Name: MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende la tecnología MAPS para identificar el targetoma de ARN reguladores en bacterias Gram-positivas mediante purificación por afinidad MS2 y secuenciación. Este método revela redes regulatorias de sRNA involucradas en virulencia y supervivencia bacteriana.

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Este trabajo fue apoyado por la "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, y ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). También se ha publicado en el marco del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 y de ANR-17-EURE-0023 (a PR), como financiación del estado gestionado por ANR como parte de las inversiones para el futuro programa. DL recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 753137-SaRNAReg. El trabajo en E. Massé Lab ha sido apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Subvención R01 GM092830-06A1 del Equipo de los Institutos Nacionales de Salud de los NIH.

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<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo modificado para bacterias Gram-positivas El protocolo inicial de MAPS se desarrolló para estudiar el sRNA interactoma en el organismo modelo E. coli20,30. Aquí, se describe un protocolo modificado que es adecuado para la caracterización de las redes reguladoras dependientes de ARN en el patógeno humano oportunista S. áureo y es ciertamente transponible a otras bacterias Gram-positivas, patógenos o no.
<p clas...

Cientos, quizás incluso miles de pequeños ARN reguladores (ARNs) se han identificado en la mayoría de los genomas bacterianos, pero las funciones de la gran mayoría de ellos permanecen sin caracterizar. En general, los ARNs son moléculas cortas no codificantes, que desempeñan un papel importante en la fisiología bacteriana y la adaptación a entornos fluctuantes1,2,3. De hecho, estas macromoléculas están en el centro de numerosas redes reguladoras intrincadas, impactando las vías metabólicas, las respuestas al estrés, pero también la virulencia y la resistencia a los antibióticos. Lógicamente, su síntesis es desencadenada por estímulos ambientales específicos (por ejemplo, hambre de nutrientes, estrés oxidativo o de membrana). La mayoría de los sRNAs regulan múltiples ARNm diana a nivel post-transcripcional a través de emparejamiento de bases corto y no contiguo. Por lo general, impiden la iniciación de la traducción compitiendo con los ribosomas para las regiones de iniciación de la traducción4. La formación de sRNA: dúplex de ARNm también a menudo resulta en la degradación activa del ARNm objetivo mediante el reclutamiento de ARN específicas.
La caracterización de un sRNA targetome (es decir, el conjunto completo de sus ARN diana) permite la identificación de las vías metabólicas en las que interviene y la señal potencial a la que responde. En consecuencia, las funciones de un sRNA específico generalmente se pueden inferir de su targetoma. Para ello, se han desarrollado varias herramientas de predicción in silico como IntaRNA y CopraRNA5,6,7. En particular, se basan en la complementariedad de la secuencia, la energía de emparejamiento y la accesibilidad del sitio de interacción potencial para determinar los supuestos socios de sRNA. Sin embargo, los algoritmos de predicción no integran todos los factores que influyen en el emparejamiento de bases in vivo, como la implicación de las chaperonas de ARN8 favoreciendo interacciones subóptimas o la coexpresión de ambos socios. Debido a sus limitaciones inherentes, la tasa de falsos positivos de las herramientas de predicción sigue siendo alta. La mayoría de los enfoques experimentales a gran escala se basan en la co-purificación de las parejas de ARNm:ARNm que interactúan con una proteína de unión a ARN marcada (RBP)6,9. Por ejemplo, el método de interacción de ARN por ligadura y secuenciación (RIL-seq) identificó dúplex de ARN co-purificados con chaperonas de ARN como Hfq y ProQ en Escherichia coli10,11. Una tecnología similar llamada RETICULADO UV, Ligadura y Secuenciación de Híbridos (CLASH) se aplicó a la ARNasa E- y Hfq asociados a sRNAs en E. coli12,13. A pesar de los papeles bien descritos de Hfq y ProQ en la regulación mediada por sRNA en múltiples bacterias8,14,15,la regulación basada en ARN parece ser independiente de la chaperona de ARN en varios organismos como S. aureus16,17,18. Incluso si la purificación de los dúplex de ARN en asociación con RNases es factible como lo demuestran Waters y sus compañeros de trabajo13,esto sigue siendo complicado ya que las RNases desencadenan su rápida degradación. Por lo tanto, el enfoque de purificación de MS2-afinidad junto con la secuenciación de ARN (MAPS)19,20 constituye una alternativa sólida en tales organismos.
A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, MAPS utiliza un sRNA específico como cebo para capturar todos los ARN que interactúan y, por lo tanto, no depende de la participación de un RBP. Todo el proceso se representa en la Figura 1. En resumen, el sRNA está etiquetado en el 5' con el aptámero de ARN MS2 que es específicamente reconocido por la proteína de la capa MS2. Esta proteína se fusiona con la proteína de unión a la maltosa (MBP) para ser inmovilizada en una resina de amilosa. Por lo tanto, MS2-sRNA y sus socios del ARN se conservan en la columna de la cromatografía de la afinidad. Después de la elución con maltosa, los ARN co-purificados se identifican mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento seguida de análisis bioinformáticos (Figura 2). En última instancia, la tecnología MAPS dibuja un mapa de interacción de todas las interacciones potenciales que ocurren in vivo.
La tecnología MAPS se implementó originalmente en la bacteria Gram-negativa no patógena E. coli21. Cabe destacar que MAPS ayudó a identificar un fragmento derivado del ARNt que interactúa específicamente con los sRNAs de RyhB y RybB y previene cualquier ruido transcripcional de ARN para regular los objetivos de ARNm en condiciones no inductoras. A partir de entonces, MAPS se ha aplicado con éxito a otros ARNs de E. coli como DsrA22,RprA23,CyaR23 y GcvB24 (Tabla 1). Además de confirmar objetivos previamente conocidos, MAPS extendió el targetome de estos sRNAs bien conocidos. Recientemente, MAPS se ha realizado en Salmonella Typhimurium y reveló que el sRNA SraL se une al ARNm rho, codificando para un factor de terminación de la transcripción25. A través de este emparejamiento, SraL protege rho mRNA de la terminación prematura de la transcripción desencadenada por Rho sí mismo. Curiosamente, esta tecnología no se limita a los ARNs y se puede aplicar a cualquier tipo de ARN celulares como se ejemplifica mediante el uso de un fragmento derivado del ARNt26 y una región 5'-no traducida del ARNm22 (Tabla 1).
El método MAPS también se ha adaptado a la bacteria grampositiva patógena S. aureus19. Específicamente, el protocolo de lisis ha sido ampliamente modificado para romper eficientemente las células debido a una pared celular más gruesa que las bacterias Gram-negativas y para mantener la integridad del ARN. Este protocolo adaptado ya desentrañó el interactoma de RsaA27,RsaI28 y RsaC29. Este acercamiento dio penetraciones en el papel crucial de estos sRNAs en mecanismos reguladores de las propiedades de la superficie de la célula, de la absorción de la glucosa, y de las respuestas oxidativas de la tensión.
El protocolo desarrollado e implementado en E. coli en 2015 ha sido descrito recientemente con gran detalle30. Aquí, proporcionamos el protocolo MAPS modificado, que es particularmente adecuado para el estudio de redes reguladoras de ARN en bacterias Gram-positivas (pared celular más gruesa) ya sean no patógenas o patógenas (precauciones de seguridad).

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>cantidad y calidad de</td></tr><tr><td>ARN Matraz de cultivo de 250 mL</td><td>Dominique Dutscher</td><td>2515074</td><td>Bacterial cultivos</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml Falcon</td><td></td><td>352051</td><td>Centrifugación de cultivos</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Extracción y purificación de ARN</td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Peletización bacteriana</td></tr><tr><td>Ampicilina (amp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G Medio de</td><td>crecimiento</td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>Nuevo Inglaterra BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2-purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Anti-dioxigenina AP Fragmento Fab</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Cassette de autorradiografía</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Ensayos de Northern</td></tr><tr><td>blot BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>Caldo</td> <td>BHI (Brain Heart Infusion)Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>Medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>Ensayos de Northern blot (sustrato)</td></tr><tr><td>Centrífuga 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Extracción y purificación de ARN</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>Extracción de ARN y purificación</td></tr><tr><td>Mezcla de marcaje DIG-RNA</td><td>Sigma-Aldrich 11277073910</td><td></td><td>Northern blot Ensayos</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td> tratamiento con <td>DNasa</td></tr><tr><td>Eritromicina (ery)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>Medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Dispositivo FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>Lisis mecánica</td></tr><tr><td>Tiocianato</td> <td>de guanidioSigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Hibridación Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Tubos de hibridación</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/6960/08</td><td>Extracción y purificación de ARN</td></tr><tr><td>LB (Caldo de lisogén)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>Medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Lysing Matrix B Bulk</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>Lisis mecánica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>Dispositivo de agua Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Agua ultrapura</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>ARN/ADN cantidad y calidad</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Dominique Dutsher</td><td>10600002</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>Limpieza y descontaminación</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Carl Roth</td><td>38.2</td><td>Extracción y purificación de ARN</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>Producción MS2-MBP</td></tr><tr><td>Columna de cromatografía Poly-Prep</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2 Purificación por afinidad</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td>cantidad de ARN</td></tr><tr><td>Solución RNAPro</td><td>MP Biomedicals 6055050</td><td></td><td>Lisis mecánica</td></tr><tr><td>Kit completo ScriptSeq</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>Preparación de bibliotecas de ADNc</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Genesys 20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>Cultivos</td></tr><tr><td>bacterianos Dispositivo de vacío SpeedVac Savant ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>DNA120</td><td>Extracción y purificación de ARN</td></tr><tr><td>Stratalinker Reticulante UV 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>ADN ligasa T4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borato-EDTA)</td><td>Euromedex</td><td>ET020-C Ensayos de</td><td>Northern blot</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Procesador de película de rayos X</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr><tr><td>Películas de rayos X Super RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>Ensayos de Northern blot</td></tr></tbody></table>

ms2-afinidad purificación junto con la secuenciación de arn en bacterias gram-positivas

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Aunque los pequeños ARN reguladores (ARNs) están muy extendidos entre el dominio bacteriano de la vida, las funciones de muchos de ellos siguen estando mal caracterizadas, en particular debido a la dificultad de identificar sus dianas de ARNm. Aquí, se describe un protocolo modificado de la purificación ms2-afinidad junto con la tecnología de secuenciación de ARN (MAPAS), con el objetivo de revelar todos los socios de ARN de un sRNA específico in vivo. En términos generales, el aptámero MS2 se fusiona con la extremidad 5' del sRNA de interés. Esta construcción se expresa entonces in vivo, permitiendo que el MS2-sRNA interactúe con sus socios celulares. Después de la recolección bacteriana, las células se lisan mecánicamente. El extracto crudo se carga en una columna de cromatografía a base de amilosa previamente recubierta con la proteína MS2 fusionada con la proteína de unión a la maltosa. Esto permite la captura específica de MS2-sRNA y de los ARN que obran recíprocamente. Después de la elución, los ARN co-purificados se identifican mediante la secuenciación de ARN de alto rendimiento y el posterior análisis bioinformático. El siguiente protocolo se ha implementado en el patógeno humano Gram-positivo Staphylococcus aureus y es, en principio, transponible a cualquier bacteria Gram-positiva. En resumen, la tecnología MAPS constituye un método eficiente para explorar profundamente la red reguladora de un sRNA en particular, ofreciendo una instantánea de todo su targetome. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los supuestos objetivos identificados por MAPS todavía necesitan ser validados por enfoques experimentales complementarios.

Los resultados representativos se originan en el estudio del targetome rsaC en S. aureus29. RsaC es un sRNA no convencional de 1.116 nt-long. Su extremo 5' contiene varias regiones repetidas, mientras que su extremo 3' (544 nt) es estructuralmente independiente y contiene todos los sitios de interacción predichos con sus objetivos de ARNm. La expresión de este sRNA se induce cuando el manganeso (manganeso) es escaso, que se encuentra a menudo en el contexto de la inmunorespuesta del anfit...

La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.

MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

La purificación de la afinidad MS2 acoplada con la secuenciación del ARN o los MAPAS se ha desarrollado para identificar el targetome entero de cualquier ARN de interés en bacterias. Esta tecnología permite identificar cualquier tipo de socios de sRNA independientemente del mecanismo de regulación. La caracterización de las redes reguladoras dependientes del ARN ayudará a comprender mejor la producción de factores de virulencia, la formación de biopelículas y la supervivencia de las bacterias dentro de las células huésped y, en última instancia, a luchar contra las infecciones estafilocócicas.Este protocolo se puede aplicar a cualquier bacteria grampositiva patógena o no patógena. Demostrando el procedimiento estará Noemie Mercier, una estudiante de doctorado del laboratorio del Dr.Pascal Romby. Para comenzar, crezca una colonia de cepas portadoras de plásmidos pCN51 P3 MS2 sRNA o pCN51 P3 MS2 en tres mililitros de medio BHI suplementados con 10 microgramos por microlitro eritromicina en duplicados.Diluir cada cultivo nocturno en 50 mililitros de medio BHI fresco suplementado con eritromicina para alcanzar un OD 600 de 0,05. Cultivar los cultivos a 37 grados Centígrados con agitación a 180 RPM durante seis horas. Transfiera cada cultivo a un tubo centrífuga de 50 mililitros y centrífuga los tubos a 2, 900 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, luego deseche el sobrenadante, congele y guárdelos a menos 80 grados Celsius o mantenga los pellets en el hielo y realice directamente la lisis mecánica de las células.Para realizar la lisis celular mecánica, resuspend pellets en cinco mililitros de tampón A y transferir las células resuspended a 15 tubos de centrífuga mililitros con 3,5 gramos de perlas de sílice. Inserte los tubos en un instrumento mecánico de lisis celular y ejecute un ciclo de 40 segundos a cuatro metros por segundo. Centrifugar los tubos a 2, 900 veces G durante 15 minutos, luego recuperar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.Asegúrese de que el sobrenadante esté claro, repitiendo la centrifugación si no lo está. Retire la punta de la columna, luego coloque una columna de cromatografía en un estante de columna y lave la columna con agua ultrapura. Añadir 300 microlitros de resina de amilosa y lavar la columna con 10 mililitros de tampón A.Diluir 1, 200 picamoles de proteína MBP-MS2 en seis mililitros de tampón A y cargarlo en la columna.Lave la columna con 10 mililitros de tampón A.Next, realice la purificación de afinidad MS2. Cargue el lysate de la célula en la columna y recoja la fracción del flujo-a través en un tubo limpio de la colección. Lave la columna tres veces con 10 mililitros de tampón A y recoja la fracción de lavado, luego eluda la columna con un mililitro de tampón E y recoja la fracción de elución en un microtubo de dos mililitros.Mantenga todas las fracciones recolectadas en hielo hasta la extracción de ARN. Utilice un mililitro de cada fracción para la extracción de ARN. Agregue un volumen de fenol al ARN y mezcle vigorosamente, luego centrifugue la mezcla a 16, 000 veces G durante 10 minutos a 20 grados Celsius.Transfiera la fase superior a un microtubo limpio de dos mililitros. Agregue un volumen de alcohol isoamilo de cloroformo y repita la centrifugación, luego transfiera la fase superior a un nuevo tubo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% frío y 0,1 volúmenes de tres molares de acetato de sodio a pH 5,2 y precipitar durante la noche a menos 20 grados centígrados.Al día siguiente, centrífuga los tubos durante 15 minutos a 16,000 veces G y cuatro grados Centígrados. Retire lentamente el etanol con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Añadir 500 microlitros de etanol frío al 80% y centrífuga durante cinco minutos.Deseche el etanol pipeteándolo lentamente, luego seque el pellet usando un concentrador de vacío durante cinco minutos en modo de carrera. Resuspend el pellet en un volumen apropiado de agua ultrapura. Este protocolo fue utilizado para estudiar el targetome de RsaC en S.aureus.Varios ARNm que interactúan directamente con RsaC se identificaron utilizando la tecnología MAPS, revelando su papel crucial en el estrés oxidativo y las respuestas relacionadas con el metal. Para confirmar las construcciones del sRNA MS2 y visualizar su patrón de la expresión, las células fueron cosechadas después de dos, cuatro, y seis horas de crecimiento en medio de BHI. El ARN fue extraído y el análisis norteño de la mancha blanca /negra fue realizado usando la punta de prueba RsaC-específica del DIG.El nivel de RsaC endógeno aumentó perceptiblemente después de seis horas de crecimiento. Es importante destacar que el nivel de MS2-RsaC 544 y MS2-RsaC 1, 116 fueron comparables a RsaC endógeno a las seis horas. La purificación de la afinidad fue realizada y los RNAs fueron extraídos del extracto crudo, del flujo-a través, y de las fracciones de la elución en la tensión del salvaje-tipo que expresaba la etiqueta MS2 solamente y la tensión mutante de RsaC que expresaba la construcción de MS2-RsaC 544.El RsaC endógeno de 1,116 nucleótidos largos se enriqueció en la fracción de elución, pero interactuó no específicamente con la columna de afinidad debido a su longitud y estructura secundaria compleja. El MS2-RsaC 544 fue enriquecido altamente en la fracción de elución demostrando que fue retenido con éxito por la proteína de fusión MS2-MBP. Un análisis bioinformático reveló blancos supuestas del mRNA según el cambio del doblez entre el sRNA MS2 y el control MS2, indicando que el sodA era la primera blanco supuesta.Un análisis norteño de la mancha blanca /negra realizó la punta de prueba sodA-específica del DIG después de la purificación de MS2-affinity muestra que el sodA co-enriquecido eficientemente con MS2-RsaC 544 comparado al control MS2. Al intentar este protocolo, tenga presente que la adición de la etiqueta MS2 puede afectar a la confirmación, estabilidad, o función del sRNA. Esto debe ser monitoreado cuidadosamente.MAPS proporciona una instantánea del emparejamiento de objetivos de ARN-ARN. La validación experimental adicional desentrañará su función. Esta técnica representa una herramienta poderosa para construir redes reguladoras de sRNA en cualquier bacteria.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Un ARN ribosómico (ARNr) de protocolo agotamiento fue desarrollado para enriquecer el ARN mensajero (ARNm) de ARN-ss de la metatranscriptome intestino del mosquito. Sondas de muestreo específicos rRNA, que fueron utilizados para extraer el rRNA mediante sustracción, se crea a partir del mosquito y sus microbios intestinales. Rendimiento del protocolo puede resultar en la eliminación de aproximadamente el 90-99% de rRNA.

El agotamiento de ARN ribosomal de metagenómica intestino del mosquito RNA-seq

La caracterización de la comunidad microbiana ha sido un objetivo de larga data en microbiología ambiental. Los métodos de secuenciación de próxima generación ahora permiten la caracterización de comunidades microbianas a una profundidad sin precedentes con un costo y mano de obra mínimos. Detallamos aquí nuestro enfoque para secuenciar genes de ARN ribosómico 16S bacterianos utilizando un secuenciador de sobremesa.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) y las técnicas moleculares (secuenciación del gen 16S rRNA) permiten la identificación de patógenos bacterianos raros en diagnósticos rutinarios. El objetivo de este protocolo radica en la combinación de ambas técnicas que conduce a datos más precisos y confiables.

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprende la tecnología MAPS para identificar el targetoma de ARN reguladores en bacterias Gram-positivas mediante purificación por afinidad MS2 y secuenciación. Este método revela redes regulatorias de sRNA involucradas en virulencia y supervivencia bacteriana.

MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

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