Name: Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende análisis semicuantitativo de peptidoglicano mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática. Este método computacional permite examinar la composición del peptidoglicano con alta precisión y eficiencia.

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Jennifer Geddes-McAlister y al Dr. Anthony Clarke por sus contribuciones en el perfeccionamiento de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas del CIHR otorgadas a C.M.K (PJT 156111) y un NSERC Alexander Graham Bell CGS D otorgado a E.M.A. Las figuras se crearon en BioRender.com.

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe un método para purificar peptidoglicano de cultivos bacterianos, procesar para la detección de LC-MS y analizar la composición utilizando técnicas bioinformáticas. Aquí, nos centramos en las bacterias gramnegativas y se requerirá una ligera modificación para permitir el análisis de las bacterias grampositivas.
La preparación de muropéptidos se ha mantenido prácticamente igual desde que se produjo por primera vez en la década de 1960 9,11,15....

El peptidoglicano (PG) es una característica definitoria de las bacterias que sirve para mantener la morfología celular, al tiempo que proporciona soporte estructural para proteínas y otros componentes celulares 1,2. La columna vertebral de PG está compuesta por ácido murámico N-acetil ligado a β-1,4 (MurNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc)1,2. Cada MurNAc posee un péptido corto unido al residuo ᴅ-lactilo que puede ser reticulado a péptidos adyacentes ligados a disacáridos (Figura 1A, B). Esta reticulación produce una estructura similar a una malla que abarca toda la célula y a menudo se denomina sáculo (Figura 1C). Durante la síntesis de PG, los precursores se generan en el citoplasma y se transportan a través de la membrana citoplasmática por flippasas. Los precursores son incorporados posteriormente al PG maduro por las enzimas transglicosilasa y transpeptidasa, que producen los enlaces glucosídico y peptídico, respectivamente3. Sin embargo, una vez ensambladas, hay numerosas enzimas producidas por las bacterias que modifican y / o degradan el PG para llevar a cabo una serie de procesos celulares, incluyendo el crecimiento y la división. Además, se ha demostrado que varias modificaciones de la PG confieren adaptaciones específicas a la cepa, las condiciones de crecimiento y el estrés ambiental, que han sido implicadas en la señalización celular, la resistencia a los antimicrobianos y la evasión inmune del huésped4. Como ejemplos, una modificación común es la adición de un grupo acetilo C6 en el MurNAc que confiere resistencia al limitar el acceso a los enlaces glicano β-1,4 a las enzimas lisozima producidas por el huésped que degradan PG 4,5,6. En Enterococos, la sustitución del ᴅ-Ala terminal de la cadena lateral peptídica por ᴅ-Lac confiere una mayor resistencia al antimicrobiano vancomicina 7,8.
El procedimiento general para el aislamiento y purificación de PG se ha mantenido relativamente sin cambios desde que se describió en la década de 19609. Las membranas bacterianas se disuelven a través del tratamiento térmico con SDS, seguido de la eliminación enzimática de proteínas unidas, glicolípidos y ADN restante. El sáculo intacto purificado puede ser posteriormente digerido en los componentes individuales por hidrólisis del enlace β-1,4 entre GlcNAc y MurNAc. Esta digestión produce disacáridos GlcNAc-MurNAc con cualquier modificación estructural y/o enlaces cruzados intactos y se denominan muropéptidos (Figura 1B).
El análisis composicional de PG se realizó inicialmente a través de separación cromatográfica líquida de alta presión (HPLC) para purificar cada muropéptido, seguido de la identificación manual de los muropéptidos10,11. Desde entonces, esto ha sido reemplazado por la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS), que aumenta la sensibilidad de detección y disminuye la carga de trabajo manual de purificar cada muropéptido individual. Sin embargo, la naturaleza lenta y compleja de la identificación manual de muropéptidos ha seguido siendo un factor limitante, reduciendo el número de estudios realizados. En los últimos años, con la aparición de tecnologías "ómicas", la extracción automatizada de características LC-MS se ha convertido en una herramienta poderosa, que permite la detección e identificación rápidas de compuestos individuales en muestras complejas de conjuntos de datos muy grandes. Una vez que se identifican las características, el software bioinformático compara estadísticamente la variación entre muestras utilizando análisis diferencial aislando incluso las diferencias mínimas entre el conjunto de datos complejo y mostrándolas gráficamente al usuario. La aplicación del software de extracción de características para el análisis de la composición de PG apenas ha comenzado a ser explorada 12,13,14 y acoplada al análisis bioinformático 12. A diferencia del análisis proteómico que se beneficia de las bases de datos de proteínas fácilmente disponibles que predicen la fragmentación de péptidos que permiten una identificación totalmente automatizada, actualmente no existe una biblioteca de fragmentación para peptidoglycomics. Sin embargo, la extracción de características se puede acoplar con bases de datos estructurales conocidas y predichas para predecir la identificación de muropéptidos12. Aquí presentamos un protocolo detallado para el uso de la extracción de características basada en LC-MS combinada con una biblioteca de muropéptidos para la identificación automatizada y el análisis diferencial bioinformático de la composición de PG (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 columna de fase inversa - AdvanceBio Columna de péptidos (100 mm x 2,1 mm, 2,7 y micro; m)</td><td>Adquisición de datos LC-MS</td>de <td>Agilent</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de manto calefactor, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>para ebullición al 4% SDS</td></tr><tr><td>Manto calefactor, 1000mL Hemisférico</td><td>Fisher</td><td>CG1000008</td><td>para 4% SDS ebullición</td></tr><tr><td>Incubadora, 37&deg; C</td><td></td><td></td><td>para purificación de sáculos y preparación de muestras MS</td></tr><tr><td>Condensador Leibig, 300MM 24/40,Fisher</td><td></td> <td>CG121805</td><td>para ebullición SDS al 4%</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td>para liofilización de sáculos</td></tr><tr><td>Agitador Magentic</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td><td>para 4% SDS</td></tr> espectrómetro de masas de ebullición <tr><td>Q-Tof modelo UHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>Adquisición de datos LC-MS</td></tr><tr><td>filtros de microcentrífuga, Nanosep MF 0.2 y micro; m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>limpieza de la muestra antes de la inyección de MS</td></tr><tr><td>Soporte de retorta</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>para ebullición al 4% SDS</td></tr><tr><td>Pinza de retorta</td><td>Fisher</td><td>S02629</td> para matraz de fondo redondo <td>con ebullición al 4% SDS</td></tr><tr><td>- 1 litro Pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>para ebullición SDS al 4%</td></tr><tr><td>Sonicador modelo 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>para purificación de sáculos</td></tr><tr><td>Sonicador - micro punta</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>para la purificación de sáculos</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td></td> pasos de <td>lavado de sáculos</td></tr><tr><td>Botellas ultracentrífugas, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>pasos de lavado de sáculos</td></tr><tr><td>Ciudad</td><td></td><td>de suministro de agua</td><td>para condensador</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> refrigerado por agua<tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>Cambridgeeditor molecular de Cambridgesoft</td><td></td><td>para la predicción de fragmentación de muropéptidos</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>viendo listas de muropeptidos anotados, abundancia, patrones isotópicos, etc.</td></tr><tr><td>Adquisición de MassHunter</td><td>Aglient</td><td></td><td>en ejecución del instrumento QTOF</td></tr><tr><td>Perfil de masas de MassHunter Análisis</td><td>diferencial bioinformático</td>profesional <td>Aglient</td><td></td></tr><tr><td>Administrador de bibliotecas y bases de datos de compuestos personales de MassHunter</td><td></td><td></td> Base <td>de datos de Muropéptido m/z MS Base de datos</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>Extracción</td></tr> <tr><td>de características recursivasMassHunter Análisis cualitativo</td> Visualización de <td>Aglient</td><td></td><td>Cromatogramas MS y MS/MS</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Software de gráficos</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Instituto de Bioquímica</td><td></td><td>1D Anotación</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amilasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Mezcla de afinación - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Gas nitrógeno (>99% de pureza)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNasa</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Fosfato (dibásico)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio (monobásico)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Tinciones-todo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

El peptidoglicano es un componente importante de las paredes celulares bacterianas y un objetivo celular común para los antimicrobianos. Aunque los aspectos de la estructura del peptidoglicano están bastante conservados en todas las bacterias, también existe una variación considerable entre los grampositivos / negativos y entre las especies. Además, existen numerosas variaciones, modificaciones o adaptaciones conocidas al peptidoglicano que pueden ocurrir dentro de una especie bacteriana en respuesta a la fase de crecimiento y / o estímulos ambientales. Estas variaciones producen una estructura altamente dinámica que se sabe que participa en muchas funciones celulares, incluido el crecimiento / división, la resistencia a los antibióticos y la evitación de la defensa del huésped. Para comprender la variación dentro del peptidoglicano, la estructura general debe descomponerse en sus partes constitutivas (conocidas como muropéptidos) y evaluarse para determinar la composición celular general. La peptidoglicómica utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El siguiente protocolo describe la purificación de peptidoglicano de cultivos bacterianos, la adquisición de datos de intensidad de muropéptidos a través de un cromatógrafo líquido-espectrómetro de masas y el análisis diferencial de la composición de peptidoglicano utilizando bioinformática.

El aumento de la sensibilidad de detección de la maquinaria de EM junto con el software de reconocimiento de picos de alta potencia ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias de muestras complejas con detalles muy detallados. Utilizando estos avances tecnológicos, estudios recientes sobre la composición de peptidoglicanos han comenzado a utilizar técnicas automatizadas de extracción de características LC-MS 12,13,14,24 sobre la metodología más antigua basada en HPLC<sup class="x...

Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Peptoglycomics utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El uso de algoritmos bioinformáticos permite el análisis, la extracción y la comparación de datos de especificaciones masivas en una colección de archivos de datos simultáneamente, lo que disminuye la carga de trabajo y aumenta la precisión. La comprensión de las diversas variaciones y modificaciones del peptidoglicano tiene implicaciones en la comprensión de los procesos celulares, incluidos el crecimiento y la división, la evasión inmunitaria del huésped y la resistencia a los antimicrobianos.Recomendamos preparar y analizar primero un pequeño subconjunto de muestras para familiarizarse con el protocolo y que actúe como proyecto piloto para evaluar los parámetros experimentales. Dado que el software de análisis de datos de espectrometría de masas a menudo varía en las definiciones que se utilizan al describir características y funciones, la demostración visual ayudará a los usuarios a aplicar este protocolo en todas las plataformas. Para la extracción de sáculos de peptidoglicano, vuelva a suspender los gránulos de células congeladas a aproximadamente uno a 10 del volumen de cultivo original en fosfato de sodio de 20 milimolares a cuatro grados Celsius antes de agregar la suspensión celular gota a gota a ebullición de 8% SDS en fosfato de sodio de 20 milimolares hasta un volumen final de uno a uno.Mantenga un hervor suave durante 30 minutos a tres horas con agitación para asegurar la disociación completa de la membrana. La mezcla resultante debe ser completamente transparente, sin grumos celulares ni viscosidad restantes. Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, recoja los sáculos por ultracentrifugación, seguido de cinco a siete lavados en aproximadamente 50 mililitros de fosfato de sodio de 20 milimolares a temperatura ambiente por lavado hasta que el tampón de lavado tenga una concentración de SDS de aproximadamente 0.001% según lo determinado por tinte colorimétrico.Después del último lavado, vuelva a suspender los sáculos en 5 a 10 mililitros de fosfato sódico de 20 milimolares a temperatura ambiente y complemente la muestra con 50 microgramos por mililitro de amilasa, DNasa y ARNasa en sulfato de magnesio de 10 milimolares para una incubación de una hora con agitación o nutación a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, digiere la reacción durante la noche con 100 microgramos por mililitro de pronasa a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, después de la ultracentrifugación, hervir la muestra durante una hora en 25 mililitros de 2% de SDS y 20 milimolares de fosfato de sodio en una vaporera.Al final de la incubación, lave la muestra de cinco a siete veces con 50 mililitros de agua destilada doble a temperatura ambiente, como se demuestra. Cuando la concentración de SDS alcance aproximadamente el 0,001%, vuelva a suspender el pellet en una cantidad suficiente de agua bidestilada para obtener una suspensión de sáculos y lave el recipiente. Después del almacenamiento durante la noche a menos 80 grados centígrados, liofilice la muestra congelada antes de diluir los sáculos a 10 miligramos de peptidoglicano por mililitro de concentración de agua destilada doble.Para el análisis de LC-MS, inicie un nuevo proyecto en el software del instrumento y asigne los archivos de datos LC-MS QTOF apropiados a la condición experimental de interés. Ejecute la extracción de características recursivas por lotes del asistente de procesamiento de datos y configure los filtros de procesamiento de datos para que coincidan con los parámetros de las condiciones y la instrumentación de LC-MS para identificar, agrupar y verificar con precisión los picos de masa a carga que representan mutopéptidos individuales. Revise los resultados al final de la extracción de características.Si un número significativo de entidades no se pudo alinear en un grupo, ajuste los parámetros de filtrado recursivo para ampliar o restringir la ventana de detección según sea necesario. A continuación, exporte los datos como un archivo de intercambio compuesto. Para el análisis de características espectrales diferenciales, inicie un nuevo proyecto en el software del sistema y siga las instrucciones para la importación de datos.Durante el análisis de datos, seleccione la significación y el cambio de pliegue para el análisis diferencial y establezca los datos de referencia en la intensidad mediana en todos los archivos de datos. Una vez completado el análisis, examine los análisis gráficos y estadísticos resultantes para identificar los muropéptidos que demuestren un cambio significativo en la abundancia entre las condiciones experimentales probadas. En el navegador de proyectos, haga clic con el botón derecho del ratón en los distintos análisis y seleccione una opción de exportación para guardar los detalles de la entidad como un archivo tsv.Asegúrese de guardar varios análisis para obtener todos los datos relevantes. Dentro del software de análisis diferencial, en la interpretación de resultados, seleccione Explorador de ID, agregue una biblioteca de estructuras de muropéptidos esperadas y seleccione parámetros similares como se muestra para la extracción de características para producir una anotación de coropóptido predicho para cada característica identificada. Para confirmar manualmente la anotación de muropeptido predicha, compare los picos de la relación masa-carga del cromatograma de espectrometría de masas en tándem con la relación masa-carga predicha de todas las posibles fragmentaciones de una estructura de mutopéptido conocida.Utilice un editor molecular para dibujar la estructura de muropeptido predicha utilizando la herramienta de fragmentación de masa para mostrar la relación masa-carga de los fragmentos de espectrometría de masas cuando cada enlace se rompe individualmente o en combinación, y luego compare todas las posibles fragmentaciones de la estructura de mutopéptido con el cromatograma de espectrometría de masas en tándem. Para confirmar la anotación de la muropeptida, los picos de la relación masa-carga de múltiples fragmentos deben encontrarse en el cromatograma de espectrometría de masas en tándem con una ventana de alineación de la relación masa-carga mínima. Para evaluar los cambios globales en las modificaciones de los muropeptidos, edite el archivo tsv de los muropeptidos de cambio de pliegue alto estadísticamente significativos para incluir una sola columna para cada modificación de muropeptidos.Rellene esta columna con una designación para cada muropeptido anotado y cargue el archivo tsv modificado en Perseus. En Anotar filas, haga clic en Anotar filas categóricamente y agregue archivos de datos a cada parámetro experimental. Luego, en la prueba, haga clic en dos pruebas de muestra para realizar la prueba T de un estudiante y haga clic en 1D para realizar la anotación 1D.Una mayor sensibilidad de detección de la maquinaria de espectrometría de masas, junto con un software de reconocimiento de picos de alta potencia, ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias complejas con detalles muy minuciosos. La asociación de cada pico de masa a carga extraído de los datos de espectrometría de masas con un muropeptido particular se facilita mediante referencias cruzadas con una base de datos de estructuras de muropéptidos conocidas y predichas. El cromatograma de espectrometría de masas en tándem de fragmentación para cada característica extraída se puede comparar con el perfil de fragmentación del muropéptido propuesto utilizando la base de datos.Los diagramas de volcanes se pueden utilizar para resaltar los muropéptidos que demuestran un cambio de abundancia de alta magnitud estadísticamente significativo entre las condiciones probadas. Cuando se examinan juntos, se pueden examinar múltiples muropeptidos que poseen la misma modificación para determinar una tendencia hacia una condición experimental y se puede evaluar la importancia de todo el grupo. El seguimiento de una modificación de un muropéptido de esta manera puede identificar una actividad enzimática particular que se ve afectada por el parámetro experimental.Además, los valores atípicos de esta tendencia pueden revelar actividades enzimáticas con una especificidad o función biológica particular. Este procedimiento examina los cambios bioquímicos y las variaciones biológicas en los polímeros, proporcionando así información sobre la actividad enzimática que actúa sobre el PG in vivo. Examinar la composición de PG en detalle ayudará en la comprensión de estructuras celulares complejas que tienen implicaciones para muchos procesos fisiológicos críticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.

Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

El ubicuo segundo mensajero c-di-GMP controla el crecimiento y el comportamiento de muchas bacterias. Hemos desarrollado una novedosa tecnología basada en espectrometría de masas de compuestos de captura para identificar y caracterizar bioquímicamente las proteínas de unión a c-di-GMP en prácticamente cualquier especie bacteriana.

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

subtipificación de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

La búsqueda abierta permite la identificación de glicopéptidos decorados con composiciones de glicanos previamente desconocidas. Dentro de este artículo, se presenta un enfoque simplificado para realizar búsquedas abiertas y posteriores búsquedas de glicopéptidos centrados en glicotecos para muestras bacterianas utilizando Acinetobacter baumannii como modelo.

La aplicación de enfoques abiertos basados en la búsqueda para la identificación de glicopéptidos ligados a O de Acinetobacter baumannii

Aprende análisis semicuantitativo de peptidoglicano mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática. Este método computacional permite examinar la composición del peptidoglicano con alta precisión y eficiencia.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

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