Name: Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a aislar progenitores fibroadipogénicos y miogénicos de músculo esquelético de rata mediante digestión con colagenasa y citometría de flujo. Este método permite estudios in vitro sobre regeneración muscular y fibrosis patológica.

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Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras musculares debido...

Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs son adicionalmente capaces de osteogénesis y condrogénesis2,3,4. Por lo tanto, se anotan más ampliamente en la literatura como progenitores mesenquimales o estromales3,5,6,7,8. En la lesión aguda del músculo esquelético, los FAP ayudan indirectamente en la miogénesis regenerativa al proliferar transitoriamente para proporcionar un ambiente favorable para las células satélite musculares activadas y sus contrapartes progenitoras miogénicas (MP) aguasabajo 1,9,10. En paralelo con la regeneración exitosa, los FAP sufren apoptosis, devolviendo sus números a los niveles basales1,9,10,11. En contraste, en la lesión muscular crónica, los FAP anulan las señales pro-apoptóticas, lo que resulta en su persistencia9,10,11 y reparación muscular anormal.
Los estudios in vivo que evalúan los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las FAPs median las respuestas musculares han utilizado modelos animales murinos hasta la fecha1,7,9,10, 11,12,13,14. Si bien los ratones genéticamente modificados son herramientas poderosas para su uso en estos análisis, el pequeño tamaño del animal limita la disponibilidad de tejido para el estudio en modelos de lesiones localizadas a largo plazo donde la atrofia muscular puede ser profunda, como la denervación traumática. Además, la medición de la fuerza muscular y la función física requiere mediciones ex vivo o in situ que requieren la terminación del ratón, o métodos in vivo que requieren cirugía y / o anestesia general para permitir la evaluación del rendimiento contráctil muscular15,16,17,18,19,20 . En ratas, existen análisis funcionales musculares bien validados y utilizados a nivel mundial, además de análisis para comportamientos motores más complejos, como el análisis de la marcha (por ejemplo, índice de función ciática, análisis catwalk) y se realizan en animales despiertos y que se mueven espontáneamente21,22,23,24 . Esto también optimiza los principios de morbilidad mínima en la experimentación con animales y el número de animales de investigación utilizados. De este modo, la rata proporciona al investigador de FAPs la flexibilidad adicional de un mayor volumen muscular lesionado para análisis de proteínas y celulares y la capacidad de realizar evaluaciones en serie de la actividad y los comportamientos funcionales estáticos y dinámicos complejos musculares, en el animal alerta.
Los FAP se han identificado y aislado principalmente de muestras de músculo entero utilizando citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) respectivamente. Se trata de ensayos basados en láser que son capaces de identificar múltiples poblaciones celulares específicas en función de rasgos característicos como el tamaño, la granularidad y una combinación específica de marcadores intracelulares o de superficie celular25. Esto es muy ventajoso en el estudio de un sistema de órganos como el músculo esquelético, ya que la homeostasis y la regeneración son procesos complejos y multifactoriales coordinados por una gran cantidad de tipos de células. Un estudio seminal identificó FAPs, así como MPs, utilizando métodos citométricos de flujo en el músculo esquelético de ratón1. Demostraron que los FAP son de naturaleza mesenquimal, ya que carecían de antígenos de superficie específicos para las células de origen endotelial (CD31), hematopoyético (CD45) o miogénico (Integrin-α7 [ITGA7]), pero expresaron el marcador de células madre mesenquimales Sca-1 (antígeno de células madre 1)1 y se diferenciaron en células fibrogénicas y adipogénicas en cultivo. Otros estudios demostraron el aislamiento exitoso de progenitores mesenquimales en el músculo basado en la expresión de un marcador alternativo de células madre, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 y un análisis posterior reveló que estos probablemente sean la misma población celular que los FAPs3. Los FAP ahora se identifican comúnmente en citometría de flujo utilizando Sca-1 o PDGFRα como un marcador de selección positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Sin embargo, el uso de PDGFRα es preferencial para el tejido humano, ya que aún no se ha identificado un homólogo humano directo de Sca-1 murino32. Además, otras proteínas de la superficie celular han sido reportadas como marcadores de MPs (por ejemplo, VCAM-1), proporcionando una alternativa potencial a ITGA7 como indicador de células de linaje miogénico durante el aislamiento de FAPs33.
Si bien la citometría de flujo/FACS es una metodología poderosa para estudiar el papel y el potencial patogénico de los FAPs en el músculo esquelético1,9,10,11, 13,29,está limitada técnicamente por la especificidad y optimización de sus reactivos requeridos. Dado que la identificación citométrica de flujo y el aislamiento de FAPs se ha desarrollado y llevado a cabo en modelos animalesde ratón 1,9,10, 11,29,esto plantea desafíos para los investigadores que desean estudiar FAPs en otros organismos modelo. Muchos factores, como el tamaño óptimo del tejido a procesar, así como la especificidad y disponibilidad de reactivos y / o anticuerpos, difieren según la especie utilizada.
Además de las barreras técnicas para estudiar los FAP en un nuevo modelo animal, se han estudiado en gran medida en un entorno agudo y tóxico, generalmente a través de una inyección química intramuscular o cardiotoxina. La evaluación de la dinámica a largo plazo de los FAPs se limita principalmente a la evaluación en la distrofia muscular de Duchenne, utilizando el modelo de ratón mdx9,10,11,y modelos de lesión muscular combinada como el desgarro masivo del manguito rotador donde se realiza transección y denervación concurrente del tendón en la musculatura del hombro26,27,28 . La respuesta de los FAP al único insulto de la denervación traumática crónica, una ocurrencia común en accidentes en el lugar de trabajo en la industria pesada, la agricultura y en traumas de nacimiento (lesión del plexo braquial)34,35,36,37 con morbilidad significativa, no se ha caracterizado tan bien, a menudo limitada a un marco de tiempo a corto plazo11,38.
Describimos un método para identificar y aislar FAPs y MPs de músculo esquelético sano, así como severamente atrófico y fibrótico en la rata. En primer lugar, se demuestra la identificación de CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs y CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando un protocolo de tinción de digestión tisular y citometría de flujo y posterior validación de nuestros hallazgos mediante cultivo y tinción inmunocitoquímica de células aisladas de FACS. Usando este método, también informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo de lesión por denervación aislada a largo plazo en la rata.

<table><tbody><tr><td>Tubo de fondo redondo de polipropileno de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con tapón de filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>platos de cultivo celular de 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>130185</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio de 12 mm, n.º 2</td><td>VWR</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>Beckton Dickenson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>FroggaBio</td><td>91014</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 20</td><td>Beckton Dickenson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>25mL Pipeta serológica</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>FroggaBio</td><td>TB50</td><td></td></tr><tr><td>AbC Perlas de compensación total de anticuerpos&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio, grado reactivo</td><td>Bioshop</td><td>AMC303.500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conjugación APC, 50-100&micro; g</td><td>Biotium</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex Medio de Montaje Acuoso</td><td>Merck 108562</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolaminina 411 LN</td><td>Biolamina</td><td>LN411</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino (BSA)</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio</td><td>Bioshop</td><td>CCL444.500</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Plus Cuentas Contadoras Absolutas</td><td>ThermoFisher</td><td>C36995</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>(+)4.5 g/L D-Glucosa (+)L-Glutamina (+)110 mg/L Piruvato de sodio </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>FisherScientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>FACSClean Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FACSRinse Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td></td><td></td>340346</tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Citometría de flujo Vaina Fluido Beckton</td><td>Dickenson</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--Medio de</td><td></td></tr> <tr><td>montaje fluorescente</td><td>Dako</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa Fluor 555 anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Medios de comunicación F10 de jamón</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>11550043</td><td>(+) Rojo de fenol (+) L-glutamina (-) HEPES</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS) (1X)</td><td>Multicell</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Reichert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, titulación mínima del 99,5%</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>ThermoFisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento transformador humano y beta; 1 (hTGF-y beta; 1)</td> <td>Señalización celular</td><td>8915LF</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5879</td><td>También conocido como 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>También conocido como 2-propanol</td></tr><tr><td>Lewis Rat, hembra</td><td>Charles River Kingston</td><td>004 (Código de cepa)</td><td>200-250 gramos usados</td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20 Citómetro de sobremesa</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5417R</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP Clasificador de células</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD31::FITC Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab33858</td><td>Clon TLD-3A12</td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD45::FITC Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>202205</td><td>Clon OX-1</td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD106::P E Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>200403</td><td>También conocido como VCAM-1</td></tr><tr><td>Ratón Anticuerpo</td><td>MHC Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)</td><td>N/A</td><td>También conocido como MF20</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Pax7</td><td>Estudios del Desarrollo de Anticuerpos Banco de Hibridomas (DSHB)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalina neutra tamponada, 10 %</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo O</td><td>Millipore Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conjugación PE-Cy7</td><td>Abcam</td><td>ab102903</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>(-)Cloruro de calcio (-)Cloruro de magnesio </td></tr><tr><td>Bicarbonato de potasio, grado reactivo</td><td>Bioshop</td><td>PBC401.250</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anticuerpo anti-fibroblastos específicos 1 (FSP-1) de conejo</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-32347</td><td>FSP-1 también conocido como S100A4</td></tr><tr><td>Anticuerpo</td> <td>anti-integrina-a7 de conejoAbcam</td><td>ab203254</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Laminina de Conejo</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Perilipina-1</td><td>de Conejo Abcam</td><td>ab3526</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Sca-1 de Conejo</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB4336</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Colágeno Recombinante de Conejo Tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td>También conocido como Col1a1</td></tr><tr><td>Conejo Recombinante Anti-PDGFR Anticuerpo alfa</td><td>Abcam</td><td>ab203491</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico</td><td>Gibco</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazona</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (fap) y progenitores miogénicos (mp) en el músculo esquelético en la rata

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.

Identificación de FAPs y MPs a través de citometría de flujo utilizando un nuevo panel de anticuerpos que incluye Sca-1 y VCAM-1 La estrategia de gating para identificar FAPs en músculo de rata se basa en protocolos de citometría de flujo en elratón 29, que se acercan a las células positivas CD31 (endotelial) y CD45 (hematopoyéticas) (denominadas linaje [Lin]) y examina el perfil fluorescente del marcador FAPs Sca-1 y el marca...

Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Como los FAPs son mediadores de la regeneración muscular y la fibrosis patológica, nuestro protocolo permite la caracterización de la dinámica de faP post lesión muscular y el aislamiento de FAPs para estudios in vitro o ex vivo. Hasta la fecha, los estudios se han realizado exclusivamente en FAPs aislados de ratones. Nuestro protocolo permite el aislamiento efectivo de los FAPs de la rata más grande, proporcionando una disponibilidad de tejido mucho mayor para los ensayos posteriores.El tiempo prolongado de procesamiento de tejidos puede afectar negativamente la viabilidad de los FAP. Si se procesan varias muestras simultáneamente, se recomienda que dos operadores realicen el protocolo en conjunto para maximizar la viabilidad de las células aisladas. Comience colocando el tejido muscular cosechado en un plato de cultivo celular estéril de 10 centímetros.Rasgue suavemente y pica el tejido con fórceps y retire el tejido conectivo para obtener aproximadamente tres a cuatro milímetros de piezas en cubos. Transfiera el tejido minster a un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contenga seis mililitros de DMEM y 1% de penicilina-estreptomicina. A continuación, active 365 microlitros de solución de colagenasa II agregando 10 microlitros de solución de cloruro de calcio 300 milimolar.Añadir la solución de colagenasa II activada a la suspensión tisular para una concentración final de 250 unidades por mililitro. Incubar los tubos en un agitador durante una hora y a 37 grados centígrados a 240 x g con agitación manual cada 15 minutos para desalojar el tejido adherido al lado del tubo. Después de una hora de incubación, agregue 100 microlitros de colagenasa II y 50 microlitros de dispasa a la muestra.Luego, muestree de 15 a 20 veces con una pipeta serológica hasta que la solución sea homogénea. Incubar la muestra de nuevo durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 240 x g con agitación manual cada 15 minutos. Corte lentamente las muestras de solución muscular a través de una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 20 durante 10 ciclos.Luego, coloque un colador de células de 40 micras en un tubo cónico estéril de 50 mililitros y moje mediante pipeteo de cinco mililitros de DMEM suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Pipetear la muestra un mililitro a la vez a través del colador. Una vez filtrada toda la muestra, lave el colador celular con DMEM suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina para llevar el volumen total de la muestra a 25 mililitros.Divida el volumen de la muestra por igual en dos tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga a 15 grados centígrados, 400 x g durante 15 minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente durante siete minutos. Luego, agregue nueve mililitros de tampón de lavado para llevar el volumen a 10 mililitros y centrífuga a 15 grados Celsius, 400 x g durante 15 minutos.Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Transfiera un volumen apropiado de células a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros y mézclelo con tinte azul tripano. Cuente las células vivas en un microscopio de luz utilizando un hemocitómetro.Para la citometría de flujo, transfiera de uno a 2 millones de células por muestra experimental a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Lleve el volumen de la muestra a un mililitro con tampón de lavado y coloque el tubo sobre hielo. Configure todos los controles para el experimento.Para los controles celulares, alícuota de 500, 000 a 1 millón de células en un mililitro de tampón de lavado en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros y colóquelo en hielo. Si el experimento se realiza por primera vez, también se deben incluir suspensiones celulares de una sola teñida. Para configurar los controles de cuentas, agregue alrededor de 150, 000 cuentas de compensación positiva a cada tubo de centrífuga de 1.5 mililitros etiquetado.Prepare el control de viabilidad transfiriendo la mitad del volumen celular del tubo de viabilidad para actualizar el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado como muerto. Incubar el tubo muerto a 65 grados centígrados durante dos o tres minutos, luego colocarlo en hielo. Después de la incubación, devuelva las células muertas al tubo de viabilidad.Centrifugar las suspensiones unicelulares, incluyendo muestras experimentales y de control a 500 x g y cuatro grados Centígrados durante cinco minutos, y resuspendir los gránulos celulares en 100 microlitros de tampón de lavado después de aspirar el sobrenadante. Agregue anticuerpos de acuerdo con la condición de control o experimental, y mueva suavemente la muestra para garantizar una mezcla completa. Luego, incube en hielo en la oscuridad durante 15 minutos.Para las perlas de compensación, incube el tubo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Lleve el volumen de cada muestra a un mililitro agregando 900 microlitros de tampón de lavado a la suspensión de una sola celda, y 900 microlitros de PBS para controles de perlas de compensación. Centrifugar suspensiones unicelulares a 500 x g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y controles de perlas de compensación a 300 x g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Después de la centrifugación de las muestras, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 300 microlitros de tampón de lavado, y controles de perlas en 300 microlitros de PBS y 150, 000 perlas de compensación negativa. Mantenga las muestras de células en hielo y muestras de cuentas a temperatura ambiente bajo papel de aluminio. Proceder con la adquisición de citometría de flujo estableciendo la estrategia de gating para identificar progenitores fibro-adipogénicos y progenitores miogénicos.En el análisis representativo, se confirmó la conjugación exitosa del anticuerpo SCA-1 APC con tinción única de perlas de compensación y suspensiones celulares generadas a partir del músculo gastrocnemio de rata sana. Se titularon cinco concentraciones diferentes de Sca-1 APC en suspensiones unicelulares, y se identificó la concentración óptima de anticuerpos en función de la mayor intensidad de fluorescencia con una tinción de fondo mínima. Las identificaciones citométricas de flujo de FAPs y MPs en gastrocnemio de rata se realizaron utilizando la estrategia de gating que se muestra aquí.Las muestras se cerraron primero para excluir los escombros en el conteo de cuentas. Las celdas se cerraron para excluir los dobletes por las características de dispersión frontal y dispersión lateral. La viabilidad de las células resultantes se evaluó mediante tinción con SYTOX Blue.Los singletes negativos de SYTOX Blue se evaluaron para CD31 y CD45 para excluir las fracciones Lin+. Se evaluó la población Lin. Las células que fueron positivas únicas para Sca-1 fueron designadas FAPs, y las células que fueron positivas únicas para VCAM-1 fueron designadas MP.Con la coinmunotinción inmediatamente después de la clasificación, la población recién aislada de FAPs mostró una tinción positiva para PDGFRalpha sin contaminación por células Pax7 positivas. Por el contrario, la población clasificada de parlamentarios se tiñó de positivo para Pax7 con una ausencia de células PDGFRalpha-positivas. Los FAPs demostraron fibroblastos y adipocitos diferenciados en el día 12 en medios de diferenciación adipogénica con expresión de proteína 1 específica de fibroblastos y perilipina 1, respectivamente.La presencia de triglicéridos neutros y lípidos de adipocitos maduros fue evidente con la tinción oil red O. Además, los FAPs demostraron una presencia de colágeno tipo I y una ausencia de miocitos contaminantes. Los MP cultivados en medios de diferenciación miogénica en el día 12 mostraron la presencia de miocitos maduros y miotubos multinucleados fusionados, y estaban libres de fibroblastos y contaminación de adipocitos.Al utilizar esta técnica para aislar células vivas para cultivos a largo plazo, los investigadores deben asegurarse de utilizar la técnica aséptica y, al mismo tiempo, trabajar de manera eficiente para garantizar una buena viabilidad celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

El reemplazo del tejido muscular sano con grasa intramuscular es una característica prominente de las enfermedades y afecciones humanas. Este protocolo describe cómo visualizar, visualizar y cuantificar la grasa intramuscular, lo que permite el estudio riguroso de los mecanismos subyacentes a la formación de grasa intramuscular.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo de fibrosis muscular orofacial. La comparación de la histología entre ratones maseteros y músculo tibial anterior después de la lesión por congelación confirmó la fibrosis del músculo masetero. Este modelo facilitará una mayor investigación sobre el mecanismo subyacente a la fibrosis del músculo orofacial.

Lesión por congelación en el músculo masetero de ratón para establecer un modelo de fibrosis muscular orofacial

El protocolo aquí presentado permite la identificación y el análisis de alta dimensión de células madre y progenitoras musculares mediante citometría de masas unicelulares y su purificación por FACS para estudios en profundidad de su función. Este enfoque se puede aplicar para estudiar la dinámica de regeneración en modelos de enfermedad y probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas.

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.

Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Aprende a aislar progenitores fibroadipogénicos y miogénicos de músculo esquelético de rata mediante digestión con colagenasa y citometría de flujo. Este método permite estudios in vitro sobre regeneración muscular y fibrosis patológica.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata (Video) | JoVE Journal

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

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