Microscopía 4D: Desentrañando el desarrollo embrionario de Caenorhabditis elegans usando Microscopía Nomarski

La microscopía 4D es una herramienta valiosa para reconstruir el linaje celular completo del embrión de C. elegans o de cualquier otro espécimen a nivel de célula individual. La óptica de Nomarski se puede utilizar para resaltar los cambios en la forma de las células durante el desarrollo con un microscopio estándar y luz transmitida sin necesidad de animales transgénicos o microscopía de fluorescencia. El microscopio 4D permite estudiar el ciclo celular, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis en C. elegans y en otros sistemas como los mamíferos o el cultivo de células de tejidos.

El rastreo del linaje celular en las imágenes DIC se realiza manualmente. Lleva mucho tiempo y requiere algo de práctica para realizar un análisis completo del embrión. La comprobante del procedimiento correrá a cargo de Begoña Ezcurra, técnica de nuestro laboratorio.

Antes de preparar los embriones, ajuste la temperatura de registro del microscopio 4D a 15, 20 o 25 grados Celsius y configure el microscopio para que registre 1.500.30 pilas z de 30 planos focales a una micra de distancia con intervalos de 30 segundos entre el comienzo de cada pila. A continuación, alícuota de 500 a 1000 microlitros de agar 4,5% líquido en tubos de vidrio de tres milímetros y selle cuidadosamente los tubos con una película de cera para evitar la desecación. Para preparar una almohadilla de agar delgada y homogénea para el registro, caliente cuidadosamente una alícuota de agar sobre un quemador de alcohol hasta que el agar se derrita y coloque el tubo en un bloque de calor de 80 grados centígrados.

Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre un trozo de plástico y use una pipeta de pasto en una mano para colocar una pequeña gota de agar derretido en el centro del portaobjetos, luego use inmediatamente la otra mano para colocar un segundo portaobjetos en la gota de agar para crear una almohadilla de agar muy delgada. Para montar los embriones, primero, use un selector para transferir de 5 a 10 hermafroditas grávidos a un vaso de relojero lleno de agua bajo un microscopio estereoscópico. Usa un bisturí para abrir los nematodos hermafroditas y extraer de uno a cuatro huevos tempranos del útero.

Deslice suavemente la corredera superior de la almohadilla de agar y use un tubo capilar para colocar un huevo temprano en el centro de la almohadilla. Use una pestaña pegada al extremo de un palillo de dientes para ajustar la posición del huevo según sea necesario, y use la pipeta capilar para eliminar el exceso de agua. Use un bisturí para cubrir lenta y oblicuamente el cubreobjetos sobre la preparación antes de usar una micropipeta para llenar 3/4 del espacio que rodea la almohadilla de agar con agua.

A continuación, selle el cubreobjetos con vaselina para evitar la desecación durante largos períodos de grabación. Después del sellado, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio 4D y utilice un objetivo de bajo aumento para enfocar el embrión. Seleccione el objetivo de inmersión 100X y enfoque el condensador.

Abra completamente la apertura del condensador y cierre el diafragma de campo para proporcionar una apertura numérica más alta y una mayor resolución. Gire el prisma de Wollaston para obtener una imagen tridimensional del embrión iluminado en un lado, luego gire el prisma en la otra dirección para obtener el efecto de tener el embrión iluminado en el otro lado y comience la grabación 4D. Para la reconstrucción del linaje celular de un embrión grabado en una película 4D, abra el software de rastreo del linaje y seleccione Archivo y Nuevo proyecto.

Seleccione la plantilla de linaje celular adecuada en función de la temperatura de grabación y establezca el recuento de escaneos en 1500. El tiempo entre escaneos a 30 segundos, el recuento de niveles a 30 y la distancia entre niveles a una micra. Seleccione el archivo de imagen, el formato y el directorio donde se guardaron las imágenes.

Seleccione si las imágenes se guardaron como imágenes individuales o como pilas z de varias imágenes y establezca el nombre del archivo y los formatos de imagen. A continuación, haga clic en Procesamiento de canales habilitado para detectar y configurar los canales de luz apropiados de la película 4D. Para el rastreo de linajes celulares, inicie el software de rastreo de linajes celulares.

Aparecerá una ventana de video y una ventana de linaje de celdas. En la ventana de linaje, seleccione la rama de linaje y haga clic en el núcleo de la célula correspondiente a esta célula en la ventana de vídeo. Reproduzca la película 4D hacia adelante, hacia atrás, o hacia arriba o hacia abajo un nivel para seguir la celda de interés espacialmente a lo largo del tiempo.

Haga clic periódicamente en el núcleo de la célula para generar un punto en la rama del linaje y registrar las coordenadas espaciales de la célula en un momento específico. Como resultado, son posibles las progresiones de linaje celular y las reconstrucciones en 3D del embrión. A continuación, pulse la tecla de retorno para marcar la mitosis y seleccione una de las células hijas para seguir la progresión celular como se acaba de demostrar.

Repita el análisis para el resto de las células embrionarias para trazar el linaje celular completo o para seguir células específicas de interés, como las que se someten a apoptosis. Permitir la comparación de linajes mutantes de interés con el estereotipado linaje celular de C. elegans de tipo salvaje. Las placas helicoidales se incuban dentro de cajas de cartón para evitar la condensación.

Una vez que se completa el registro, el linaje celular se puede reconstruir utilizando un software de rastreo de linaje, como se demuestra. Por ejemplo, en este análisis representativo, se comparó el linaje de células embrionarias mutantes gsr-1 rastreadas con el linaje de tipo salvaje C. elegans. Y se reveló la detección de un retraso progresivo en el ciclo celular durante el desarrollo embrionario.

Como consecuencia, los embriones mutantes se detuvieron en etapas intermedias, mientras que los embriones de tipo salvaje progresaron y finalmente eclosionaron como larvas. Además, otras características importantes del desarrollo embrionario, como la apoptosis, se pueden visualizar dinámicamente mediante microscopía 4D. El rastreo de linaje de las imágenes DIC debe procesarse manualmente.

Un procesamiento de software de células no marcadas en luz visible en etapas tempranas de desarrollo no es preciso para el análisis de embriones. La aplicación del sistema de reconocimiento de imágenes al campo de la microscopía de luz visible supondrá un gran avance en el campo de la biología del desarrollo.