Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon
22 de enero de 2021
Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.
Este nuevo método de culturas esferoides se puede utilizar para estudiar el tumorigenicity para analizar la presencia de diversas poblaciones de células madres del cáncer y también se puede aplicar muy bien a para a través de la pantalla del alto put para las nuevas drogas. Este es un sistema cultivado robusto y repetitivo para generar un gran número de esferoides de tamaño homogéneo. Además, estos esferoides se pueden utilizar para estudiar las células madre cancerosas.
Este método está configurado para estudiar la biología del cáncer crónico, pero se puede configurar fácilmente para estudiar otros tipos de cáncer cambiando las condiciones del cultivo 3D. Asegúrese de estar atento a las burbujas en el medio, para no mover demasiado la placa durante la formación de esferoides y tener cuidado al cosechar los esferoides en el colador. Comience por pre-tratar los pozos de una placa de 24 pozos con 500 micro litros de solución de enjuague antia adherencia por pozo.
Después de unos segundos centrífuga la placa en rotor de cubo oscilante y enjuague cada pozo con 2 mililitros de medio basal caliente. Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que las burbujas se han eliminado por completo de los micro pozos. Si no se observan burbujas, enjuague los pozos de nuevo antes de agregar un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM caliente a cada pozo.
Para inducir la formación de esferoides, ver la concentración deseada de células Caco-2 en una monocapa 2D en un plato de 10 centímetros en DMEM complementado con 10%FBS y 1%antibióticos. Para el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera humidificada. Cuando se alcance una confluencia del 80%, lave las células con cinco mililitros de PBS antes de tratar el cultivo con dos mililitros de Tripsina-EDTA durante dos a cinco minutos a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Cuando las células se han desprendido neutralizar la tripsina con cuatro mililitros de DMEM completo. Después de contar, recoger las células por centrifugación y resuspend la paleta en el volumen apropiado de dmem sótano de la matriz de la matriz para lograr la concentración deseada de células en un mililitro de medio por pozo. Agregue un mililitro de células a cada pozo de la placa de 24 pozos prepagada, seguido de la adición de un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM a cada pozo.
Después de la siembra, centrifugue inmediatamente la placa y use un microscopio de luz para verificar que las células se hayan distribuido uniformemente a través de los micro pozos. Luego coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas sin perturbar las células. Para cosechar los esferoides, al final de la incubación, utilice una pipeta serológica y la mitad del sobrenadante en cada pozo para desalojar suavemente los esferoides de sus micro pozos.
Cuando todos los esferoides se han separado, use la pipeta para transferir cuidadosamente los cultivos 3D de cada pozo a un colador reversible de 37 micras en la parte superior de un tubo cónico de 15 mililitros. Lave cada pozo tres veces con un mililitro de medio basal precalñado por lavado para recolectar los esferoides restantes y agregue estos esferoides adicionales al colador. Después del último lavado, revise la placa bajo el microscopio para confirmar que todos los esferoides se han eliminado de los micro pozos.
Luego invierta el colador sobre un nuevo tubo de 15 mililitros y lave la parte inferior del colador con un medio fresco de matriz de membrana basal DMEM para recoger los esferoides en el tubo. Los esferoides están aumentando de 500 células demuestran el aumento más homogéneo en tamaño en un en un plazo. Con 500 y 600 células por esferoide determinar que es el número óptimo de células bajo las cuales se puede lograr un buen crecimiento y baja variabilidad.
La adición de la matriz de la membrana del sótano aumenta crecimiento y homogeneidad del esferoide. En cultivo a largo plazo, las células aparecen como densas capas múltiples en el tercer día. Mientras que las células aplanadas dispuestas en mono capas son claramente visibles en el día 10.
Curiosamente, un lumen aparece dentro de los esferoides desde el quinto día en adelante. Además, un aumento claro en células positivas del antígeno nuclear de la célula de la proliferación se observa en los días cinco y siete que disminuye por el día 10. Sorprendentemente, caspace activado 3 se observa en muy pocas células en los días tres y cinco solamente.
Mientras que los altos niveles de expresión de beta-catenina se observan en cada punto de tiempo. El potencial de los esferoides para diferenciarse en anterositas es evidenciado por su fosfatasa alcalina y expresión de la familia de portadores de soluto 2A5 mRNA. Además, estos esferoides expresan marcadores típicos de células madre cancerosas y responden a los tratamientos de quimioterapia combinada administrados rutinariamente a pacientes con cáncer colorrectal.
Así que los esferoides están compuestos de diferentes poblaciones celulares. Entonces se pueden utilizar muy bien para analizar las respuestas específicas de la célula a los estímulos tales como refractores y eventual para las respuestas de la droga.
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Descripción general
Este protocolo presenta un sistema de cultivo robusto para generar esferoides tridimensionales a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2. Este método permite el estudio de la biología de las células madre cancerosas y su respuesta a la quimioterapia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender las células madre cancerosas es fundamental para desarrollar terapias efectivas.
- Los cultivos en esferoides tridimensionales imitan los entornos tumorales in vivo.
- Este método puede adaptarse para diversos tipos de cáncer.
- La robustez y la reproducibilidad son esenciales para la validez experimental.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para el cultivo de esferoides a partir de células Caco2.
- Investigar la tumorigenicidad y las poblaciones de células madre cancerosas.
- Facilitar la selección de alto rendimiento para nuevos fármacos.
Métodos Utilizados
- Pretratamiento de pozos con solución de enjuague antiadherente.
- Manipulación cuidadosa para evitar burbujas durante la formación de esferoides.
- Recolección de esferoides utilizando un colador.
- Monitoreo de las condiciones de cultivo para un crecimiento óptimo.
Resultados Principales
- Generación exitosa de esferoides de tamaño homogéneo.
- Aplicabilidad demostrada para el estudio de células madre cancerosas.
- Potencial para aplicaciones en cribado de fármacos.
- Adaptabilidad a otros tipos de cáncer mediante la modificación de las condiciones de cultivo.
Conclusiones
- Este método proporciona una nueva herramienta para la investigación del cáncer.
- Mejora la comprensión de la dinámica de las células madre cancerosas.
- Estudios futuros pueden aprovechar este sistema para el desarrollo de terapias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de esferoide tridimensional aborda la necesidad crítica de sistemas preclínicos que recapitulen la heterogeneidad tumoral y los fenotipos de células madre cancerosas (CSC), permitiendo una evaluación más predictiva de dianas terapéuticas y respuestas a fármacos en la investigación del cáncer colorrectal. Al proporcionar una plataforma reproducible para el enriquecimiento prolongado de CSC y la evaluación de la respuesta a la quimioterapia, el método apoya los esfuerzos de validación temprana de dianas y la identificación de compuestos prometedores con una mayor confianza traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la heterogeneidad de las Células Madre Cancerosas (CSC) y su potencial tumorigénico mediante patrones diferenciales de proliferación y estructuras similares a lúmenes dentro de los esferoides.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas al enriquecer células CSC que expresan marcadores establecidos, facilitando la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis terapéuticas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera esferoides de tamaño homogéneo a partir de entradas celulares definidas, creando un sistema estandarizado para el análisis cuantitativo de la respuesta a fármacos.
- Valor operativo: Compatible con flujos de trabajo de cribado de alto rendimiento debido a su robustez, reproducibilidad y facilidad de recolección de esferoides mediante métodos basados en filtros.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la expresión de marcadores de CMC y la respuesta a quimioterapia combinada de relevancia clínica, lo que permite modelar preclínicamente la resistencia y sensibilidad al tratamiento.
- Valor operativo: Mantiene los fenotipos de CMC durante cultivos a largo plazo, facilitando estudios longitudinales sobre la eficacia de fármacos y los mecanismos de recurrencia tumoral.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, especialmente para programas de oncología centrados en terapias dirigidas a células madre cancerosas y en mecanismos de resistencia.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante la modelización de nichos de CSC y de respuestas diferenciales a fármacos en un contexto tridimensional.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante la formación de esferoides homogéneos en tamaño, lo que apoya la selección confiable de compuestos frente a poblaciones enriquecidas en CSC.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas mediante la expresión de marcadores de CSC, marcadores de proliferación (PCNA) y marcadores de apoptosis (Caspasa-3 activada) para comparar condiciones de tratamiento.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar la respuesta a la quimioterapia en un sistema relevante para la enfermedad que refleja la heterogeneidad del adenocarcinoma colorrectal.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otros tipos de cáncer mediante la modificación de las condiciones de cultivo tridimensional, lo que la posiciona como una plataforma reutilizable en diversos programas de descubrimiento en oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de dianas al capturar la heterogeneidad tumoral impulsada por las células madre cancerosas y las propiedades funcionales de pluripotencialidad ausentes en modelos bidimensionales.
- Valor operativo: Proporciona reproductibilidad y escalabilidad mediante siembra estandarizada, pretratamiento antiadherente y recolección basada en filtros, reduciendo la variabilidad en la generación de esferoides.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de compuestos dirigidos a células madre cancerosas y a los mecanismos de resistencia, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos líderes basándose en datos de modulación de células madre cancerosas y respuesta a quimioterapia obtenidos de un modelo fisiológicamente relevante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo celular tridimensional, incluyendo el tratamiento de superficies antiadherentes y un manejo cuidadoso para prevenir la formación de burbujas durante la iniciación de los esferoides.
- Depende del acceso a matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) y equipo estándar de cultivo celular, incluyendo centrífugas, filtros (37 micrones) y microscopios invertidos para el monitoreo.
- Requiere la estandarización entre equipos de la densidad de siembra (500–600 células/esferoide) y del tiempo de incubación para asegurar homogeneidad y reproducibilidad entre experimentos.
- La adaptación a otros tipos de cáncer requiere la optimización de la concentración de la matriz de membrana basal y de la duración del cultivo, según la adhesión específica de la línea celular y la cinética de formación de esferoides.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un manejo suave durante la recolección para evitar la disrupción de los esferoides y la posible variabilidad en el momento de formación del lumen entre diferentes lotes.
