Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

La sensibilidad de la espectroscopia de RMN MAS asistida por DNP nos permite caracterizar proteínas dentro de células intactas en su concentración endógena. Esta aplicación requiere un manejo cuidadoso de las muestras. Algunas morfologías conservadas y células son viables cuando se transfieren criogénicamente al espectrómetro utilizando este protocolo.

La introducción del rotor frío puede causar acumulación de humedad y hielo, lo que puede evitar mecánicamente que la muestra gire. Esta demostración guiará los experimentos para realizar la transferencia criogénica con confianza. Para comenzar, coloque un cojín hecho con un trozo de pañuelo de papel o toalla de papel debajo de la tapa y en el fondo del vial criogénico.

Coloque el rotor de zafiro de 3,2 milímetros en el vial criogénico acolchado con el papel de seda, con el extremo marcado hacia la parte inferior del vial. Congele lentamente el rotor colocando el vial en un recipiente de enfriamiento de velocidad controlada y coloque el recipiente en un congelador a 80 grados centígrados durante un mínimo de tres horas. Transfiera el vial criogénico que contiene el rotor congelado a un pequeño matraz de vacío lleno de nitrógeno líquido.

Utilice el matraz de vacío para transportar la muestra a la instalación del espectrómetro. Llene un matraz de vacío de espuma de boca ancha, seco y con aislamiento térmico con 500 mililitros por litro de nitrógeno líquido. Tome el vial criogénico del matraz de transferencia y sujételo justo por encima de la superficie del nitrógeno líquido para protegerlo de la atmósfera.

Mientras sostiene el vial criogénico con la boca del vial apuntando ligeramente hacia abajo, desenrosque la tapa y deje que el rotor se deslice en el baño de nitrógeno líquido. Enfríe previamente un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sumergiéndolo en el nitrógeno líquido. Debajo de la superficie del baño de nitrógeno líquido, use pinzas para transferir el rotor al tubo de microcentrífuga con la punta de accionamiento hacia la parte inferior del tubo y las marcas hacia la abertura.

Use pinzas para sujetar el tubo que contiene el rotor bajo nitrógeno líquido por el cuello. Con un segundo par de pinzas, sostenga el recogedor de muestras de RMN por encima de la superficie del nitrógeno líquido inclinado en un ángulo agudo con respecto al tubo de microcentrífuga. Para transferir el rotor del receptor de muestras de RMN al espectrómetro de RMN, coloque el gabinete criogénico en modo de expulsión presionando expulsar.

Inserte el extremo abierto del recogedor de muestras de RMN en el tubo de microcentrífuga mientras aún está debajo de la superficie del nitrógeno líquido. Levante tanto el tubo de microcentrífuga como el recogedor de muestras de RMN para permitir que el rotor caiga en el colector de muestras. Agite el recogedor de muestras y el tubo si el rotor se atasca en el borde.

Deje el tubo de microcentrífuga vacío en la parte superior del recogedor de muestras de RMN para proteger el rotor del aire. Retire el otro recogedor de muestras vacío de la sonda y colóquelo en el suelo. Transfiera el recogedor de muestras de RMN que contiene el rotor a la otra mano.

A continuación, retire el tubo de microcentrífuga e insértelo inmediatamente en la sonda. Indique a la persona que opera el gabinete criogénico que presione detener, expulsar e insertar. Gire la muestra a la velocidad de rotación deseada ajustando el rodamiento y la presión de flujo de accionamiento.

Vierta 500 mililitros en un litro de nitrógeno líquido en un matraz de vacío de espuma de boca ancha y coloque el baño debajo del espectrómetro. Sumerja el frasco criogénico vacío que contiene un trozo de papel de seda en el baño de nitrógeno líquido. Reduzca la velocidad de giro a cero kilohercios disminuyendo el flujo de gas impulsor y del cojinete, y expulse el rotor cambiando al modo de expulsión.

Mientras mantiene activado el modo de expulsión, retire el recogedor de muestras de la sonda y deje caer el rotor directamente en el matraz de espuma de boca ancha que contiene nitrógeno líquido. Con pinzas preenfriadas, transfiera el rotor al vial criogénico preenfriado debajo de la superficie del nitrógeno líquido. Enfríe previamente la tapa del vial criogénico sumergiéndola en nitrógeno líquido.

Retire el vial que contiene el rotor y el nitrógeno líquido del baño y tape el tubo con la tapa preenfriada. Vuelva a sumergir el vial criogénico en nitrógeno líquido. La muestra puede transferirse a un almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo o desembalarse inmediatamente para su posterior análisis.

La inserción criogénica de muestras precongeladas de células de mamíferos en el espectrómetro de RMN respalda la viabilidad durante todo el experimento de RMN. Usando este protocolo, la permeabilidad al azul de tripano de las células de mamíferos después de la RMN MAS es similar a la de las células no expuestas a ningún cambio de temperatura. Si las células se congelan lentamente, luego se calientan a temperatura ambiente antes de la inserción, la viabilidad celular disminuye a menos del 10%Mientras tanto, la inserción criogénica de muestras congeladas de células de mamíferos apoya la viabilidad celular durante todo el experimento de RMN.

Al intentar hacer el protocolo, solicite ayuda presionando expulsar y girando la muestra para que la muestra pueda introducirse en la sonda antes de que se caliente, asegurándose de que no se introduzca humedad en la sonda con la seguridad de que el espectrómetro funcionará frío durante muchas semanas. Este protocolo es aplicable a cualquier sistema en el que las fluctuaciones de temperatura puedan comprometer la integridad de la muestra, como las reacciones de enfriamiento por congelación o la caracterización de la enzimología de los intermedios de reacción atrapada y el plegamiento de proteínas.