitoree al animal para la respiración.</li>
		<li>Aplicar ungüento ocular de clortraciclina hidrocloruro para prevenir la sequedad corneal durante la cirugía.</li>
		<li>Afeite el área quirúrgica en la superficie dorsal desde la región torácica inferior hasta la parte superior de la región sacra utilizando una pequeña recortadora de animales. Retire el pelaje afeitado con toallitas de tejido.</li>
		<li>Aplicar crema depilatoria en el área afeitada y dejarla allí no más de 3 minutos. Retire la crema con gasa y enjuague con 2 ml de solución salina estéril al 0,9%.</li>
		<li>Coloque una almohadilla cilíndrica quirúrgica hecha a medida(Figura 2A)debajo del abdomen del ratón para levantar la columna lumbar y facilitar la operación quirúrgica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Exposición del tercio lumbar a los procesos espinosos del quinto lumbar (L3–L5)
<ol><li>Utilice el dedo índice para tocar los procesos espinosos subcutáneos de las vértebras lumbares, que son más externas, y comparar con las vértebras torácicas y las vértebras sacrales para identificar la región lumbar.</li>
	<li>Enjuague la piel con un 75% de alcohol. Realice una incisión cutánea de 3-4 cm en la mitad de la línea sobre la región maderera desde la región torácica media hasta la cadera utilizando una hoja de bisturí para exponer la fascia.</li>
	<li>Identifique la columna lumbar mediante la morfología de la fascia posterior insertada en las puntas de los procesos espinosos. En detalle, el tercer lumbar (L3)a la primera fachada sacra (S1)son distintos de otras fasciae por sus formas "V". La última punta "V" se conecta a la primera fascia sacra (S1)y la primera punta "V" corresponde al proceso espinoso L3 (Figura 2B).</li>
	<li>Hacer las incisiones musculares paraspinas posteriores a lo largo de los procesos espinosos de L3 a L5 en ambos lados lateralmente con una hoja del bisturí (Figura 2C). Controle la profundidad de incisión hacia las facetas para reducir la hemorragia.</li>
	<li>Separe las capas musculares usando dos fórceps oftálmicos para exponer los procesos espinosos de L3 a L5 y los ligamentos supraespinosos.</li>
</ol>3. Resección de L3–L5 procesos espinosos junto con los ligamentos
<ol><li>Separe los procesos espinosos individuales cortando los ligamentos interespinosos usando cizallos Venus(Figura 2D).</li>
	<li>Resecciona los procesos espinosos L3-L5 junto con los ligamentos interespinosos con cizalla Venus (Figura 2E).</li>
	<li>Sutura la incisión de la piel con trenzada de seda estéril (tamaño de sutura 5.0) sin reasociar los músculos paravertebrales.</li>
	<li>Aplique ungüento ocular de clortraciclina clortraciclina en el sitio quirúrgico.</li>
	<li>Administrar Buprenorphine-SR (25 uL por gramo de peso del ratón) inmediatamente después de la cirugía LSI para la analgesia.</li>
	<li>Coloque a los animales en una cámara caliente y monitoree durante la recuperación de la anestesia. Monitoree la ingesta de alimentos y agua antes de devolver a los animales a la jaula de origen.</li>
	<li>Monitoree al animal una vez al día durante los primeros 3 días después de la operación. El animal debe ser capaz de tener un apetito normal y debe sanar sin signos de pus, hemorragia o hinchazón. Pueden tener un deterioro menor en la locomoción.</li>
	<li>Llevar a cabo operaciones falsas sólo por el desprendimiento de los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras L3–L5.</li>
</ol>

<ol><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+disc+degeneration+progression+in+young+women+in+their+20%27s%3A+a+prospective+ten-year+follow+up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Science%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Orthopaedic+Association%22%5BJournal%5D)">Lumbar disc degeneration progression in young women in their 20's: a prospective ten-year follow up.</a> Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 22 (4), 635-640 (2017).</li>
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<li>Nemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+changes+in+intervertebral+discs+after+smoking+and+cessation%3A+experimental+study+using+a+rat+passive+smoking+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Science%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Orthopaedic+Association%22%5BJournal%5D)">Histological changes in intervertebral discs after smoking and cessation: experimental study using a rat passive smoking model.</a> Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (2), 191-197 (2006).</li>
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<li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+activation+of+tgf%CE%B2+by+spinal+instability+causes+vertebral+endplate+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Excessive activation of tgfβ by spinal instability causes vertebral endplate sclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 27093(2016).</li>
<li>Ni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+innervation+in+porous+endplates+by+Netrin-1+from+osteoclasts+mediates+PGE2-induced+spinal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sensory innervation in porous endplates by Netrin-1 from osteoclasts mediates PGE2-induced spinal hypersensitivity in mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 5643(2019).</li>
<li>Liu, S., Cheng, Y., Tan, Y., Dong, J., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligustrazine+prevents+intervertebral+disc+degeneration+via+suppression+of+aberrant+tgf%CE%B2+activation+in+nucleus+pulposus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Ligustrazine prevents intervertebral disc degeneration via suppression of aberrant tgfβ activation in nucleus pulposus cells.</a> BioMed Research International. 2019, 5601734(2019).</li>
<li>Boos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+age-related+changes+in+lumbar+intervertebral+discs%3A+2002+Volvo+Award+in+basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science.</a> Spine. 27 (23), 2631-2644 (2002).</li>
<li>Miyamoto, S., Yonenobu, K., Ono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cervical+spondylosis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Experimental cervical spondylosis in the mouse.</a> Spine. 16, 10 Suppl 495-500 (1991).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desarrollamos el modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral basado en el modelo de ratón de espondilosis cervical en el que se separaron los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras y los procesos espinosos junto con los ligamentos supraespinosos e interespinosos se reseccionaron25. Realizamos una operación similar en la columna lumbar, que tiene procesos espinosos más prominentes. El modelo de ratón LSI desarrolló un IDD similar en la columna lumbar.
<p class...

La degeneración intervertebral del disco (IDD) se observa comúnmente en el envejecimiento e incluso en los jóvenes causados por muchos factores1. La cirugía para pacientes que sufren de IDD, causando dolor lumbar y movimiento deteriorado, generalmente se realiza en una etapa posterior o en casos graves y tiene riesgos potenciales como no unión o infección2. El tratamiento no operativo ideal requiere una comprensión integral del mecanismo IDD. El modelo animal IDD sirve como una herramienta crucial para los estudios del mecanismo IDD y la evaluación del tratamiento con IDD.
Los animales más grandes han sido elegidos para modelos IDD como primates, ovejas, cabras, perros y conejos debido a su similitud con la estructura anatómica humana en gran medida y la fuerte operatividad en términos de tamaño de discos intervertebrales (IVDs)3,4,5,6,7,8. Sin embargo, estos modelos animales consumen mucho tiempo y consumen un costo de9. La IVD del ratón es una mala representación de la IVD humana basada en mediciones geométricas de la relación de aspecto, relación de área de núcleo pulposo a disco y altura normalizada10. A pesar de la diferencia de tamaño, el segmento IVD lumbar del ratón exhibe propiedades mecánicas similares a la IVD humana como compresión y rigidez de torsión11. Además, el modelo IDD del ratón tiene la ventaja del desarrollo de IDD de bajo costo, relativamente corto, y más opciones para animales y anticuerpos genéticamente modificados utilizados en otros estudios mecanicistas12,13,14,15.
Los modelos de IDD inducidos experimentalmente varían de los inductores y las aplicaciones. Por ejemplo, la degeneración de la matriz extracelular (ECM) inducida por colágenona es adecuada para la investigación de regeneración ecm16. El fenotipo modificado genéticamente es adecuado para estudiar la función génica en el proceso IDD y en terapias genéticas17. Los modelos de incisión fibrosa y humo annulus imitan el trauma y la IDD inducida por no inflamación12,18.
La inestabilidad espinal (SI) conduce a una columna vertebral inestable que no está en un estado óptimo de equilibrio. Puede ser causado por el movimiento anormal de un segmento de movimiento lumbar debido a la debilidad del tejido de apoyo circundante, como ligamentos y músculos. También se ve comúnmente después de la operación de fusión espinal19. Si se considera como la causa principal del IDD. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar un modelo de ratones SI (centrado en la columna lumbar) que imita el proceso humano de IDD20,21.
En el protocolo, introdujimos el procedimiento de establecer el modelo de ratón de inestabilidad espinal lumbar (LSI) mediante la resección del tercio lumbar (L3)a los procesos espinosos lumbares quintos (L5)junto con los ligamentos supraespinosos e interspinos (Figura 1A,B). El modelo animal desarrolla IDD tan pronto como 1 semana después de la cirugía como lo demuestra la hipertrofia y la porosidad en las placas finales (EPs). El volumen de IVD comienza a disminuir 2 semanas después de la cirugía a través de 16 semanas junto con un aumento de la puntuación de IVD, lo que indica el grado de IDD. Creemos que el procedimiento detallado y visualizado es útil para que los investigadores establezcan el modelo de ratón LSI en su laboratorio y se apliquen a la investigación de IDD según sea necesario.

<table><tbody><tr><td>Pomada ocular de clortetraciclina clorhidrato Shanghai</td><td>General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H31021931</td><td>Prevenir la sequedad de los ojos, Prevenir la infección de la herida</td></tr><tr><td>C57BL/6J ratones machos</td><td>Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)</td><td>SCXK2018-0004</td><td>Modelo animal</td></tr><tr><td>Toalla médica desechable</td><td>Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd.</td><td>20160090</td><td>Plataforma para operación quirúrgica</td></tr><tr><td>Equipo de anestesia inhalante</td><td>MIDMARK</td><td>Matrx 3000</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.</td><td>1903715</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Clorhidrato de lidocaína</td><td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022839</td> Aguja de sutura médica <td>para el alivio del dolor</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>20S0401J</td><td>Piel de sutura</td></tr><tr><td>Pinzas oftálmicas</td><td>Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fábrica de instrumentos quirúrgicos</td><td>JD1050</td><td>Clip de la piel</td></tr><tr><td>Tijeras oftálmicas (10cm)</td><td>Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fábrica de instrumentos quirúrgicos</td><td>Y00030</td><td>Incisión de piel</td></tr><tr><td>seda trenzada</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>11V0820</td><td>Piel de sutura</td></tr><tr><td>Recortadora de animales pequeños</td><td>Shanghai Feike Electric Co., Ltd.</td><td>FC5910</td><td>Depilación</td></tr><tr><td>Cuchillas quirúrgicas estériles (12 #)</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>35T0707</td><td>Incisión muscular</td></tr><tr><td>Crema depilatoria Veet</td><td>RECKITT BENCKISER (India) Ltd</td><td>NA</td><td>Depilación</td></tr><tr><td>Tijeras Venus</td><td>Equipo médico Mingren</td><td>Longitud: 12,5 cm</td><td>Recorte el músculo y el proceso espinoso</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

La degeneración intervertebral del disco (IDD) es un cambio patológico común que conduce al dolor lumbar. Se desean modelos animales apropiados para entender los procesos patológicos y evaluar nuevos fármacos. Aquí, introdujimos un modelo de ratón de inestabilidad lumbar (LSI) inducido quirúrgicamente que desarrolla IDD a partir de 1 semana después de la operación. En detalle, el ratón bajo anestesia fue operado por incisión de la piel de espalda baja, exposición a procesos espinosos L3-L5, desprendimiento de músculos paraspinos, resección de procesos y ligamentos, y cierre de la piel. L4–L5 IVDs fueron elegidos para la observación. El modelo LSI desarrolla IDD lumbar por porosidad e hipertrofia en placas finales en una etapa temprana, disminución en el volumen de disco intervertebral, contracción en el núcleo pulposo en una etapa intermedia, y pérdida ósea en vértebras lumbares (L5)en una etapa posterior. El modelo de ratón LSI tiene las ventajas de una fuerte operatividad, sin necesidad de equipos especiales, reproducibilidad, barato y período relativamente corto de desarrollo de IDD. Sin embargo, la operación de LSI sigue siendo un trauma que causa inflamación dentro de la primera semana después de la operación. Por lo tanto, este modelo animal es adecuado para el estudio de IDD lumbar.

El modelo de ratón LSI se aplica en los estudios de mecanismo IDD, tratamiento IDD, degeneración endplate (EP) como esclerosis, e invation sensorial en EP20,21,22,23. El ratón LSI desarrolla cambios degenerativos de IDD y EP, identificados, por disminución del volumen y la altura de la IVD, aumento del volumen ep y aumento de las puntuaciones de IVD y EP.
La columna ...

Desarrollamos un modelo de ratón de degeneración de disco intervertebral lumbar mediante la resección de procesos espinosos L3-L5 junto con ligamentos supra-e interespinosos y desprendimiento de músculos paraspinosos.

Un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Esta es una cirugía para inducir el modelo del ratón ofrece una alternativa para estudios relacionados con la degeneración del disco intervertebral lumbar. Este robusto modo LSI no requiere ningún equipo especial. Es reproducible y se puede utilizar para inducir la degeneración del disco intervertebral en un período relativamente corto de tiempo.Controlar las profundidades de incisión y la hemorragia y realizar la resección de cada proceso interspinoso son dos gastos clave para la implantación de nuestro éxito para el experimento. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, coloque un seis ratón negro C57 de ocho semanas de edad y anestesiado en una almohadilla quirúrgica en posición supina y aplique ungüento a los ojos del animal. Utilice una pequeña recortadora de animales para afeitar el área quirúrgica desde la región torácica inferior hasta la parte superior de la región sacra y retire el pelaje afeitado con toallitas de tejido.Aplicar crema depilatoria en la zona afeitada con gasa para eliminar la crema después de no más de tres minutos y enjuagar la piel expuesta con dos mililitros de solución salina estéril de 0,9. A continuación, coloque una almohadilla cilíndrica quirúrgica hecha a medida debajo del abdomen para elevar la columna lumbar. Para exponer las vértebras L3 y L5 utilice el dedo índice para tocar los procesos espinosos subcutáneos de las vértebras lumbares y palpato para comparar los procesos con los de las vértebras torácicas y las vértebras sacrales para identificar la región lumbar.Enjuague la piel con un 75% de alcohol, y usando un microscopio diseccionador use un bisturí para hacer una incisión de piel de tres a cuatro centímetros en la mitad de la línea sobre la región lumbar desde la región torácica media hasta la cadera. Identifique la columna lumbar por la forma en V de la fascia posterior insertada, en la punta para que los procesos espinosos y utilizar el bisturí para hacer incisiones musculares paraspinas posteriores poco profundas a lo largo de los procesos espinosos de L3 a L5 lateralmente a ambos lados de la columna vertebral. A continuación, utilice dos pares de fórceps oftálmicos para separar las capas musculares para exponer los procesos espinosos L3 a L5 y ligamentos supraespinosos.Para separar los procesos espinosos individuales, utilice asas venosas para cortar ligamentos interespiosos y para resecar los procesos espinosos L3 a L5 y los ligamentos interespiosos. A continuación, utilice suturas trenzadas de seda estéril número cinco para cerrar la incisión de la piel sin volver a unir los músculos paraverleles y aplicar ungüento de clorcloruro de clortraciclina en el sitio quirúrgico. El análisis histomorfométrico 3D permite la medición del disco intervertebral, mientras que el análisis estructural 3D permite cuantificar el volumen total del tejido.El volumen del disco intervertebral aumenta significativamente una semana después de la cirugía antes de disminuir de dos a 16 semanas después del procedimiento consistente con una disminución en la altura del disco intervertebral medida durante el mismo período de tiempo. El aumento de las cavidades dentro de las placas finales craneales también se observa en ratones LSI cuantificados por un mayor porcentaje de valores de separación trabecular mayor o igual a 0.089 y un aumento significativo en los volúmenes de endplate después de la cirugía. Las placas finales del modelo exhiben un fenotipo similar, lo que indica que LSI conduce a hipertrofia endplate y un aumento en el número de cavidades.Los volúmenes de vértebras L5 aumentan ligeramente después de la cirugía con diferencias estadísticas observadas a las 16 semanas. Una disminución significativa en la relación entre el volumen óseo y total del tejido también está presente 16 semanas después de la cirugía, lo que indica que la LSI causa pérdida ósea vertebral en una etapa posterior. Una reducción en las vacuolas intracelulares de las células del núcleo pulposo también se acelera en animales LSI con un mayor número de osteoclastas observadas en las placas finales LSI.Este modelo se puede modificar mediante la fijación de diferentes vértebras, como el quinto lumbar solamente, o desde el primer lumbar hasta el quinto lumbar.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un examen longitudinal de la pérdida ósea en los fémures y tibias de ratones adultos se llevó a cabo después de una lesión de la médula espinal utilizando secuencial de dosis baja de rayos X de los análisis. La pérdida de hueso tibia se detectó durante todo el estudio, mientras que la pérdida ósea en el fémur no se detectó hasta 40 días después de la lesión.

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

En este video, describimos el procedimiento quirúrgico para inducir la inestabilidad de la columna lumbar en un modelo de ratón mediante la resección de la apófisis espinosa lumbar L3 a L5 junto con ligamentos supraespinosos e interespinosos.

Inducción quirúrgica de la inestabilidad de la columna lumbar en un modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para la resección de las apófisis espinosas lumbares y los ligamentos conectados en un modelo murino

Fuente: Kumar, S., et. al. Modelo de ratón de úlceras por presión después de una lesión de la médula espinal. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra una inducción detallada de la lesión de la médula espinal en ratones. El ratón anestesiado se disecciona para exponer las vértebras T9-T10 y se extirpan sus apófisis espinosas. A continuación, se secciona la médula espinal expuesta para infligir la lesión. A continuación, se cierra el área quirúrgica y se permite que el ratón se recupere.

Generación de un modelo de ratón con una lesión medular

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Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.

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Un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral

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