Name: Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Aprende a expresar y purificar proteínas de fusión IgG-GFP en Nicotiana benthamiana mediante cromatografía de columna. Este método permite visualizar anticuerpos recombinantes en cada etapa del proceso.

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Agradecemos a Maria Pia DiPalma por editar el vídeo. También agradecemos a la Oficina de Alcance Educativo y Servicios Estudiantiles de la Universidad Estatal de Arizona por su generosa asistencia de cuota de publicación. La investigación para este protocolo fue apoyada por la Escuela de Ciencias de la Vida de la Universidad Estatal de Arizona.

1. Cultivar plantas N. benthamiana 
<ol><li>Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, todavía caliente (40-45 oC), agua sobre los pellets de turba para una expansión completa. Después de que los pellets se expanden por completo, colocar 2-3 N. benthamiana semillas en cada pellet de turba utilizando pinzas.</li>
	<li>Vierta aproximadamente 0.5 en agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. Etiquete la bandeja con la fecha de siembra. Continúe regando las plántulas diariamente con cantidades apropiadas de fertilizante. La concentración de fertilizantes (alimentos vegetales solubles en agua) es generalmente de 2,5-2,8 g/L.</li>
	<li>Cubra la bandeja con una tapa de humidomo cuando se coloque en la cámara de crecimiento. Mantener los pellets de turba de semillas en la cámara de crecimiento a 23-25 oC, con un fotoperiodo de 16 h y un 60% de humedad relativa.</li>
	<li>Después de una semana, retire las plantas adicionales dejando cada pellet con una sola plántula.</li>
	<li>Cuando las plantas tienen 2-3 semanas de edad, transferir cada pellet de turba a una olla individual que contiene el suelo de control de humedad. Esta demostración utilizó el suelo de maceta de control de humedad Miracle-Gro.</li>
	<li>Agua diaria con 1 g/L de fertilizante. Nunca deje el suelo completamente seco. Las plantas están listas para la infiltración cuando tienen 5-6 semanas de edad.</li>
</ol>2. Preparación de Agrobacterium tumefaciens para infiltración
NOTA: Las construcciones de fusión GFP-IgG se pueden obtener como se describe en este documento31. El gen asGFP se obtuvo y se optimizó la planta de este estudio45. Los siguientes pasos deben realizarse junto a un quemador Bunsen, y se deben aplicar técnicas asépticas básicas para evitar la contaminación.
<ol><li>Racha A. tumefaciens EHA105 que alberga el virus enano amarillo del frijol (BeYDV)19 vector de expresión vegetal para cada construcción (asGFP-IgG, GFP-IgG, cadena ligera) de una población de glicerol en agar LB (10 g/L triptona, 10 g/L NaCl, extracto de levadura de 5 g, 15 g/L agar, placa de kanamicina de 50 g/l).</li>
	<li>Crecer durante un día en una incubadora de pie de 30oC. Aísle una sola colonia para su verificación por protocolo PCR de pantalla de colonia estándar.</li>
	<li>Utilice colonia verificada para cada construcción. Llenar el tubo cónico con 10 ml de soporte LB (10 g/L de triptona, 10 g/L NaCl, 5 g de extracto de levadura, 50 g/ml). A continuación, agregue 10 l de kanamicina de 100 g/ml. Añadir 10 l de rifampina de 2,5 g/ml para evitar la contaminación por E. coli. Incubar a 30oC y 120-150 rpm durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, si la cultura Agrobacterium se cultiva aOD 600 a 0,6-0,9, se puede utilizar para la infiltración. Si está cubierto (OD600 > 1), 1-2 ml debe transferirse a LB fresco con antibióticos y cultivarse a la OD600requerida. Dependiendo de la concentración del cultivo inicial, puede tomar potencialmente dos días para crecer aOD 600 a 0.6-0.9.</li>
	<li>Una vez en el OD600apropiado, colocar los cultivos en una centrífuga, y peletizar las bacterias por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min, temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Decantar sobrenadante de ambas muestras, y luego resuspender cada pellet en tampón de infiltración 1x (10 mM 2-(N-morpholino) ácido etanoesulfónico, sulfato de magnesio de 10 mM, ajustado a pH 5.5 con KOH) para obtener OD final600 a 0,4. Esto debe tomar aproximadamente 15-45 mL de búfer de infiltración, dependiendo de la densidad de cultivo inicial. Combine volúmenes iguales de cada construcción de fusión De IgG con la construcción de la cadena ligera para obtener el OD final600 x 0,2 por construcción en cada tubo.</li>
</ol>3. Agroinfiltración de jeringa sin aguja
<ol><li>Tome un clip de papel enderezado y plantas de N. benthamiana de 5-6 semanas de edad en el paso 1. Usando el borde afilado del clip de papel, haga una pequeña punción en la primera capa epidérmica de la hoja en la superficie adaxial. Evita perforarlo hasta el final. NOTA: Las hojas inferiores son más fáciles de infiltrar, mientras que las hojas en la parte superior de la planta son más duras. Generalmente, la expresión de proteínas recombinantes es más alta en las hojas ubicadas en el medio de una planta, y estas hojas también se vuelven menos necróticas.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 ml, sin una aguja conectada, con la solución de Agrobacterium preparada del paso 2. Cubra el orificio hecho en el paso anterior con el extremo de la jeringa y empuje lentamente para inyectar las bacterias en la hoja mientras aplica una contrapresión suave desde detrás de la hoja. Observe cómo la hoja se oscurece mientras se inyecta la solución sin aplicar demasiada presión sobre la jeringa.</li>
	<li>Trate de infiltrarse en la mayor parte del área de la hoja en un máximo de 3-4 veces – el daño excesivo de la hoja puede obstaculizar el rendimiento proteico. La hoja de la planta infiltrada aparecerá en su mayoría oscura desde la vista inferior. NOTA: Esta solución bacteriana debe ser suficiente para al menos 3-4 plantas por construcción. Autoclave cualquier solución bacteriana restante antes de desecharla.</li>
</ol>4. Crecer y observar el N. benthamiana infiltrado
<ol><li>Colocar las plantas infiltradas de nuevo en la cámara de crecimiento y continuar regando diariamente.</li>
	<li>Observar las hojas para la clorosis y la necrosis en áreas infiltradas. Observe las plantas para la fluorescencia GFP (si la GFP está presente) bajo una lámpara UV de onda larga y corta.</li>
	<li>El día 4-5 muestra la fluorescencia más alta de ambas construcciones GFP en las hojas. Cosecha todas las hojas a 4-5 ppp (días después de la infiltración) y pesa el material total de la hoja.</li>
	<li>Utilícelo inmediatamente para el procesamiento posterior o guárdelo a -80 oC hasta que esté listo para usar.</li>
</ol>5. Extracción de proteínas
<ol><li>Mantenga los tampones y las tazas de la licuadora sobre hielo o a 4 oC antes de usarlos.</li>
	<li>Preparar 2-3 mL de tampón de extracción en frío (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 con HCl) por 1 g de material vegetal. Añadir 2 mM de fluoruro de fenimetilsulfonil (PMSF) de stock (100 mM) y ascorbato de sodio de 50 mM al tampón de extracción justo antes de la extracción.</li>
	<li>Coloque el tejido vegetal del paso 4 en la taza de licuadora prechilled. Agregue una cantidad medida de tampón de extracción refrigerada a la taza de la licuadora (como se indica en el paso 5.2). Coloque la taza de la licuadora en la licuadora. Tome una hoja precortada de parafilm y estírela sobre la parte superior de la taza de la licuadora. Licúe a la homogeneidad con intervalos de 20 segundos, revolviendo bien entre ciclos de mezcla según sea necesario.</li>
	<li>Transfiera material mezclado a un vaso de precipitados. Agregue una barra de agitación y revuelva a 4 oC durante 30 minutos para mejorar la solubilidad proteica y permitir la precipitación de sólidos.</li>
	<li>Coloque 2 capas de Miracloth sobre un vaso de precipitados limpio sobre hielo y vierta el extracto a través de él para eliminar los restos de hojas grandes. Después de que todo el extracto se vierta, doblar el Miracloth para exprimir el extracto de hoja residual. El extracto debe aparecer de color verde oscuro sin partículas visibles.</li>
	<li>Transfiera 50 l de esta muestra a un nuevo tubo de 1,5 ml y etiquete "extracto total" para su posterior análisis. Transfiera el extracto a tubos centrífugos. Centrifugar el resto del extracto de la planta a 16.000 x g durante 20 min, 4 oC y transferir el sobrenadante a un tubo cónico.</li>
	<li>Filtrar el extracto soluble con una jeringa de 50 ml y un filtro de fibra de vidrio de jeringa (0,75 m).</li>
	<li>Recoger 50 l de una muestra después de la centrifugación, etiqueta "extracto soluble" para su posterior análisis.</li>
</ol>6. Procedimiento de cromatografía de columnas de proteína G
NOTA: El protocolo descrito aquí es para cromatografía de flujo de gravedad utilizando resina de agarosa Pierce Protein G. Si utiliza una resina diferente, consulte las instrucciones del fabricante para los ajustes. Nunca deje que la resina se seque y evite que todo el líquido se drene. Vuelva a tapar la toma de corriente según sea necesario.
<ol><li>Configure una columna de polipropileno con 20 ml de muestra.</li>
	<li>Estimar la cantidad de lodos necesarios dependiendo del tipo de inmunoglobulina objetivo y su afinidad con la resina. Generalmente, 3 ml de lodo total con 1,5 ml de volumen de lecho es suficiente para la purificación de varios miligramos de Ab.</li>
	<li>Vierta cuidadosamente la cantidad necesaria de lodos resuspendidos en la columna tapada. Abra la salida de columna desde la parte inferior de la columna y permita que drene hasta que la mayor parte del búfer haya desaparecido.</li>
	<li>Verter inmediatamente 10 mL de tampón de lavado 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4,pH 7.4 con HCl) en la parte superior. Dejar drenar y repetir este paso de lavado 2x.</li>
	<li>Aplique la muestra filtrada del paso 5 a la columna y recoja el flujo continuo: alícuota de 50 ml de flujo para su posterior análisis. Guarde el resto del flujo en caso de que el Ab no se uniera a la resina. NOTA: Volver a aplicar flowthrough a una nueva columna no suele dar lugar a un buen rendimiento; por lo tanto, se aconseja comenzar con nuevo material de hoja.</li>
	<li>Lave la resina dos veces con 10 ml de 1x PBS para reducir la unión no específica. Si lo desea, alícuota de 50 ml de lavado a medida que el tampón drena a través de la columna para verificar que el Ab de destino no se eluía con un tampón de lavado.</li>
	<li>Configurar y etiquetar cinco tubos con 125 l de estéril 1 M Tris-HCl a pH 8. Esto es para neutralizar el Abs en el tampón de elución ácida para evitar posibles cambios estructurales. Alternativamente, agregue 30 l de base de 2 M Tris para obtener una muestra menos diluida. ADVERTENCIA: Durante la elución, se puede utilizar luz UV para la visualización. Esto no necesita hacerse durante la duración de la elución. Si se está utilizando UV, asegúrese de usar un EPP adecuado para evitar daños en los ojos y la piel. No es necesario utilizar una luz UV durante el paso de elución.</li>
	<li>Eluir el Abs aplicando 5 ml de tampón de elución (100 mM de glicina, pH 2.5 con HCl) a la columna y recoger 1 fracciones de ml a cada tubo designado desde el paso anterior.</li>
	<li>Regenere inmediatamente la columna aplicando 20 ml de tampón de lavado, seguido de 10 ml de tampón de lavado. Asegúrese de que la resina no se deja en un ambiente ácido durante un tiempo prolongado. Las eluciones deben aparecer fluorescentes, a menudo la fluorescencia más alta se ve en la segunda elución, pero puede variar de la extracción a la extracción.</li>
	<li>Para su almacenamiento, lave la resina con 10 ml de etanol al 20% en PBS y déjela drenar hasta la mitad. Recapitula la parte superior, luego la parte inferior de la columna, y manténgalo erguido a 4 oC. NOTA: Generalmente, las resinas de proteína G se pueden reutilizar hasta 10 veces sin pérdida significativa de eficiencia. Consulte las directrices del fabricante para obtener detalles específicos.</li>
	<li>Determinar la concentración de Ab utilizando un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nm, utilizando el búfer de elución en blanco. Conservar los eluidos en -80 oC y alícuota 50 ml de cada fracción en un tubo separado para su posterior análisis.</li>
</ol>7. SDS-PAGE para la detección de fusión GFP-Ig
<ol><li>Prepare todas las muestras antes de configurar SDS-PAGE.<ol>
<li>Añadir 4 l de tampón de muestra (6x tampón de muestra reductor: 3,0 ml de glicerol, 0,93 g de TDT, 1 g de SDS, 7 ml de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bromofenol azul); (6x tampón de muestra no reductor: 3,0 ml de glicerol, 1 g de SDS, 7 ml de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol) a 20 l de cada muestra (extracto total, extracto soluble, flujo a través, lavado, todas las fracciones de elución) para su análisis. Asegúrese de que las tapas del tubo estén bien sujetas.</li>
		<li>Tratar sólo la reducción de muestras durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, y luego poner las muestras durante 5 minutos en hielo. Gire las muestras en una microcentrífuga durante 5 s y cargue 20 ml de cada muestra en el orden de recogida en los pomos de gel. Cargue 3 ml de escalera de proteína de doble color en un pozo separado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute el gel SDS-PAGE a una separación constante de 100 V a la banda de proteína deseada; toma alrededor de 1,5 horas. Monitoree la escalera como un indicador de separación de proteínas.</li>
	<li>Visualice el gel bajo los rayos UV para observar la fluorescencia de la GFP.</li>
	<li>Si lo desea, manche el gel con la mancha de Coomassie para evaluar la proteína total en cada muestra. Alternativamente, realizar la mancha occidental para evaluar la proteína objetivo utilizando Abs específico. NOTA: Tanto la tinción de Coomassie como la mancha occidental se pueden realizar siguiendo los protocolos estándar47,48.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se puede utilizar para la verificación visual de cualquier proteína recombinante Ab o recombinante producida en plantas N. benthamiana, incluidas aquellas que requieren exposición temporal a ambientes ácidos para fines de purificación decolumnas 42,43,44. Además, la fusión de asGFP a otras proteínas en diferentes sistemas de expresión puede ser una herramienta útil para la visualización y educación experi...

Los informes de la industria indican que trece de los veinte medicamentos más graves de los Estados Unidos eran biológicos (productos farmacéuticos a base de proteínas), de los cuales nueve eran anticuerpos. En 2019, había más de 570 terapias de anticuerpos (Ab) en varias fases de desarrollo clínico1,2,3. Las ventas globales actuales de Ab superan los 100 mil millones de dólares, y se espera que el mercado terapéutico monoclonal Ab (mAb) genere hasta 300 mil millones de USD para 20251,4. Con una demanda tan alta y aumentos proyectados de los ingresos, los investigadores han estado trabajando para desarrollar formas de producir terapias Ab a una escala cada vez mayor, con mayor calidad y menores costos. Los sistemas de expresión a base de plantas tienen varias ventajas sobre las líneas celulares tradicionales de mamíferos para la fabricación asequible y a gran escala de Ab therapeutics5,6. La producción de terapias proteicas en plantas ("pharming molecular") no requiere costosos biorreactores o instalaciones de cultivo celular como lo hacen las técnicas tradicionales de cultivo celular de mamíferos7,8. Las plantas no pueden contraer patógenos humanos, minimizando la contaminación potencial9. Tanto la expresión de proteínas de origen vegetal transitoria como la transgénica pueden utilizarse como alternativas de menor costo a los sistemas de producción de mamíferos o bacterias10. Aunque las plantas transgénicas son preferidas para la producción de cultivos, la producción de proteína recombinante utilizando este método puede requerir semanas o meses. Los avances en la expresión transitoria utilizando vectores virales a través de jeringa o agroinfiltración al vacío permiten la producción a pequeña y gran escala, respectivamente, de la proteína deseada en los días11,12,13,14. La producción de mAbs contra el ébola, el dengue y el zika, y muchas otras proteínas recombinantes, se han producido y purificado rápida y eficientemente utilizando la expresión transitoria en las plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Estas circunstancias hacen de la expresión transitoria a base de plantas una opción atractiva para el desarrollo de múltiples terapias Ab y los métodos demostrados en este protocolo20.
Los mAbs de primera generación eran de derivación murina, lo que dio lugar a una inmunogenicidad no específica cuando se utiliza en ensayos en humanos21. Con el tiempo, los Abs quiméricos, humanizados y, finalmente, totalmente humanos, se produjeron para disminuir la inmunogenicidad inducida por las terapias Ab. Desafortunadamente, algunos de estos Abdominales todavía causan inmunogenicidad del huésped debido a diferencias en la glicosilación21. Los desarrollos en la ingeniería de plantas han permitido la modificación de los glicanos Ab, lo que es esencial ya que la estabilidad y la función de un Ab pueden verse significativamente afectadas por su estado de glicosilación22. Los avances han permitido la producción en sistemas vegetales de expresión de alto nivel de mAbs humanizados, que contienen glicanos humanos y, como resultado, los rasgos biológicos deseados de un fármaco humano producido en masa19,21.
Además de Abs recombinante, las moléculas de fusión Ab (Ab fusiones) se han explorado para varios propósitos en las últimas décadas. Las fusiones Ab a menudo consisten en un fragmento de Ab o Ab fusionado con una molécula o proteína y están diseñadas para provocar respuestas de las células efectoras inmunitarias23. Estas moléculas han sido creadas como posibles intervenciones terapéuticas para tratar diversas patologías como el cáncer y las enfermedades autoinmunes24,25,26,27. Los complejos inmunes recombinantes (RC) son otra clase de fusiones Ab que se han empleado como candidatos a vacunas28. Los RC aprovechan la capacidad del sistema inmunitario para reconocer las regiones Fc de las fusiones Ab y se ha encontrado para mejorar la inmunogenicidad cuando se combina con otras plataformas de vacunas29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) es una proteína bioluminiscente derivada de la medusa Aequorea Victoria, que emite luz verde cuando se excita por la luz ultravioleta32,33. A lo largo de los años, el uso de GFP como marcador visual de expresión génica se ha expandido de la expresión en Escherichia coli a numerosos sistemas de expresión de proteínas, incluyendo plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Los marcadores visibles, como la GFP, tienen abundantes implicaciones en la enseñanza y el aprendizaje de conceptos científicos. Numerosos estudiantes de nivel básico describen dificultades para captar conceptos científicos cuando la idea que se enseña no es visible a simple vista, como los conceptos de biología molecular y campos relacionados39. Por lo tanto, los marcadores visuales, como la GFP, pueden contribuir al procesamiento de la información relacionada con los procesos científicos y podrían ayudar a reducir las dificultades que los estudiantes reportan para aprender numerosos conceptos científicos.
Aunque la GFP se utiliza a menudo como un marcador para indicar el gen y la expresión in vivo,es difícil visualizarlo en los procesos posteriores si se utilizan condiciones ácidas. Esta circunstancia se debe principalmente a que la GFP no mantiene su estructura y la fluorescencia resultante a un pH bajo40. Los ambientes ácidos temporales a menudo son necesarios en varios procesos de purificación, tales como proteína G, proteína A, y cromatografía de proteína L, a menudo utilizado para la purificación Ab41,42,43,44. Los mutantes GFP se han utilizado para retener la fluorescencia en condiciones ácidas45,46.
Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de proteínas de fusión IgG recombinantes en plantas N. benthamiana. Producimos GFP tradicional fusionado con el N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión GFP-IgG. Simultáneamente, desarrollamos la fusión de una secuencia optimizada para codón de planta para un GFP estable en ácido (asGFP) al N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión asGFP-IgG. Las ventajas de producir GFP-IgG incluyen la capacidad de visualizar la presencia de una proteína diana durante la expresión, mientras que asGFP-IgG permite ver la presencia de proteína recombinante no sólo en los pasos de expresión y extracción, sino también en los pasos de purificación de la proteína. Este protocolo se puede adaptar para la producción, purificación y visualización de una gama de proteínas de fusión GFP producidas en N. benthamiana y purificadas mediante técnicas de cromatografía que requieren un pH bajo. El proceso también se puede adaptar a varias cantidades de material de hoja. Si bien el abs y las proteínas de fusión etiquetadas con GFP o asGFP no están destinadas a ser utilizadas para terapias, estos métodos pueden ser útiles como controles durante los experimentos y también pueden utilizarse como una herramienta de enseñanza para la biología molecular y celular y la biotecnología, tanto en persona como virtualmente.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 5 mL</td>: <td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 mL</td>: <td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Licuadora con tazas,</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ( Etilenedinitrilo)ácido tetraacético</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (ácido clorhídrico)</td><td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>cualquier proveedor de confianza</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 con pellets de turba</td><td>de agujero Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro de potasio)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (Fosfato</td> de potasio)<td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (Hidróxido de potasio)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla para macetas con control de humedad</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Fosfato de sodio)</td><td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (cloruro de sodio)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Semillas de Nicotiana benthamiana</td><td>cualquier proveedor de renombre</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fluoruro de fenilmetilsulfonilo)</td><td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Columna de polipropileno</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Estándares de color dual</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Resina de proteína G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (sulfato de dodecilo de sodio)</td><td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>cualquier proveedor de renombre</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0.75 y micro; m filtro de fibra de vidrio</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja para pellets de turba con cúpula</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV</td><td>cualquier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soluble en agua para todo uso Alimento Vegetal</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de proteínas de fusión igg expresada transitoriamente en nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

La alta demanda de anticuerpos como intervenciones terapéuticas para diversas enfermedades infecciosas, metabólicas, autoinmunes, neoplásicas y otras factores crea una creciente necesidad en el desarrollo de métodos eficientes para la producción de anticuerpos recombinantes. A partir de 2019, había más de 70 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, y hay un potencial de crecimiento exponencial. A pesar de su promesa, los factores limitantes para un uso generalizado son los costos de fabricación y la complejidad. Potencialmente, las plantas ofrecen estrategias de fabricación de proteínas de bajo costo, seguras y fácilmente escalables. Plantas como Nicotiana benthamiana no sólo pueden plegar y ensamblar correctamente proteínas complejas de mamíferos, sino que también pueden añadir modificaciones post-traduccionales críticas similares a las ofrecidas por los cultivos celulares de mamíferos. En este trabajo, mediante el uso de GFP nativa y una variante ácida estable de proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con anticuerpos monoclonales humanos, pudimos visualizar todo el proceso transitorio de expresión y purificación de anticuerpos de plantas N. benthamiana. Dependiendo del propósito del experimento, la fusión nativa de GFP puede garantizar una visualización más fácil durante la fase de expresión en las plantas, mientras que la fusión de PFN estable en ácido permite la visualización durante el procesamiento posterior. Este procedimiento escalable y directo puede ser realizado por un solo investigador para producir cantidades de miligramos de proteínas de fusión de anticuerpos o anticuerpos altamente puras en cuestión de días utilizando sólo unas pocas plantas pequeñas. Tal técnica puede extenderse a la visualización de cualquier tipo de proceso de purificación de anticuerpos y potencialmente muchas otras proteínas, tanto en plantas como en otros sistemas de expresión. Además, estas técnicas pueden beneficiar instrucciones virtuales y ser ejecutadas en un laboratorio de enseñanza por estudiantes de pregrado que poseen una experiencia previa mínima con técnicas de biología molecular, proporcionando una base para la exploración basada en proyectos con aplicaciones del mundo real.

Este estudio demuestra un método fácil y rápido para producir proteínas recombinantes y visualizarlas a través de procesos posteriores. Usando N. benthamiana y siguiendo el protocolo proporcionado, la producción de proteína recombinante descrita aquí se puede lograr en menos de una semana. El flujo de trabajo general de expresión, extracción y purificación de la planta se muestra en la Figura 1. Las etapas de crecimiento de la planta a partir de plántulas viejas de 2 semanas, planta...

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

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Esta es una demostración de un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con la GFP en plantas Nicotiana benthamiana relacionadas con el tabaco. Este protocolo se puede utilizar para la purificación y visualización de anticuerpos producidos por plantas, fusiones de anticuerpos y la mayoría de las proteínas que se pueden purificar a través de la cromatografía de columna. Este protocolo permite a investigadores y estudiantes de laboratorios de trabajo universitarios visualizar proteínas etiquetadas por GFP en la mayoría de los pasos del proceso de producción de proteínas.Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, agua todavía caliente sobre los pellets de turba para una expansión completa. Los pellets tardarán unos minutos en expandirse por completo. Después de que los palets se expandan por completo, coloque de dos a tres semillas de Nicotiana benthamiana en cada pellet de turba utilizando pinzas.Después de esto, tendrá que verter alrededor de 0,5 pulgadas de agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. No olvide etiquetar la bandeja con la fecha de siembra. Continúe regando las plánt

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Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Aprende a expresar y purificar proteínas de fusión IgG-GFP en Nicotiana benthamiana mediante cromatografía de columna. Este método permite visualizar anticuerpos recombinantes en cada etapa del proceso.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

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