Name: Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a crear un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico modificado con trombina y rosa de bengala para generar coágulos ricos en fibrina sensibles al tPA. Este método mejora la investigación preclínica de terapias trombolíticas.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH (NS108763, NS100419, NS095064 y HD080429 a C.Y.K.; y NS106592 a Y.Y.S.).

Este protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Virginia y sigue las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En la Figura 1A se describe la secuencia de procedimientos quirúrgicos de este protocolo.
1. Configuración de la cirugía
<ol><li>Coloque una almohadilla térmica con temperatura a 37 °C en el adaptador para animales pequeños al menos 15 minutos antes de la cirugía. Prepare un rollo de pinza nasal para el adaptador que permita la rotación de la cabeza del animal. Preparar los anestésicos Ketamina (60 mg/kg)/ Xilacina (10 mg/kg).</li>
	<li>Esterilice las herramientas quirúrgicas, incluidas las tijeras, las pinzas, los portamicroagujas, los hemostáticos, los bastoncillos de algodón y las suturas con autoclave (121 °C a 15 psi durante 60 min). Prepara pegamento para pañuelos y ungüento para los ojos. Prepare las gafas de protección láser de 532 nm para cirujanos. NOTA: Este protocolo describe un procedimiento de cirugía mayor de supervivencia y debe realizarse mediante técnicas asépticas.</li>
	<li>Configure el sistema de iluminación con una fuente láser de 532 nm. Prepara un taladro dental.</li>
	<li>Preparar la solución de Rosa de Bengala en solución salina (10 mg/mL). Coloque una trombina bovina alícuota (0,1 U/μL) en una cubeta de hielo.</li>
	<li>Inyectar ketoprofeno (4,0 mg/kg) por vía subcutánea al ratón como analgesia 30 min antes de la cirugía o utilizar el régimen analgésico recomendado por las guías institucionales locales.</li>
</ol>2. Ligadura de la arteria carótida común ipsilateral
<ol><li>Anestesiar ratones machos C57BL/6NCrl de 10-14 semanas de edad con un peso de 22 a 30 g mediante inyección intramuscular de ketamina (60 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). NOTA: Se espera que todo el procedimiento quirúrgico, que abarca la ligadura de la arteria carótida común ipsilateral a través de la monitorización del flujo sanguíneo cerebral, dure ~120 min. El régimen anestésico suele ser eficaz durante toda esta duración, pero la profundidad anestésica debe reevaluarse al menos cada 15 minutos. Mientras se aprenden estos procedimientos, puede ser necesario volver a dosificar la anestesia.</li>
	<li>Realice un pellizco en los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente anestesiado. Retire el vello del cuello izquierdo para la ligadura CCA y la cabeza para el adelgazamiento del cráneo con la crema depilatoria.</li>
	<li>Coloque el ratón en el adaptador para animales pequeños en posición supina. Esterilice el área quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de povidona yodada y etanol al 70%.</li>
	<li>Asegure la cabeza del mouse con barras para los oídos. Bajo un microscopio de disección, haga una incisión de 0,5 cm en el cuello uterino izquierdo con un par de microtijeras y pinzas rectas a unos 0,2 cm laterales a la línea media.</li>
	<li>Use un par de pinzas dentadas finas para separar el tejido blando y la fascia para exponer la arteria carótida común izquierda (LCCA, por sus siglas en inglés). Separe cuidadosamente el CCA izquierdo del nervio vago con un par de pinzas finas y lisas.</li>
	<li>Coloque una sutura permanente de doble nudo alrededor del LCCA con una sutura de seda 5-0 cortada en segmentos de 20 mm y luego cierre la herida con clips estériles.</li>
</ol>3. Adelgazamiento del cráneo por encima de la rama MCA y fotoactivación
<ol><li>Coloque el ratón en posición prona en el adaptador para animales pequeños. Gire el rodillo de pinza nasal 15°. Esterilice el área quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de betadine y etanol al 70%.</li>
	<li>Realice una incisión de 0,8 cm en el cuero cabelludo con un par de microtijeras y pinzas rectas a lo largo del ojo y la oreja izquierdos para exponer el músculo temporal, que se encuentra entre el ojo y la oreja (Figura 1B).</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, haga una incisión de 0,5 cm a lo largo del borde del músculo temporal en el hueso parietal izquierdo con un par de pinzas dentadas finas. Realice una segunda incisión vertical de 0,3 cm en el músculo temporal con unas microtijeras. Retraiga el músculo temporal para exponer el borde del hueso parietal y el hueso escamoso. Asegúrese de visualizar el punto de referencia de la sutura coronal entre los huesos frontal y parietal (Figura 1B,C).</li>
	<li>Humedece el cráneo aplicando solución salina estéril para revelar el MCA izquierdo. Marque la rama proximal de MCA en el hueso escamoso con un rotulador. Dibuje suavemente un círculo de aproximadamente 1 mm de diámetro alrededor del área marcada con el taladro dental neumático (ajuste de la velocidad de la fresa al 50% del controlador de velocidad) y luego adelgace el cráneo aproximadamente 0,2 mm de profundidad sin tocar la duramadre inferior. Detenga la perforación hasta que quede una capa muy delgada de hueso.</li>
	<li>Mezclar la solución de trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) y Rosa de bengala (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) en función del peso corporal del ratón. Por ejemplo, para un ratón de 25 g de peso corporal, mezcle 20 μL de trombina (0,1 U/μL) y 125 μL de RB (10 mg/mL).</li>
	<li>Inyecte lentamente la solución de T+RB (145 μl por 25 g de peso corporal) en el seno retroorbitario con una jeringa de insulina (aguja #31G). NOTA: En experimentos piloto, se examinó la tasa de mortalidad de dosis crecientes de trombina mezcladas con la dosis estándar de colorante RB (50 mg/kg) para la fotoactivación. La mortalidad fue del 0% para la trombina de 80 U/kg (n=13), del 43% para la trombina de 120 U/kg (n=7) y del 100% para la trombina de 160 U/kg (n=5) y de 200 U/kg (n=5). Por lo tanto, se eligió una dosis de 80 U/kg de trombina para este modelo. También se utilizaron imágenes de contracción de moteado láser para excluir la posibilidad de coagulación sanguínea desenfrenada cerca de la cavidad orbitaria después de la inyección en el seno retroorbitario de T+RB (Figura suplementaria 1), así como la deposición generalizada de fibrina en el hemisferio contralateral que no se sometió a iluminación láser (Figura suplementaria 2).</li>
	<li>Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Aplique el iluminador con una luz láser de 532 nm (con una energía de 0,5 mW) en el sitio perforado con una distancia de 2 pulgadas durante 20 minutos. Visualice la iluminación en la rama proximal de MCA a través de unas gafas de protección láser (Figura 1C,D). NOTA: El MCA con iluminación de 532 nm muestra fluorescencia roja debajo de las gafas. El ACM distal desaparecerá después de 10 minutos de iluminación. Excluir al animal si el flujo distal de ACM sigue presente después de 20 minutos de iluminación.</li>
	<li>Detenga la iluminación láser después de 20 minutos. Cierre la herida con pinzas estériles.</li>
</ol>4. Imágenes intravitales (opcional)
NOTA: Para caracterizar la formación de trombos in vivo, se deben utilizar imágenes intravirales mediante un confocal de disco de espín con sistema de fotoactivación23.
<ol><li>Haga una ventana craneal de ~3 mm de diámetro en el hueso parietal del cráneo.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos en la ventana craneal y ubique el ACM distal (~50 μm de diámetro) debajo de un objetivo de inmersión en agua de 20x.</li>
	<li>Etiquete la plaqueta circulante por la inyección en la vena de cola del anticuerpo anti-GPIbβ conjugado con DyLight488 (0,1 mg/kg) a los 5 minutos antes de la toma de imágenes.</li>
	<li>Inyectar la solución de mezcla de trombina (80 U/kg) y Rosa de bengala (50 mg/kg) por retroorbitario a los 5 min antes de la toma de imágenes.</li>
	<li>Fotoactivar el ACM mediante un sistema láser de 561 nm con rayo láser de 10 μm de diámetro y grabar la imagen hasta la formación del trombo.</li>
</ol>5. Administración de tPA
<ol><li>Coloque al animal anestesiado sobre una almohadilla tibia a 37 °C. En el momento seleccionado después de la fotoactivación, humedezca una gasa con agua tibia a ~45 °C y envuélvala en la cola durante 1 min.</li>
	<li>Inyectar tPA humano recombinante (10 mg/kg) a través de la vena de la cola con un bolo al 50% y al 50% durante 30 min mediante bomba de infusión. NOTA: Aunque la dosis clínica de tPA humano recombinante para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo es de 0,9 mg/kg, se suele utilizar una dosis más alta (10 mg/kg) en roedores para compensar la reducción de la reactividad al tPA entre especies. También se siguió el protocolo estándar de administración de tPA en modelos preclínicos de ictus, utilizando el 50% en bolo y el 50% en infusión a través de la vena de la cola durante 30 min.24</li>
</ol>6. Monitor del flujo sanguíneo cerebral (CBF)
NOTA: Para confirmar la recuperación del CBF después del tratamiento con tPA, utilice un sistema de imágenes bidimensionales de contraste de manchasláser 15 y registre inmediatamente después de la fototrombosis (paso 3.9) o a las 24 h después del tratamiento con tPA.
<ol><li>Coloque al animal anestesiado en posición prona y haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo con el cráneo expuesto.</li>
	<li>Hidratar el cráneo con solución salina estéril y aplicar suavemente el gel de ultrasonido sobre el cráneo. Evite el pelo y las burbujas en el gel, que interferirán con la señal CBF.</li>
	<li>Monitoree el CBF en ambos hemisferios cerebrales bajo un generador de imágenes de contraste de manchas láser durante 10 minutos.</li>
	<li>Después de grabar la imagen de CBF, cierre el cuero cabelludo con pegamento de tejido y devuelva al animal a la jaula.</li>
	<li>Analice el CBF en las regiones seleccionadas y calcule el porcentaje de recuperación del CBF en comparación con la región contralateral.</li>
	<li>Luego, vuelva a colocar al animal en una jaula cálida para su recuperación. Monitoree a los ratones durante 5-10 minutos hasta que se recuperen de la anestesia. Coloque la comida mojada en la jaula y devuélvala al centro de cuidado de animales. NOTA: Proporcione analgesia postoperatoria según lo recomendado por las pautas institucionales locales.</li>
</ol>7. Medición del volumen del infarto mediante tinción con cloruro de trifenil tetrazolio (TTC)
<ol><li>Veinticuatro horas después de la fototrombosis, anestesiar profundamente al animal según las pautas institucionales locales para la cirugía de no supervivencia. NOTA: Administramos tribromoetanol (avertina) 250 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP).</li>
	<li>Realizar perfusión transcárdica con PBS, recolectar cerebro fresco e incrustar en gel de agar al 3%.</li>
	<li>Cortar el trozo de cerebro con 1 mm de espesor mediante vibrátomo e incubar en una solución de TTC al 2% durante 10 min.</li>
	<li>Cuantifique el volumen total del infarto de 6 cortes de cerebro como el volumen absoluto con el software ImageJ. NOTA: El edema cerebral no se utilizó como medida de resultado por dos razones. En primer lugar, la tinción TTC mide la viabilidad del tejido (a través de la actividad de reducción mitocondrial), que es una consecuencia más grave que el edema. En segundo lugar, a medida que avanza el infarto, se produce tanto el edema vasogénico como el citotóxico y no se pueden distinguir fácilmente mediante los métodos estándar de medición del edema cerebral. Sin embargo, hemos utilizado el marcaje con antiinmunoglobina (IgG) para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) y hemos encontrado una extravasación de IgG comparable a las 6 h después de la fotoactivación en los modelos de ictus RB y T+RB (Figura suplementaria 3).</li>
</ol>8. Medición de la formación de trombos
NOTA: Para medir la formación de trombos, recoja el cerebro 1 h y 2 h después de la fototrombosis para la medición del trombo en la ACM por inmunoquímica (IHQ) y para la medición de la fibrina en el hemisferio cerebral por inmunotransferencia, respectivamente.
<ol><li>Realizar la IHQ para la caracterización de la composición del coágulo. Fije el cerebro con paraformaldehído al 4% durante la noche y luego deshidrate el cerebro con sacarosa al 30% para la inclusión de OCT.</li>
	<li>Seccionar el cerebro con orientación sagital en 20 μm de espesor, y realizar la IHQ con anticuerpos específicos contra fibrinógeno, plaquetas (glicoproteína IIb), glóbulos rojos (TER119) y vasos sanguíneos (isolectina GS-IB4).</li>
	<li>Realizar la medición de fibrina en el hemisferio cerebral mediante inmunotransferencia con un anticuerpo contra fibrinógeno.</li>
</ol>

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<li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombsis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El accidente cerebrovascular fototrombótico RB tradicional, introducido en 1985, es un modelo atractivo de isquemia cerebral focal para procedimientos quirúrgicos simples, baja mortalidad y alta reproducibilidad del infarto cerebral. 5 En este modelo, el colorante fotodinámico RB activa rápidamente las plaquetas al excitarse con la luz, lo que da lugar a agregados densos que ocluyen el vaso sanguíneo 5,8,23.</s...

La trombectomía endovascular y la trombólisis mediada por tPA son las únicas dos terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el accidente cerebrovascular isquémico agudo, que afecta a ~ 700,000 pacientes anualmente enlos Estados Unidos. Debido a que la aplicación de la trombectomía se limita a la oclusión de vasos grandes (LVO), mientras que la trombólisis tPA puede aliviar las oclusiones de vasos pequeños, ambas son terapias valiosas para el accidente cerebrovascular isquémico agudo2. Además, la combinación de ambas terapias (p. ej., inicio de la tPA-trombólisis dentro de las 4,5 horas posteriores al inicio del ictus, seguida de trombectomía) mejora la reperfusión y los resultados funcionales3. Por lo tanto, la optimización de la trombólisis sigue siendo un objetivo importante para la investigación del ictus, incluso en la era de la trombectomía.
Los modelos tromboembólicos son una herramienta esencial para la investigación preclínica del ictus con el objetivo de mejorar las terapias trombolíticas. Esto se debe a que los modelos de oclusión vascular mecánica (p. ej., oclusión de ACM con sutura intraluminal) no producen coágulos sanguíneos, y su rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la eliminación de la oclusión mecánica está excesivamente idealizada 4,5. Hasta la fecha, los principales modelos tromboembólicos incluyen fototrombosis 6,7,8, aplicación tópica de cloruro férrico (FeCl3)9, microinyección de trombina en la rama MCA 10,11, inyección de (micro)émbolos ex vivo en la ACM o arteria carótida común (CCA)12,13,14 e hipoxia-isquemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Estos modelos de accidente cerebrovascular difieren en la composición histológica de los coágulos subsiguientes y en la sensibilidad a las terapias líticas mediadas por tPA (Tabla 1). También varían en el requerimiento quirúrgico de la craneotomía (necesaria para la inyección de trombina in situ y la aplicación tópica de FeCl3), la consistencia del tamaño y la ubicación del infarto (p. ej., la infusión de microémbolos con CCA produce resultados muy variables) y los efectos globales sobre el sistema cardiovascular (p. ej., la tHI aumenta la frecuencia cardíaca y el gasto cardíaco para compensar la vasodilatación periférica inducida por hipoxia).
El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico (PTS) basado en colorante RB tiene muchas características atractivas, incluidos procedimientos quirúrgicos simples sin craneotomía, baja mortalidad (generalmente < 5%) y un tamaño y ubicación predecibles del infarto (en el territorio proveedor de MCA), pero tiene dos limitaciones principales. 8 La primera advertencia es la respuesta débil o nula al tratamiento trombolítico mediado por tPA, que también es un inconveniente del modelo FeCl3 7,19,20. La segunda advertencia de los modelos de accidente cerebrovascular PTS y FeCl3 es que los trombos resultantes consisten en agregados plaquetarios densamente empaquetados con una pequeña cantidad de fibrina, lo que no solo conduce a su resistencia a la terapia tPA-lítica, sino que también se desvía del patrón de trombos de plaquetas:fibrina entremezclados en pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo21,22. Por el contrario, el modelo de microinyección de trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizada y un contenido incierto de plaquetas10.
Teniendo en cuenta el razonamiento anterior, planteamos la hipótesis de que la mezcla de RB y una dosis subtrombótica de trombina para la fotoactivación dirigida a MCA a través del cráneo adelgazado puede aumentar el componente de fibrina en los trombos resultantes y aumentar la sensibilidad al tratamiento lítico mediado por tPA. Hemos confirmado esta hipótesis23 y en este trabajo describimos en detalle los procedimientos del modelo de ictus fototrombótico modificado (T+RB).

<table><tbody><tr><td>Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>infarto</td></tr><tr><td>4-0 Sutura de monofilamento de nailon</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>suministros quirúrgicos</td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>Harvard Apparatus</td><td>624143</td><td>suministros quirúrgicos</td>Rayo</tr> láser de <tr><td>543 nm</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>fototrombosis</td></tr><tr><td>ratones machos adultos</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14 semanas de edad (22~30 g)</td></tr><tr><td>Barra de anestesia para máquina de adaptadores de ratón</td>, <td>configuración quirúrgica</td><td>UVA</td><td></td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoetanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>eutanasia</td></tr><tr><td>taladro dental</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>configuración quirúrgica</td></tr><tr><td>Microscopio digital</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>Imágenes cerebrales</td></tr><tr><td>Disección microscopio</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>configuración quirúrgica</td></tr><tr><td>Pinzas curvas finas (dentadas)</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Pinzas curvas finas (lisas)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>anti-conejo de cabra Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Hemostáticos Halsted-Mosquito</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Bomba de calor con almohadilla térmica</td><td>Gaymar</td><td>TP700</td><td>configuración quirúrgica</td></tr><tr><td>bomba de infusión</td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>tratamiento trombolítico</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con aguja 31G</td><td>BD</td><td>328291</td><td>fototrombosis</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CCM,</td><td>anestesia</td>UVA <td></td></tr><tr><td>Láser protector google 532nm</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>fototrombosis</td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>AINE analgesia</td></tr><tr><td>micro portaagujas</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>microtijeras</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 generador de imágenes de flujo sanguíneo</td><td>Moor</td><td>780-nm</td><td>fuente láser Laser Speckle Contrast Imaging</td></tr><tr><td>adaptador de ratón</td><td>RWD</td><td>68014</td><td>configuración quirúrgica</td></tr><tr><td>Puralube Ungüento veterinario</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>prevención de la sequedad ocular</td></tr><tr><td>Puntas retractoras</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>configuración quirúrgica</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>fototrombosis</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>fototrombosis</td></tr><tr><td>Pegamento tisular</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>suministros quirúrgicos</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo activase 2mg</td> tratamiento <td>trombolítico</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>CCM,</td><td>anestesia</td> UVA <td></td></tr></tbody></table>

un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tpa

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Un modelo ideal de accidente cerebrovascular tromboembólico requiere ciertas propiedades, incluidos procedimientos quirúrgicos relativamente simples con baja mortalidad, un tamaño y ubicación del infarto consistentes, precipitación de coágulos sanguíneos entremezclados plaquetas:fibrina similares a los de los pacientes y una sensibilidad adecuada al tratamiento fibrinolítico. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico basado en colorante de rosa de bengala (RB) cumple con los dos primeros requisitos, pero es altamente refractario al tratamiento lítico mediado por tPA, presumiblemente debido a su composición de coágulos rica en plaquetas, pero pobre en fibrina. Razonamos que la combinación de colorante RB (50 mg/kg) y una dosis subtrombótica de trombina (80 U/kg) para la fotoactivación dirigida a la rama proximal de la arteria cerebral media (ACM) puede producir coágulos enriquecidos en fibrina y sensibles al tPA. De hecho, el modelo de fototrombosis combinada de trombina y RB (T+RB) desencadenó coágulos sanguíneos mixtos de plaquetas:fibrina, como lo demuestran las inmunotinciones y las inmunomanchas, y mantuvo tamaños y ubicaciones de infarto consistentes, además de una baja mortalidad. Además, la inyección intravenosa de tPA (alteplasa, 10 mg/kg) dentro de las 2 h posteriores a la fotoactivación disminuyó significativamente el tamaño del infarto en la fototrombosis T+RB. Por lo tanto, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina puede ser un modelo experimental útil para probar nuevas terapias trombolíticas.

En primer lugar, comparamos el contenido de fibrina en RB frente a los coágulos sanguíneos inducidos por fototrombosis T+RB. Los ratones fueron sacrificados por perfusión transcardial de fijadores a las 2 h después de la fotoactivación, y los cerebros fueron extraídos para la tinción por inmunofluorescencia de la rama MCA en planos longitudinales y transversales. En la fototrombosis RB, la rama de la ACM estaba densamente repleta de plaquetas CD41+ y poca fibrina (Figura 2...

Los modelos tradicionales de ictus fototrombótico (SPT) inducen principalmente agregados plaquetarios densos de alta resistencia al tratamiento lítico con activadores tisulares del plasminógeno (tPA). Aquí se introduce un modelo de PTS murino modificado mediante la coinyección de trombina y colorante fotosensible para la fotoactivación. El modelo de SPT potenciado con trombina produce coágulos mixtos de plaquetas:fibrina y es muy sensible a la trombólisis tPA.

Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Queremos crear un modelo de accidente cerebrovascular que produzca un coágulo de sangre que sea similar a las muestras de pacientes y que responda a la terapia trombolítica clínicamente relevante. Por lo tanto, modificamos el modelo clásico de ictus fototrombótico y mezclamos trombina y el colorante fotodinámico rosa de bengala antes de la fotoactivación. Nos complace que este procedimiento cree coágulos sanguíneos que son altamente sensibles a la trombólisis mediada por tPA.Este modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico modificado utiliza procedimientos quirúrgicos muy simples con una baja tasa de mortalidad que produce un tamaño y una ubicación del infarto altamente consistentes. También se produce un coágulo de sangre mixto de fibrina y plaquetas que es similar a los del paciente con accidente cerebrovascular agudo. Por lo tanto, creemos que es muy útil para la investigación preclínica del ictus desarrollar terapias trombolíticas más eficaces.Esperamos que más personas usen nuestro modelo. La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Yu-Yo Sun, nuestro profesor asistente de investigación en nuestro grupo. 30 minutos antes de la cirugía, prepare al ratón inyectando un analgésico.Después de anestesiar al ratón, realice un pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que esté completamente anestesiado. A continuación, retira el vello de la parte izquierda del cuello y la cabeza con crema depilatoria. Coloque el ratón en el adaptador para animales pequeños en posición supina y esterilice el área de la piel quirúrgica limpiándola con tres pasadas alternas de povidona yodada y etanol al 70%.Bajo un microscopio de disección, haga una incisión cervical izquierda de 0,5 centímetros con un par de microtijeras y pinzas rectas a unos 0,2 centímetros laterales a la línea media. A continuación, con un par de pinzas dentadas finas, separe el tejido blando y la fascia para exponer el LCCA. Luego, con un par de pinzas finas y lisas, separe cuidadosamente el LCCA del nervio vago.Coloque una sutura permanente de doble nudo alrededor del LCCA con una sutura de seda 5-0. Coloque el mouse en una posición prona y gire el rodillo de pinza nasal 15 grados. A continuación, esterilice la zona quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de Betadine y etanol al 70%.Haga una incisión de 0,8 centímetros en el cuero cabelludo con un par de microtijeras y pinzas rectas a lo largo del ojo y la oreja izquierdos para exponer el músculo temporal. A continuación, haga una incisión de 0,5 centímetros a lo largo del borde del músculo temporal en el hueso parietal izquierdo. A continuación, haga una segunda incisión vertical de 0,3 centímetros en el músculo temporal y retraiga el músculo para exponer el borde del hueso parietal y el hueso escamoso.Asegúrese de visualizar el punto de referencia de la sutura coronal entre los huesos frontal y parietal. A continuación, humedezca el cráneo aplicando solución salina estéril para revelar el MCA izquierdo y marque la rama proximal del MCA en el hueso escamoso con un marcador. Dibuja suavemente un círculo de un milímetro de diámetro alrededor de esta área marcada con un taladro dental neumático.A continuación, adelgaza el cráneo a unos 0,2 milímetros de profundidad sin tocar la duramadre inferior. Detenga la perforación cuando quede una capa muy delgada de hueso. A continuación, mezcle la solución de trombina y rosa de bengala en función del peso corporal del ratón e inyecte lentamente la mezcla en el seno retroorbitario con una aguja de calibre 31.Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad. Aplique el iluminador con una luz láser de 532 nanómetros en el sitio perforado dentro de una distancia de dos pulgadas durante 20 minutos. Visualice la iluminación en la rama proximal del MCA a través de gafas de proyección láser.Después de 20 minutos, detenga la iluminación láser. Haz una ventana craneal de tres milímetros de diámetro en el hueso parietal del cráneo, y coloca un cubreobjetos sobre ella. A continuación, ubique el ACM distal bajo una lente de objetivo de inmersión en agua de 20x.Marque la plaqueta circulante mediante la inyección en la vena de cola del anticuerpo conjugado anti-GP1b-beta conjugado DyLight 488 cinco minutos antes de la toma de imágenes. A continuación, inyecte retroorbitalmente la mezcla de solución de trombina y rosa de bengala. Fotoactive el MCA utilizando un sistema láser de 532 nanómetros con un rayo láser de 10 micrómetros de diámetro y grabe la imagen hasta la formación de trombos.Para la administración de tPA, coloque al animal anestesiado sobre una almohadilla tibia a 37 grados centígrados. Envuelva su cola con una gasa húmeda tibia a 45 grados centígrados durante un minuto en el punto de tiempo posterior a la fotoactivación seleccionado. A continuación, inyecte el tPA humano recombinante a través de la vena de la cola.Inyectar el 50% en forma de bolo e infundir el 50% restante durante 30 minutos con una bomba de infusión. Para controlar el flujo sanguíneo cerebral, haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo con el cráneo expuesto. Hidrata el cráneo con solución salina estéril y aplica suavemente el gel de ultrasonido sobre él, asegurándote de evitar el pelo o las burbujas de aire en el gel.Controle el flujo sanguíneo cerebral en ambos hemisferios cerebrales bajo el generador de imágenes de contraste de manchas láser durante 10 minutos. El marcaje de inmunofluorescencia muestra que en la fototrombosis basada en el colorante de rosa de bengala, la rama de MCA estaba densamente repleta de plaquetas CD41 positivas y poca fibrina. Por el contrario, en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, la rama de MCA estaba ocluida por coágulos de plaquetas y fibrina mezclados al azar.El análisis de inmunotransferencia mostró un aumento de más del doble en el depósito de fibrina en el hemisferio ipsilateral en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala en comparación con la rosa de bengala sola. Las imágenes intravitales basadas en microscopio confocal mostraron que una inyección intravenosa de trombina no logró inducir agregados plaquetarios, incluso bajo iluminación láser. Las plaquetas formaron coágulos homogéneos en el modelo de fototrombosis de la rosa de bengala, pero agregados desiguales con múltiples regiones débiles en el modelo de trombina más rosa de bengala.El CBF del mismo ratón antes y 24 horas después del tPA en comparación con el tratamiento con vehículo se midió mediante imágenes de contraste de moteado láser y se normalizó al hemisferio contralateral. En la fototrombosis de la rosa de bengala, el tratamiento con tPA condujo a una tendencia de recuperación del CBF, particularmente en el área del borde isquémico en comparación con los ratones tratados con vehículos. En la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, la recuperación de CBF en ratones tratados con tPA fue más prominente, y las ramas proximales de MCA a menudo se hicieron visibles a las 24 horas.En la fototrombosis de la rosa de bengala, se detectó un tamaño de infarto similar en ratones tratados con vehículo y tratados con tPA. Por el contrario, en la fototrombosis de trombina más rosa de bengala, el tratamiento lítico con tPA redujo significativamente el infarto a las 0,5, una o dos horas, pero no a las seis horas posteriores a la fotoactivación en comparación con los ratones tratados con el vehículo. Este método se puede utilizar para investigar la composición del coágulo y para estudiar más a fondo los tratamientos trombolíticos.Después de este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos de terapia de trombólisis y determinar la eficacia posterior. La adición de trombina permite ajustar la composición del coágulo de pobre en fibrina a rica en fibrina, lo que permite a los investigadores desarrollar estrategias terapéuticas clínicamente relevantes.

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Investigación

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Este video muestra el procedimiento para generar un accidente cerebrovascular fototrombótico en un modelo de ratón mediante la iluminación láser de un cráneo intacto después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular fototrombótico en modelo de ratón: una técnica de iluminación láser a través del cráneo de ratón después de la administración de un tinte fotosensible para inducir fototrombosis

Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.

Isquemia photothrombotic: Un modelo de lesión cortical fotoquímico mínimamente invasiva y reproducible de Estudios Carrera Ratón

Aquí, describimos un enfoque de microscopía óptica semi-invasiva para la inducción de un coágulo fototrombótico de Bengala Rosa en la corteza somatosensorial de un ratón in vivo.  Se describen los aspectos técnicos del procedimiento de imagen, desde la inducción de un evento fototrombótico hasta la aplicación y la recopilación de datos.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

Los modelos de ictus tromboembólicos son herramientas vitales para optimizar la terapia de recanalización. Presentamos un modelo murino de ictus trombótico basado en el insulto hipóxico-isquémico cerebral transitorio (tHI), que desencadena trombosis e infarto, y responde favorablemente a la fibrinólisis mediada por el activador tisular del plasminógeno (tPA) en una ventana terapéutica similar a la de los pacientes con ictus.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.

Circunscrita capsular del infarto de modelado mediante técnica photothrombotic

Se presenta un procedimiento de refinado del cloruro férrico (FeCl3) modelos de trombosis inducidas en la carótida y la arteria mesentérica, así como la vena, que se caracteriza de manera eficiente mediante microscopía intravital para monitorear el tiempo de oclusiva formación de trombos.

Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Utilizando un enfoque totalmente óptico, se induce un accidente cerebrovascular isquémico mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal de Ca2+ utilizando un biosensor fluorescente en el núcleo de accidente cerebrovascular emergente de un ratón despierto y que se comporta.

Fototrombosis y fotometría de fibra simultáneas para inducir y monitorear el accidente cerebrovascular isquémico en ratones que se comportan

Para simular el ictus tromboembólico, se inyectaron émbolos preparados a partir de sangre heteróloga de rata en la arteria cerebral media, seguidos de la administración de trombólisis sistémica para recanalización. Esta versión del modelo está optimizada para su uso en una red multilaboratorio y soporta la prueba de múltiples terapéuticas candidatas.

La Red de Evaluación Preclínica del Ictus Modelo Multilaboratorio del Ictus Tromboembólico con Trombolisis: TE-MCAo

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Aprende a crear un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico modificado con trombina y rosa de bengala para generar coágulos ricos en fibrina sensibles al tPA. Este método mejora la investigación preclínica de terapias trombolíticas.

Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA

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