Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Однореакторная пробоподготовка с помощью носителей белка в сочетании с жидкостной хроматографией (LC) - мониторингом выбранных реакций (SRM), называемой cLC-SRM, является удобным методом мультиплексного таргетного протеомного анализа небольшого числа клеток, включая одиночные клетки. Он извлекает выгоду из использования избыточного экзогенного белка в качестве носителя и высокоспецифичного LC-SRM для целевого количественного определения.
Анализ белков небольшого числа клеток человека в основном достигается с помощью таргетированной протеомики с иммунологическими анализами на основе антител, которые имеют присущие им ограничения (например, низкая мультиплексность и недоступность антител к новым белкам). Таргетная протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) появилась в качестве альтернативы, поскольку она не содержит антител, обладает высокой мультиплексностью и высокой специфичностью и точностью количественного анализа. Последние достижения в области аппаратуры для РС делают возможной таргетную протеомику на основе РС для мультиплексного количественного определения высокораспространенных белков в отдельных клетках. Тем не менее, существует техническая проблема эффективной обработки одиночных клеток с минимальными потерями образца для анализа МС. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали удобную однокамерную пробоподготовку с помощью носителей белка в сочетании с жидкостной хроматографией (LC) - выбранным мониторингом реакций (SRM), называемой cLC-SRM, для целевого протеомного анализа небольшого количества клеток человека. Этот метод основан на использовании комбинированного избыточного экзогенного белка в качестве носителя и малообъемной однореакторной обработке для значительного снижения поверхностных потерь на адсорбции, а также на высокоспецифичном LC-SRM для эффективного решения проблемы повышенного динамического диапазона концентраций из-за добавления экзогенного белка-носителя. Его полезность была продемонстрирована точным количественным определением наиболее умеренно распространенных белков в небольшом количестве клеток (например, 10-100 клеток) и высокораспространенных белков в отдельных клетках. Простота реализации функций и отсутствие необходимости в специальных устройствах делают этот метод легко доступным для большинства лабораторий протеомики. В данной работе мы предоставили подробный протокол для анализа cLC-SRM небольшого числа клеток человека, включая сортировку клеток, лизис и переваривание клеток, анализ LC-SRM и анализ данных. Необходимо дальнейшее повышение чувствительности обнаружения и пропускной способности образца для целевого протеомного анализа одиночных клеток. Мы ожидаем, что cLC-SRM будет широко применяться в биомедицинских исследованиях и системной биологии с потенциалом для содействия точной медицине.
Последние технологические достижения в области геномики (транскриптомики) позволяют проводить всесторонний и точный анализ генома (транскриптома) в отдельных клетках 1,2,3. Тем не менее, технологии протеомики одиночных клеток сильно отстают, но не менее важны, чем технологии геномики (транскриптомики) 4,5,6,7,8. Кроме того, распространенность белка не обязательно может быть выведена из обилия мРНК....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговый анализ cLC-SRM показан на рисунке 1.
1. Предварительная обработка ПЦР-пробирок
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Небольшие количества клеточных лизатов MCF7 (0,5-20 нг, что эквивалентно 5-200 клеткам) были впервые использованы для оценки эффективности cLC-SRM путем целенаправленного количественного определения белков пути EGFR/MAPK, поскольку они более однородны с меньшими вариациями по сравнению с небольшим числом клеток, отсортированных с помощью FACS. Как показано на рисунке 2A, XIC ясно детектируют обнаружение SRM-переходов для ATADDELSFK, полученных из GRB2, присут.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
cLC-SRM — это удобный метод таргетной протеомики, который позволяет проводить точный мультиплексный анализ белков небольшого числа клеток, включая одиночные клетки. Этот метод основан на однореакторной пробоподготовке с помощью носителей белка, в которой все этапы, включая сбор клеток, многоступенчатый лизис и разложение клеток, а также перенос пептидных расщеплений в капиллярную колонку LC для анализа МС, выполняются в одном горшке (например, в одной пробирке или одной лунке) (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана грантами NIH R21CA223715 (TS) и UG3CA256967 (TS и HL). Описанная здесь экспериментальная работа была выполнена в Лаборатории молекулярных наук об окружающей среде Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории, национальном научном пользовательском объекте, спонсируемом Министерством энергетики Соединенных Штатов Америки в соответствии с контрактом DE-AC05-76RL0 1830.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2 мл стеклянный флакон LC | Microsolv | 9502S-WCV | Сосуд для хранения ПЦР-пробирки для автоматического введения образца |
| BSA | Sigma-Aldrich | P0834-10× 1 мл | белка-носителя для значительного снижения потерь поверхностной адсорбции |
| DTT | Thermo Scientific | A39255 | Реагент для восстановления |
| муравьиной кислоты | Thermo Scientific | 28905 | Реагент для остановки ферментативной реакции |
| IAA | Thermo Scientific | A39271 | Реагент для алкилирования |
| Внутренние стандарты пептида | Новая АнглияТаргетное количественное определение белков пути EGFR/MAPK | ||
| в трубке ОТ-ПЦР | GeneMate Bioexpress | T-3035-1 | 0,2 мл ПЦР-пробирка для одногорочной пробоподготовки |
| Программное обеспечение Skyline | Университет Вашингтона | Общедоступно для анализа данных SRM | |
| Ультразвуковой | аппарат Hielscher Ультразвуковая технология | UTR200 | Ультразвуковая обработка ультразвуком на льду для лизиса клеток |
| Speed Vac концентратор | Thermo Scientific | Снижение процента TFE для эффективного расщепления трипсина | |
| TFE | Sigma-Aldrich | 18370-10&раз; 1 мл | 60% TFE для лизиса клеток |
| Термоамплификатор с подогреваемой крышкой | Термоамплификатор Пельтье | PTC-200 | Нагреватель для денатурации белка |
| Trypsin Gold | Promega | V528A | Фермент для переваривания белка |
| Вода BEH Колонна С18 | Вода | С18 колонна для разделения пептидов |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно