Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)

Nuestro protocolo demuestra cómo producir partículas del virus de las abejas melíferas en masa para su uso en bioensayos controlados de alto rendimiento para la detección rápida de la eficacia del tratamiento viral. El ensayo utiliza pupas de abeja fáciles de cultivar en lugar de cultivo celular, lo que reduce el trabajo de obtener sujetos experimentales. A continuación, el virus puede utilizarse para producir curvas de mortalidad predecibles y bioensayos repetibles.

Ha habido un interés sustancial en comprender cómo los llamados virus de las abejas melíferas afectan a una gama más amplia de huéspedes. Esta técnica de producción de virus se puede emparejar con otros sistemas de polinizadores para probar la infectividad. Para la extracción masiva de abejas por autoeliminación de larvas, enjaula a una abeja melífera reina en un marco Langstroth vacío y prolongado y devuélvala a su colonia.

Después de permitir que la reina ponga huevos en el marco durante 24 horas, revise el marco para asegurarse de que la mayoría de las celdas del panal contengan huevos recién puestos y libere a la reina. Exactamente 192 horas después de enjaular a la reina, retire el marco de la colonia y cepille las abejas adultas. Al regresar al laboratorio, coloque el marco en una incubadora configurada según las condiciones internas de una colmena y limpie a fondo los recipientes de la misma altura y ancho del marco lleno de larvas con lavados secuenciales de agua y jabón, lejía y etanol.

Cubra el fondo de los recipientes con varias capas de toallas de papel y agregue varias capas superpuestas de material absorbente más delgado. Cuando los contenedores estén listos, coloque el marco en el lado focal de las larvas del contenedor hacia abajo y use un trozo de papel de aluminio para cubrir el contenedor y el marco. Después de la incubación durante la noche, levante con cuidado las toallitas individuales de la capa superior de cada recipiente para permitir que las larvas se viertan suavemente en una bandeja de transferencia.

Luego, use pinzas blandas y romas para esparcir las larvas por la superficie de las bandejas sin tocarlas y coloque la bandeja cubierta con papel de aluminio en la incubadora hasta que las larvas pupen y maduren hasta la etapa de ojos abiertos. Para la inyección de virus de las pupas, mezcle las partículas de virus de interés a la concentración adecuada en PBS estéril en un tubo de 15 mililitros y conecte un aparato inyector a una multipipeta manual. Para probar la eficacia del inyector, cargue el inyector con 100 microlitros de agua y dispense el agua en dosis de un microlitro.

Si las inyecciones son precisas, cargue 100 microlitros de la solución de partículas del virus en el inyector y agarre suavemente una pupa a lo largo del tórax, aplicando la presión suficiente para forzar los fluidos internos en el abdomen para hacer más evidentes las divisiones de tergita. Estabilizando el brazo que sostiene la jeringa contra la mesa del laboratorio para apoyarse, inserte la aguja justo en la cutícula entre la tercera y la cuarta tergitas abdominales e inyecte un microlitro de solución viral. Cuando se hayan inyectado todas las pupas, vuelva a cubrir la bandeja con papel de aluminio antes de devolverlas a la incubadora durante otros tres a cinco días.

Al final de la incubación, agrupe las pupas por fuente de colonia en tubos centrífugos cónicos individuales de 50 mililitros y vórtice para homogeneizar el contenido. Para realizar un bioensayo de alimentación viral, tape los orificios de alimentación de las jaulas limpias con un tubo de centrífuga del tamaño adecuado y llene parcialmente los tubos de centrífuga de 15 mililitros con una solución de alimentación recién preparada. Luego, invierta los tubos y use una chincheta para hacer uno o dos agujeros alrededor de las puntas.

A continuación, cepille todas las abejas recién emergidas de sus cajas de emergencia en un receptáculo de recolección ligeramente cubierto alrededor de los bordes con aceite vegetal y mezcle suavemente las abejas a mano. Transfiera 35 abejas individuales a una sola taza engrasada y coloque el contenido de la taza en una jaula acrílica. Para preparar el inóculo del virus, mezcle una cantidad adecuada de partículas de virus descongeladas y concentradas con una solución de sacarosa al 30% en un recipiente estéril por tipo de tratamiento y agregue 600 microlitros de solución del virus en bandejas de inóculo individuales.

Luego, inserte con cuidado cada bandeja de inóculo en sus jaulas correspondientes, teniendo cuidado de no soltar accidentalmente ninguna abeja. Cuando se hayan consumido todos los inóculos, reemplace los tubos de centrífuga del orificio de alimentación superior con los tubos de alimentación preparados y registre la mortalidad dentro de cada jaula a intervalos de 12 horas durante las primeras 72 horas del experimento y cada 24 horas a partir de entonces. Para sacar las abejas muertas, deslice la puerta de la jaula hacia arriba lo suficiente como para permitir que se inserten un par de pinzas esterilizadas con alcohol para sacar las abejas muertas.

Dependiendo del diseño del experimento, coloque muestras vivas de cada jaula en tubos de centrífuga individuales sobre hielo seco para permitir el muestreo para las mediciones de títulos virales. En este esfuerzo representativo de recolección de virus más grandes, cada pupa fue inyectada inicialmente con un inóculo del virus de la parálisis aguda de aproximadamente el 95% de Israel. Aunque 10 de las 16 muestras de colonias involucradas en estas extracciones contenían virus de alta pureza, otras muestras variaron en su proporción de virus, y algunas incluso estaban dominadas por otros virus, como el virus de las alas deformes.

Como se ilustra en la tabla, los valores de ciclo umbral se pueden utilizar como predictor de la proporción. La comparación de las curvas de dosis-respuesta-supervivencia de las abejas alimentadas con las mismas partículas del virus durante dos años diferentes revela que, a pesar de los parámetros de prueba idénticos, los ensayos realizados en 2018 y 2019 produjeron respuestas de supervivencia notablemente diferentes en todos los grupos de tratamiento, excepto en los de control, que no recibieron el virus en su inóculo de sacarosa. Las respuestas de las abejas melíferas a la infección viral pueden variar mucho según la temporada, la colmena o incluso la distribución del inóculo dentro de las jaulas individuales.

Por lo tanto, los tamaños de muestra grandes son críticos para confirmar los efectos del tratamiento. Utilizando existencias de partículas virales, el experimento puede ampliarse para incluir inyecciones de abejas obreras adultas, reinas o zánganos, o a otras especies de polinizadores para evaluar el rango de huéspedes. Las reservas infecciosas de virus se pueden usar para probar cómo interactúa la infección con otros factores, como la dieta, la exposición a sustancias químicas o los entornos sociales.