Microscopía de Fuerza Atómica Combinada con Espectroscopía Infrarroja como Herramienta para Sondear Química de Bacteria Única

El método permite realizar estudios a nanoescala de bacterias. Nos proporciona una visión detallada de las alteraciones químicas en la resistencia a los antimicrobianos. Por lo tanto, puede contribuir a nuestra comprensión de la resistencia a los antimicrobianos y el desarrollo de fármacos.

El tamaño a nanoescala de las bacterias limita significativamente las herramientas de investigación disponibles capaces de sondear su química. AFM-IR nos permite hacerlo de una manera no destructiva, independiente del observador, incluso a nivel subcelular. Al proporcionar información sobre la resistencia a los antimicrobianos, el método puede ayudar a identificar y probar objetivos moleculares para nuevos antimicrobianos.

Además de las bacterias, AFM-IR puede sondear una variedad de células, tejidos e incluso virus. Para preparar una muestra para la obtención de imágenes AFM-IR, después de cultivar las bacterias de interés en el medio apropiado en las condiciones de cultivo adecuadas, use un asa estéril para recoger cuidadosamente las bacterias de la parte superior de las colonias para transferirlas a un tubo de vidrio. Agregue un mililitro de agua ultrapura al tubo y al vórtice durante uno o dos minutos hasta que la bolita bacteriana recolectada ya no sea visible en el fondo del tubo.

Estime la turbidez aproximada de la solución mediante una comparación visual entre la solución preparada y los estándares de McFarland. Si la turbidez de la suspensión bacteriana parece ser muy baja, continúe agregando más bacterias y hasta que la turbidez aproximada de la solución sea comparable a los estándares de McFarland de 0,5 y 1. Granular las bacterias por centrifugación y aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.

Vuelva a suspender el gránulo de células bacterianas en un mililitro de agua ultrapura con vórtice y sedimente las bacterias con otra centrifugación. Después de lavar las bacterias hasta tres veces más, como se acaba de demostrar, aspire el sobrenadante y agite el pellet durante al menos dos minutos antes de agregar cinco microlitros de células al sustrato experimental. Si el espesor deseado es una monocapa o bacterias individuales, inmediatamente después de depositar, agregue entre 20 y 100 microlitros de agua ultrapura al sustrato y mezcle suavemente la solución con la punta de una pipeta.

Cuando la muestra se haya secado al aire, utilice cinta adhesiva de doble cara para montar el sustrato en un disco de muestra metálico AFM. Para preparar el instrumento de espectroscopia AFM-IR para un análisis, presione Inicializar después de encender el software y el láser y confirme que el obturador láser esté en la posición abierta. Durante este proceso, aparecerá la ventana de inicialización de la etapa.

Cuando finalice el proceso de inicialización, haga clic en Inicializar y en Aceptar. Si es posible, abra el flujo de nitrógeno para purgar el instrumento con nitrógeno y ajuste la purga de nitrógeno para lograr un nivel de humedad estable. Con cuidado, coloque la muestra en la cámara de muestras sin dañar la punta y haga clic en Cargar en el software. Siga el asistente para cargar la muestra, centrándose en la punta y en la muestra en cada paso.

A continuación, haga clic en Enfoque para acercarse a la muestra sin interactuar. Antes de utilizar la muestra, seleccione Herramientas, Calibración de fondo IR y Nuevo. En la ventana emergente, establezca la resolución y el rango espectral de acuerdo con el objetivo del análisis y establezca los copromedios y los fondos en valores promedio.

Seleccione Habilitar. En la ventana emergente, establezca los parámetros de inicio y fin y haga clic en Aceptar y adquirir. Cuando se hayan adquirido los datos en segundo plano, haga clic en Guardar.

Para conectar la punta con la muestra, haga clic en Activar. El sistema se acercará a la superficie de la muestra hasta que se detecte el contacto directo. Haga clic en Escanear para capturar una imagen AFM inicial de área más grande y baja resolución espacial para visualizar la superficie antes de mover la punta a un punto de medición de interés.

Para alinear el láser infrarrojo con un número de onda en el que la muestra absorberá, ingrese el número de onda en el que la muestra absorberá en el campo Número de onda y haga clic en Iniciar IR.At se debe observar al menos un pico claro en el gráfico de amplitud frente a frecuencia. El gráfico de deflexión frente al tiempo debe mostrar una forma de onda periódica. Haga clic en Optimizar para seleccionar un espectro de bacterias infrarrojas convencional para identificar las posiciones de las bandas y utilice el espectro para optimizar los puntos calientes en varios valores de número de onda de varias regiones espectrales.

Cuando se hayan optimizado los puntos infrarrojos para los valores de número de onda seleccionados, defina la resolución espectral y el rango y el número de copromedios y haga clic en Adquirir para recopilar el espectro AFM-IR. Para capturar una imagen de distribución de intensidad para un valor de número de onda seleccionado, después de grabar un solo espectro AFM-IR, grabe una imagen AFM del área de muestra seleccionada y seleccione los valores del número de onda para las imágenes AFM-IR. Confirme que el punto IR del láser se ha optimizado para los valores de número de onda seleccionados y establezca el número de puntos de datos en las direcciones X e Y del área de la imagen.

En la ventana General, establezca la potencia del láser. En la ventana AFM Scan, defina la velocidad de escaneo. A continuación, marque la casilla Habilitar imágenes IR y haga clic en Escanear para comenzar la obtención de imágenes.

El AFM-IR de la intensidad de la señal en el número de onda seleccionado se recogerá simultáneamente con los datos de AFM de esa zona. Este protocolo permite la adquisición de una variedad de tipos de distribuciones celulares de bacterias en un sustrato, desde células individuales hasta monocapas y multicapas. El protocolo se puede utilizar para monitorear los cambios dinámicos en bacterias vivas.

Por ejemplo, en la formación de un tabique durante la división celular de S. aureus. El espectro AFM-IR del tabique se caracterizó por una mayor intensidad relativa de las bandas a 1.240 y 1.090 centímetros en comparación con los espectros AFM-IR recogidos en el área celular, lo que sugiere que el tabique está formado por grupos de carbohidratos y fosfodiéster de los componentes de la pared celular. El protocolo también se puede utilizar para estudiar las diferencias en la composición química que surgen del desarrollo de resistencia.

Como se observó en este análisis representativo, no se midieron diferencias morfológicas entre la resistencia intermitente a la vancomicina y las células de S. aureus susceptibles a la vancomicina. Sin embargo, la evaluación de los espectros AFM-IR y sus segundos derivados reveló un claro aumento en la intensidad relativa de las bandas asociadas con los grupos carbohidratos y fosfodiéster de los componentes de la pared celular en la cepa resistente en comparación con la contraparte susceptible. Es importante preparar una muestra limpia, así que tenga cuidado de reducir la contribución del medio desde el principio y de eliminarla por completo de múltiples lavados.

Dado que la AFM-IR es una técnica no destructiva, la muestra puede estudiarse posteriormente con otras técnicas, como la tinción o la espectroscopia iónica confocal, que pueden proporcionar información complementaria sobre su química.