Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

Este protocolo proporciona un método para realizar comparaciones precisas lado a lado de la eficacia relativa de los compuestos antifúngicos volátiles y no volátiles en diferentes etapas de crecimiento de los hongos. Este método es muy adecuado para evaluar la actividad antifúngica de los productos derivados de plantas utilizados en formas secas o líquidas que contienen una amplia diversidad de moléculas. Este método puede proporcionar información valiosa sobre el modo de aplicación de los productos derivados de plantas y es especialmente adecuado en el campo del control biológico.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Valentina Gligorijevic, ingeniera asistente del laboratorio Sup'Biotech. Para la recolección de conidios, coloque tres mililitros de 0.05%Tween 20 en un cultivo de micelio de trichoderma y use un rastrillo para liberar los conidios de los conidióforos, teniendo cuidado de no presionar el micelio para evitar que las hifas se arranquen. Cuando se hayan liberado todos los conidios, use una micropipeta para recuperarse rápidamente y agregue la solución de conidios a un tubo de 15 mililitros para contar.

Para preparar placas de hongos, deposite 100 microlitros de esporas a una concentración de tres veces 10 a seis esporas por mililitro en una placa de Petri de nueve centímetros que contenga medio PDA, y use una espátula estéril para agregar 10 gramos de cuentas de vidrio de dos milímetros de diámetro a la placa. A continuación, agite suavemente la placa hacia delante y hacia atrás y gire y gire la placa en segmentos de 90 grados hasta que se haya girado por completo para distribuir uniformemente las esporas por la superficie del agar. Luego incubar la placa a 30 grados centígrados hasta el análisis de inhibición del crecimiento.

Para realizar un ensayo de inhibición de contacto con ajo en polvo, utilice una espátula estéril para pesar la cantidad deseada de ajo en polvo en tubos individuales de 50 mililitros. para obtener concentraciones que generalmente oscilan entre 0,25 y 16 miligramos por mililitro. Agregue 10 mililitros de aproximadamente 45 grados Celsius PDA a cada tubo e invierta cuidadosamente cada tubo varias veces para distribuir uniformemente el polvo por todo el agar.

Rápidamente, vierta las suspensiones homogeneizadas en placas de Petri de cinco centímetros de diámetro y deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente. Para realizar un ensayo de inhibición de contacto, use un tubo de acero inoxidable estéril de cinco milímetros de diámetro para trazar un círculo en el centro del agar en las placas de control y tratados con compuestos antifúngicos, y use un palillo de dientes estéril para desechar los cilindros de agar. A continuación, utilice un nuevo tubo de acero inoxidable de cinco milímetros de diámetro para trazar de 15 a 20 círculos al azar en las placas fúngicas, y utilice palillos de dientes estériles para transferir con cuidado las esporas, las hifas o los cilindros cubiertos de micelio a las regiones vacías de las placas PDA.

Luego regrese las placas a la incubadora a 30 grados centígrados. Para preparar placas para un ensayo de inhibición antifúngica en fase de vapor, vierta 10 mililitros de medio PDA en la tapa de una placa de Petri de cinco centímetros de diámetro que contenga 10 mililitros de medio PDA que contenga compuestos antifúngicos o medio PDA solo, y deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente. Usando un tubo centrífico de 50 mililitros como herramienta de calibración, haga un círculo de PDA en el centro del agar y use una espátula estéril para quitar el agar alrededor del círculo.

Use un tubo de acero inoxidable estéril de cinco milímetros de diámetro para trazar un círculo en el centro del medio en la tapa y use un palillo de dientes estéril para desechar el cilindro de la barrena. A continuación, utilice un tubo estéril de acero inoxidable de cinco milímetros de diámetro para hacer tapones al azar en las placas fúngicas preparadas, y utilice un palillo estéril para transferir cuidadosamente las esporas, las hifas o los tapones recubiertos de micelio a las tapas de las placas de ensayo. En este análisis, se evaluó la inhibición del crecimiento de la especie SBT 10-2018 de trichoderma desencadenada por tres compuestos antifúngicos mediante ensayos de inhibición de fase de contacto y vapor, como se demostró para cada etapa fúngica.

Se observó una mayor sensibilidad de las esporas a la carbendazima en comparación con las redes tempranas de hifas y micelio cuando trichoderma y compuestos antifúngicos estaban en contacto. Por el contrario, el carbendozim no tuvo ningún efecto antifúngico sobre Trichoderma cuando el hongo se colocó a una distancia del fungicida de acuerdo con la baja volatilidad de esta sustancia. Cuando se utilizó el aceite esencial de thymus vulgaris como compuesto antifúngico, se observó una mayor sensibilidad para las esporas y las hifas tempranas en comparación con la inhibición del crecimiento del micelio al 0,025% de aceite esencial.

Como era de esperar, el aceite esencial de thymus vulgaris presentó idéntica actividad antifúngica independientemente de la distancia entre el hongo y el aceite. Cuando se utilizó ajo en polvo, se observó una mayor eficacia contra la germinación de esporas y la elongación temprana de las hifas que para el crecimiento del micelio. Se debe prestar especial atención durante la preparación de la placa fúngica para asegurarse de que las esporas se distribuyan uniformemente en la superficie de la placa de agar para garantizar resultados comparables.