Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptoglycomics utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El uso de algoritmos bioinformáticos permite el análisis, la extracción y la comparación de datos de especificaciones masivas en una colección de archivos de datos simultáneamente, lo que disminuye la carga de trabajo y aumenta la precisión. La comprensión de las diversas variaciones y modificaciones del peptidoglicano tiene implicaciones en la comprensión de los procesos celulares, incluidos el crecimiento y la división, la evasión inmunitaria del huésped y la resistencia a los antimicrobianos.

Recomendamos preparar y analizar primero un pequeño subconjunto de muestras para familiarizarse con el protocolo y que actúe como proyecto piloto para evaluar los parámetros experimentales. Dado que el software de análisis de datos de espectrometría de masas a menudo varía en las definiciones que se utilizan al describir características y funciones, la demostración visual ayudará a los usuarios a aplicar este protocolo en todas las plataformas. Para la extracción de sáculos de peptidoglicano, vuelva a suspender los gránulos de células congeladas a aproximadamente uno a 10 del volumen de cultivo original en fosfato de sodio de 20 milimolares a cuatro grados Celsius antes de agregar la suspensión celular gota a gota a ebullición de 8% SDS en fosfato de sodio de 20 milimolares hasta un volumen final de uno a uno.

Mantenga un hervor suave durante 30 minutos a tres horas con agitación para asegurar la disociación completa de la membrana. La mezcla resultante debe ser completamente transparente, sin grumos celulares ni viscosidad restantes. Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, recoja los sáculos por ultracentrifugación, seguido de cinco a siete lavados en aproximadamente 50 mililitros de fosfato de sodio de 20 milimolares a temperatura ambiente por lavado hasta que el tampón de lavado tenga una concentración de SDS de aproximadamente 0.001% según lo determinado por tinte colorimétrico.

Después del último lavado, vuelva a suspender los sáculos en 5 a 10 mililitros de fosfato sódico de 20 milimolares a temperatura ambiente y complemente la muestra con 50 microgramos por mililitro de amilasa, DNasa y ARNasa en sulfato de magnesio de 10 milimolares para una incubación de una hora con agitación o nutación a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, digiere la reacción durante la noche con 100 microgramos por mililitro de pronasa a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, después de la ultracentrifugación, hervir la muestra durante una hora en 25 mililitros de 2% de SDS y 20 milimolares de fosfato de sodio en una vaporera.

Al final de la incubación, lave la muestra de cinco a siete veces con 50 mililitros de agua destilada doble a temperatura ambiente, como se demuestra. Cuando la concentración de SDS alcance aproximadamente el 0,001%, vuelva a suspender el pellet en una cantidad suficiente de agua bidestilada para obtener una suspensión de sáculos y lave el recipiente. Después del almacenamiento durante la noche a menos 80 grados centígrados, liofilice la muestra congelada antes de diluir los sáculos a 10 miligramos de peptidoglicano por mililitro de concentración de agua destilada doble.

Para el análisis de LC-MS, inicie un nuevo proyecto en el software del instrumento y asigne los archivos de datos LC-MS QTOF apropiados a la condición experimental de interés. Ejecute la extracción de características recursivas por lotes del asistente de procesamiento de datos y configure los filtros de procesamiento de datos para que coincidan con los parámetros de las condiciones y la instrumentación de LC-MS para identificar, agrupar y verificar con precisión los picos de masa a carga que representan mutopéptidos individuales. Revise los resultados al final de la extracción de características.

Si un número significativo de entidades no se pudo alinear en un grupo, ajuste los parámetros de filtrado recursivo para ampliar o restringir la ventana de detección según sea necesario. A continuación, exporte los datos como un archivo de intercambio compuesto. Para el análisis de características espectrales diferenciales, inicie un nuevo proyecto en el software del sistema y siga las instrucciones para la importación de datos.

Durante el análisis de datos, seleccione la significación y el cambio de pliegue para el análisis diferencial y establezca los datos de referencia en la intensidad mediana en todos los archivos de datos. Una vez completado el análisis, examine los análisis gráficos y estadísticos resultantes para identificar los muropéptidos que demuestren un cambio significativo en la abundancia entre las condiciones experimentales probadas. En el navegador de proyectos, haga clic con el botón derecho del ratón en los distintos análisis y seleccione una opción de exportación para guardar los detalles de la entidad como un archivo tsv.

Asegúrese de guardar varios análisis para obtener todos los datos relevantes. Dentro del software de análisis diferencial, en la interpretación de resultados, seleccione Explorador de ID, agregue una biblioteca de estructuras de muropéptidos esperadas y seleccione parámetros similares como se muestra para la extracción de características para producir una anotación de coropóptido predicho para cada característica identificada. Para confirmar manualmente la anotación de muropeptido predicha, compare los picos de la relación masa-carga del cromatograma de espectrometría de masas en tándem con la relación masa-carga predicha de todas las posibles fragmentaciones de una estructura de mutopéptido conocida.

Utilice un editor molecular para dibujar la estructura de muropeptido predicha utilizando la herramienta de fragmentación de masa para mostrar la relación masa-carga de los fragmentos de espectrometría de masas cuando cada enlace se rompe individualmente o en combinación, y luego compare todas las posibles fragmentaciones de la estructura de mutopéptido con el cromatograma de espectrometría de masas en tándem. Para confirmar la anotación de la muropeptida, los picos de la relación masa-carga de múltiples fragmentos deben encontrarse en el cromatograma de espectrometría de masas en tándem con una ventana de alineación de la relación masa-carga mínima. Para evaluar los cambios globales en las modificaciones de los muropeptidos, edite el archivo tsv de los muropeptidos de cambio de pliegue alto estadísticamente significativos para incluir una sola columna para cada modificación de muropeptidos.

Rellene esta columna con una designación para cada muropeptido anotado y cargue el archivo tsv modificado en Perseus. En Anotar filas, haga clic en Anotar filas categóricamente y agregue archivos de datos a cada parámetro experimental. Luego, en la prueba, haga clic en dos pruebas de muestra para realizar la prueba T de un estudiante y haga clic en 1D para realizar la anotación 1D.

Una mayor sensibilidad de detección de la maquinaria de espectrometría de masas, junto con un software de reconocimiento de picos de alta potencia, ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias complejas con detalles muy minuciosos. La asociación de cada pico de masa a carga extraído de los datos de espectrometría de masas con un muropeptido particular se facilita mediante referencias cruzadas con una base de datos de estructuras de muropéptidos conocidas y predichas. El cromatograma de espectrometría de masas en tándem de fragmentación para cada característica extraída se puede comparar con el perfil de fragmentación del muropéptido propuesto utilizando la base de datos.

Los diagramas de volcanes se pueden utilizar para resaltar los muropéptidos que demuestran un cambio de abundancia de alta magnitud estadísticamente significativo entre las condiciones probadas. Cuando se examinan juntos, se pueden examinar múltiples muropeptidos que poseen la misma modificación para determinar una tendencia hacia una condición experimental y se puede evaluar la importancia de todo el grupo. El seguimiento de una modificación de un muropéptido de esta manera puede identificar una actividad enzimática particular que se ve afectada por el parámetro experimental.

Además, los valores atípicos de esta tendencia pueden revelar actividades enzimáticas con una especificidad o función biológica particular. Este procedimiento examina los cambios bioquímicos y las variaciones biológicas en los polímeros, proporcionando así información sobre la actividad enzimática que actúa sobre el PG in vivo. Examinar la composición de PG en detalle ayudará en la comprensión de estructuras celulares complejas que tienen implicaciones para muchos procesos fisiológicos críticos.