Name: Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a preparar partículas virales de abejas melíferas para bioensayos de alta eficiencia utilizando pupas de Apis mellifera. Este método simplifica el estudio de infecciones virales y permite evaluar tratamientos contra virus como el de parálisis aguda israelí.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a la Dra. Julia Fine por sus ideas y discusión durante el proceso de creación del protocolo, así como a la Dra. Cassondra Vernier por sus útiles comentarios a lo largo de la edición. Estos materiales contribuyeron a proyectos que fueron apoyados en parte por la Fundación para la Investigación de la Alimentación y la Agricultura, bajo la subvención ID 549025.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí hemos esbozado métodos que detallan cada paso del proceso de amplificación del virus y preparación de la población de inóculos, incluida la recolección de larvas y la propagación, extracción y concentración del virus, así como el tratamiento viral en forma de experimentos de alimentación en jaulas. Estos métodos permiten la producción de partículas de virus semipuras (Figura 4), cuya eficacia puede cuantificarse consistentemente mediante pruebas de mortalidad dosis-respuesta para virus ...

Las abejas melíferas (Apis mellifera) desempeñan un papel fundamental en el panorama agrícola mundial moderno, pero actualmente sufren de una combinación de factores estresantes bióticos y abióticos, incluida la exposición a pesticidas, forraje deficiente, parásitos y patógenos 1,2. Uno de los patógenos más importantes de preocupación son los virus, muchos de los cuales son vectorizados por otro de los principales factores estresantes de las abejas melíferas, el ácaro parásito Varroa (Varroa destructor). Estos virus pueden causar una serie de efectos negativos en las abejas melíferas, incluida la reducción de la supervivencia de la cría, los defectos de desarrollo y la parálisis que pueden conducir al colapso total de la colmena tanto antes como después de los períodos de hibernación 3,4,5. Aunque ha habido avances prometedores en el desarrollo de tecnologías utilizadas para combatir la infección por virus 6,7,8,9, la dinámica por la cual muchos virus se propagan, propagan e interactúan dentro de una abeja melífera o colonia aún no se conocen 5,10 . Comprender la biología básica de las interacciones entre las abejas melíferas y los virus y sus relaciones con otros factores ambientales es fundamental para desarrollar técnicas efectivas de manejo de virus.
Sin embargo, el estudio de las interacciones entre la abeja melífera y el virus plantea desafíos con numerosos factores conocidos y desconocidos que complican el proceso. Estos incluyen interacciones con la dieta11,12, exposición a pesticidas13 y antecedentes genéticos deabejas 14,15. Incluso cuando se centra solo en la infección por virus, las complicaciones son comunes porque las poblaciones de abejas melíferas, tanto manejadas como silvestres, siempre tienen algún grado de infección por virus de fondo, aunque a menudo sin manifestar síntomas agudos 16,17, y los efectos de la coinfección por virus no se comprenden bien18. Esto ha hecho que el estudio de los efectos del virus de la abeja melífera sea difícil de desentrañar.
Muchos estudios sobre el virus de las abejas melíferas han utilizado infecciones por virus circunstanciales para buscar interacciones con otros factores estresantes, observando cómo cambian las infecciones de fondo con otros tratamientos 12,19,20,21. Si bien este enfoque ha tenido éxito en la identificación de efectos importantes, especialmente al descubrir cómo los pesticidas o los tratamientos dietéticos afectan los niveles de virus y la replicación, la inoculación con un tratamiento de virus de contenido y concentración conocidos es fundamental para las pruebas experimentales de la dinámica de la infección por virus. Aun así, separar el tratamiento experimental de la infección de fondo también puede plantear desafíos. En estudios de campo, los investigadores han diferenciado cepas del virus del ala deformada (DWV) para proporcionar evidencia de la transmisión del virus de las abejas melíferas a los abejorros22, pero el uso de este enfoque sería difícil solo dentro de las abejas melíferas. Los clones infecciosos de virus son una herramienta poderosa, no solo para rastrear la infección 23,24,25, sino también para estudios de genética inversa de virus de abejas melíferas y para la investigación de la interacción virus-huésped 26,27,28. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los clones infecciosos todavía son necesarios para cumplir con el ciclo de infección dentro de las células para producir partículas. Tales partículas se prefieren como inóculo para tratamientos experimentales porque su infectividad es mayor que el ARN viral desnudo y la inoculación con genomas encapsidados imita una infección natural.
La producción de inóculos puros y no contaminados del virus de las abejas melíferas (cepas de virus de tipo silvestre o derivadas de clones infecciosos) también plantea desafíos. Estos se deben principalmente a las dificultades para obtener una línea celular de abeja melífera confiable, de replicación continua y libre de virus para producir virus de cepa pura29,30. Si bien se han producido algunas líneas celulares, estos sistemas siguen siendo imperfectos; Aún así, existe la esperanza de que se pueda producir una línea celular viable29, lo que permitiría un control más fino de la producción e investigación del virus. Hasta que dicha línea esté ampliamente disponible, la mayoría de los protocolos de producción de virus seguirán dependiendo del uso de la producción y purificación de virus in vivo 18,31,32,33,34. Estos enfoques implican identificar y purificar partículas de virus de interés (o producir un clon infeccioso) y usarlas para infectar a las abejas melíferas, generalmente como pupas. Las pupas se inyectan con el virus objetivo y luego se sacrifican, y se extraen y purifican más partículas. Sin embargo, debido a que ninguna abeja está libre de virus para empezar, siempre hay algún grado de contaminación por rastros de otros virus en cualquier concentrado de este tipo y, por lo tanto, se debe tener mucho cuidado al elegir abejas con una baja probabilidad de infecciones de fondo. Además, los métodos para eliminar las pupas de las células del peine para su uso en estos protocolos33 son muy laboriosos y pueden inducir estrés en las abejas, limitando la producción por estos medios18,32. Aquí, informamos un método alternativo que permite la eliminación a gran escala de larvas con poca mano de obra y menos estrés mecánico en las abejas.
Una vez que se obtienen las pupas y se inyectan con el inóculo del virus inicial, deben incubarse para proporcionar tiempo al virus para replicarse. Posteriormente, las partículas de virus producidas pueden procesarse en una forma utilizable para infectar abejas experimentales. Existen varios métodos simples para lograr esto, incluido el uso de un homogeneizado crudo35,36 o hemolinfa generada a partir de abejas infectadas viralmente como fuente de infección37. Estos métodos son efectivos, pero tienen una mayor probabilidad de introducir variables desconocidas del sustrato de fondo (por ejemplo, otros factores en los homogeneizados de las abejas muertas). Además, es deseable concentrar las partículas si un experimento requiere administrar una dosis grande y conocida de un virus en un corto período de tiempo. Por lo tanto, para un mejor control, es preferible utilizar métodos que permitan cierto nivel de purificación y concentración de las partículas del virus. En general, una serie de pasos de precipitación y centrifugación darán como resultado la eliminación de casi todo el posible material de virus no objetivo33.
Después de producir este inóculo concentrado, es beneficioso cuantificar los títulos virales (qPCR) y caracterizarlo con bioensayos in vivo para probar su viabilidad y capacidad de causar mortalidad, así como para corroborar que se obtienen títulos de virus aumentados después de la infección. Esto se puede lograr a través de experimentos de inyección (ya sea en pupas o adultos) o experimentos de alimentación (en larvas o adultos). Si bien todos estos enfoques son posibles, alimentar a grupos de abejas adultas en una jaula es a menudo lo más rápido y simple. El método de ensayo de jaula también se usa ampliamente para probar varios otros tratamientos en abejas, incluida la toxicidad por pesticidas38, el desarrollo deovarios 39 y la influencia nutricional en el comportamiento40,41 y, por lo tanto, puede formar una buena base para experimentos que vinculan la infección por virus con otros factores42.
Aquí describimos un método confiable para producir grandes cantidades de partículas de virus semipuras y altamente enriquecidas sin usar una costosa ultracentrífuga, incluido un método para eliminar pupas que reduce el trabajo de parto y el estrés mecánico en las abejas y un bioensayo altamente repetible y de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Al controlar estrechamente la pureza del inóculo viral, los investigadores pueden reducir la variación en la respuesta viral de las abejas melíferas en relación con otros métodos de inoculación viral. Además, el bioensayo puede detectar efectos virales a nivel de grupos pequeños utilizando unidades experimentales altamente repetibles antes de escalar a entornos realistas de campo, lo que es mucho más laborioso de manejar. En combinación, estos dos métodos proporcionan las herramientas necesarias para los estudios que pueden ayudar a mejorar nuestra comprensión general de las interacciones fisiológicas entre las abejas melíferas y los virus.

<table><tbody><tr>Solución <td></td><td></td><td></td>de <td>lejía al 10%</td></tr><tr><td>Cloroformo 24:1:Alcohol isoamílico</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td></td>de<td>etanol al 70%</td></tr><tr><td>Jaulas para bioensayo</td><td></td><td></td><td>Dependiendo de la configuración experimental</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf 30089405</td><td></td><td>Opcional (si no hay ropa inyectora disponible)</td></tr><tr><td>Recipientes para la autoextracción</td><td></td><td></td> de larvas <td>Deben medir aproximadamente 19" x 9-1/8" (dimensiones del marco profundo de Langstroth)</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td>Pinzas romas y blandas para la separación de larvas; Pinzas romas y duras para la escisión de la pupa</td></tr><tr><td>Incubadora</td> de campana <td></td><td></td><td></td>extractora</tr><tr><td></td> Capaz de mantener 34 &ordm;<td></td><td></td><td> C y 50% de humedad relativa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Cualquier toallita absorbente funcionará</td></tr><tr><td>Barcos</td><td></td><td></td> de tamaño medio <td>Sirven como bandejas de inóculo</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa con membrana Biomax</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td>de nitrilo</tr><tr><td>Fosfato solución salina tamponada (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> refrigerada de sobremesa <td>Capaz de 15.000 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> refrigerada <td>Capaz de 21.000 x g</td></tr><tr><td>Repetidor M4 Multipipeta</td><td>Eppendorf 4982000322</td><td></td><td>Opcional (si no hay aplicación de inyector disponible)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin ARNasa</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (apis mellifera)

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Las abejas melíferas son de gran importancia ecológica y agrícola en todo el mundo, pero también están sujetas a una variedad de presiones que afectan negativamente la salud de las abejas, incluida la exposición a patógenos virales. Tales virus pueden causar una amplia variedad de efectos devastadores y, a menudo, pueden ser difíciles de estudiar debido a múltiples factores que dificultan la separación de los efectos de los tratamientos experimentales de la infección de fondo preexistente. Aquí presentamos un método para producir en masa grandes cantidades de partículas de virus junto con un bioensayo de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Necesarias por la falta actual de una línea celular de abejas melíferas continua y libre de virus, las partículas virales se amplifican in vivo utilizando pupas de abejas melíferas, que se extraen de la colmena en grandes volúmenes utilizando una metodología mínimamente estresante. Estas partículas de virus se pueden usar en bioensayos de jaulas de abejas melíferas para probar la viabilidad de los inóculos, así como varias otras dinámicas de infección por virus, incluidas las interacciones con la nutrición, los pesticidas y otros patógenos. Una ventaja importante del uso de tales partículas es que reduce en gran medida las posibilidades de introducir variables desconocidas en la experimentación posterior en comparación con las alternativas actuales, como la infección a través de la hemolinfa de abeja infectada u homogeneización, aunque aún se debe tener cuidado al obtener las abejas, para minimizar la contaminación del virus de fondo. Los ensayos en jaulas no son un sustituto de los experimentos a gran escala y realistas en el campo que prueban los efectos de la infección por virus a nivel de colonia, sino que funcionan como un método para establecer respuestas virales de referencia que, en combinación con las partículas de virus semipuras, pueden servir como herramientas importantes para examinar varias dimensiones de las interacciones fisiológicas entre la abeja melífera y el virus.

Seguir con éxito los protocolos (Figuras 1) para la inyección de pupas y la extracción viral debe producir grandes cantidades de partículas de virus. Sin embargo, el muestreo y la inyección de pupas procedentes de una variedad de colonias en múltiples puntos de tiempo maximiza las posibilidades de adquirir el virus objetivo con baja contaminación. La dinámica por la cual los virus se replican e interactúan entre sí dentro de una abeja melífera no se entiende bien; junto con la probabilidad de infección p...

Aquí describimos dos protocolos: primero para propagar, extraer, purificar y cuantificar grandes cantidades de partículas de virus no envueltas de abejas melíferas, incluido un método para eliminar las pupas de abejas melíferas y segundo para probar los efectos de la infección viral utilizando un bioensayo de jaula altamente repetible y de alto rendimiento.

Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Nuestro protocolo demuestra cómo producir partículas del virus de las abejas melíferas en masa para su uso en bioensayos controlados de alto rendimiento para la detección rápida de la eficacia del tratamiento viral. El ensayo utiliza pupas de abeja fáciles de cultivar en lugar de cultivo celular, lo que reduce el trabajo de obtener sujetos experimentales. A continuación, el virus puede utilizarse para producir curvas de mortalidad predecibles y bioensayos repetibles.Ha habido un interés sustancial en comprender cómo los llamados virus de las abejas melíferas afectan a una gama más amplia de huéspedes. Esta técnica de producción de virus se puede emparejar con otros sistemas de polinizadores para probar la infectividad. Para la extracción masiva de abejas por autoeliminación de larvas, enjaula a una abeja melífera reina en un marco Langstroth vacío y prolongado y devuélvala a su colonia.Después de permitir que la reina ponga huevos en el marco durante 24 horas, revise el marco para asegurarse de que la mayoría de las celdas del panal contengan huevos recién puestos y libere a la reina. Exactamente 192 horas después de enjaular a la reina, retire el marco de la colonia y cepille las

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se demuestra cómo implementar un método de farmacología del comportamiento en un paradigma de condicionamiento apetitivo olfativo de las abejas (Apis mellifera) mediante la aplicación sistémica de fármacos. Este método permite la investigación de los mecanismos de aprendizaje subyacente y formación de la memoria de una manera sencilla y fiable.

Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.

Propagación de<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; A través de<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultivo Celular

Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes - una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.

Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino

Consorcios microbianos en las colmenas de la abeja bumble enriquecen y conservan el polen para las larvas de abeja. Utilizando la siguiente secuencia de generación, junto con laboratorio y experimentos en el campo, este manuscrito describe protocolos utilizados para probar la hipótesis de que residuos del fungicida alteran el microbioma del polen y datos demográficos de la Colonia, en última instancia conduce a la Colonia pérdida.

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

Este manuscrito describe varios protocolos para la administración de agentes farmacológicos para las abejas, incluyendo métodos no invasivos simples para las abejas de vuelo libre, así como variantes más invasivos que permiten el tratamiento localizado precisa de abejas restringidos.

La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel,<em&gt; Apis mellifera</em

El presente artículo presenta   un método para alimentar pesticida alimentos contaminados tanto a una abeja de la miel individual y una colonia de colmena. El procedimiento se evalúa el efecto de pesticidas en las abejas individuales por la alimentación in vivo de la dieta básica de larvas y también en la condición natural de la colonia de colmena.

Evaluar el efecto de sustancias químicas ambientales en la miel de abeja Desarrollo de la colonia individual a nivel

Dosis subletales de pesticidas pueden afectar a colonias en maneras que son difíciles de detectar utilizando sólo métodos periódicos o visuales. Métodos para medir la masa total de abeja adulta, cría y recursos alimenticios pesaje colmenas y partes de la colmena, fotografiando marcos e instalando sensores, se proporcionan. También se aborda el análisis de datos.

Controles Colonia efectos de exposición a los pesticidas subletales en las abejas de miel

Este protocolo fue desarrollado para mejorar la comprensión de cómo los agroquímicos afectan la reproducción de lasabejas melíferas (Apis mellifera)mediante el establecimiento de métodos para exponer a las reinas de las abejas melíferas y sus cuidadores trabajadores a los agroquímicos en un entorno controlado y de laboratorio y monitoreando cuidadosamente sus respuestas relevantes.

Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Esta metodología, que incluyó la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica, podría evaluar eficazmente la influencia de las barreras del intestino medio y/o de las glándulas salivales en la infección por arbovirus.

Infección viral experimental en mosquitos adultos por alimentación oral y microinyección

Aprende a preparar partículas virales de abejas melíferas para bioensayos de alta eficiencia utilizando pupas de Apis mellifera. Este método simplifica el estudio de infecciones virales y permite evaluar tratamientos contra virus como el de parálisis aguda israelí.

Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)

Explorar más videos