Disección asistida por transilluminación de etapas específicas del ciclo epitelial seminiferoso del ratón para análisis de inmunodetención aguas abajo

Este método facilita la identificación y disección de segmentos tubáricos seminíferos específicos de la etapa, lo que permite el estudio de etapas muy específicas de la espermatogénesis. Las etapas del ciclo epitelial seminífero se pueden reconocer en túbulos frescos no fijos y, por lo tanto, podemos seleccionar solo las etapas de interés para los análisis posteriores. Se requiere algo de práctica para aprender a reconocer las etapas sobre la base de sus patrones de transiluminación, pero este protocolo debería garantizar su éxito.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Opeyemi Olotu, que es candidato a doctorado en mi laboratorio. Comience colocando un ratón macho adulto de al menos 8 semanas de edad en posición supina y desinfectando el abdomen ventral con etanol al 70%. Use tijeras estériles para hacer una incisión en forma de V en la región pélvica abdominal y use pinzas estériles para tirar de la almohadilla de grasa del epidídimo para ubicar los testículos.

Use tijeras para diseccionar los testículos, colocando los tejidos en una placa de Petri estéril de 100 milímetros con PBS a medida que se recolectan. Use tijeras de punta fina para cortar una hendidura en la túnica albugínea, la lámina fibrosa gruesa que encapsula los testículos, y use fórceps para abrir la túnica y forzar los túbulos hacia afuera. Coloque los túbulos seminíferos descapsulados en una nueva placa de Petri y agregue suficiente PBS estéril para cubrir el fondo de la placa.

Luego, use las pinzas para separar suavemente los túbulos sin dañar los tejidos. Para la disección de los túbulos, pegue la placa en una platina de microscopio de disección y encienda la transiluminación. Utilice pinzas finas para mover con cuidado los haces de túbulos para familiarizarse con los patrones de absorción de luz y dispersión de las diferentes etapas.

Luego, use pinzas con una punta ganchuda para levantar un túbulo de interés y use tijeras de microdisección para cortar un segmento de una longitud adecuada. Después de cortar los segmentos de túbulos específicos de la etapa, utilice una pipeta para recoger un segmento de interés en un volumen de 10 microlitros de PBS y coloque el segmento en un portaobjetos de microscopio. Presione con cuidado un cubreobjetos de 20 por 20 milímetros sobre el túbulo sin aplastar demasiado las células y coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio de contraste de fase.

Coloque un papel de filtro en el borde del cubreobjetos para facilitar la propagación de las células en una monocapa y utilice el objetivo de 40 veces para verificar las etapas de las células. Una vez que las células hayan formado una monocapa redonda a partir de ambos extremos del túbulo, sumerja el portaobjetos en un recipiente con nitrógeno líquido durante 10 segundos. Use un bisturí para voltear el cubreobjetos de las celdas e inmediatamente coloque el portaobjetos en etanol al 90% durante 2 a 5 minutos.

Luego, séquelo al aire y guárdelo a temperatura ambiente hasta por varios días. Para la inmunotinción de montaje completo de los túbulos seminíferos, utilice una pipeta para transferir segmentos de interés a un tubo cónico de 15 mililitros de PBS helado en hielo. Después de permitir que los segmentos se sedimenten, retire con cuidado el PBS.

Agregue 10 mililitros de PBS fresco y helado y mezcle por inversión. Deje que los túbulos se asienten durante unos minutos antes de volver a eliminar el sobrenadante como se ha demostrado. Cuando se haya eliminado todo el sobrenadante, fije los túbulos en 5 mililitros de paraformaldehído durante cinco horas a 20 a 30 revoluciones por minuto a 4 grados centígrados.

Al final de la incubación, deje que los túbulos se asienten durante unos minutos antes de lavar la muestra tres veces en PBS fresco a 4 grados centígrados durante 10 minutos por lavado con rotación. Después del último lavado, use una pipeta de 1 mililitro para transferir de 10 a 20 segmentos de túbulos fijos a un tubo de fondo redondo de 2 mililitros. Cuando los segmentos se hayan asentado, reemplace el sobrenadante con 1 mililitro de 2% BSA y 10% FBS en PBSX para una incubación de una hora a temperatura ambiente y de 20 a 30 revoluciones por minuto.

Al final de la incubación de bloqueo, lavar las muestras con 1 mililitro de PBSX. Antes de marcar los túbulos con 250 microlitros de anticuerpo primario, diluirlo en 1%BSA en PBSX durante dos horas a temperatura ambiente a 20 a 30 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, lavar los túbulos tres veces en PBSX como se demostró antes de etiquetar las muestras con 250 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados durante una hora, protegidos de la luz a temperatura ambiente y de 20 a 30 revoluciones por minuto.

Al final de la incubación, lavar los túbulos tres veces antes de decantarlos en un portaobjetos de microscopio en un pequeño volumen de sobrenadante. Luego, use puntas de carga de gel para organizar los túbulos en tiras lineales y drenar el exceso de tampón. Luego, agregue de 1 a 2 gotas de medio de montaje antes de montar la guía con un cubreobjetos.

Bajo la transiluminación, las etapas 7 a 8 parecen homogéneamente oscuras porque contienen un alto número de espermátidas alargadas completamente condensadas que están alineadas en la superficie apical del epitelio. Después de que los espermatozoides maduros se liberan en la luz durante la espermiación, el túbulo parece muy pálido en las etapas 9 y 10 debido a la ausencia de espermátidas elongadas condensadas dentro del epitelio. A esta zona pálida le sigue la zona de puntos débiles, cuya apariencia irregular se origina en la organización de espermátidas alargadas con cromatina condensada en paquetes.

Estos haces se vuelven muy prominentes en la siguiente zona de puntos fuertes. Los haces de espermatidas migran hacia los núcleos de las células de Sertoli que se encuentran cerca de la lámina basal, que se refleja como una apariencia rayada de los túbulos de la etapa 2 a 5 cuando se transilumina. Los haces finalmente se dispersan en la etapa 6, y las espermátidas alargadas en condensación se acercan al lumen para ser liberadas del epitelio en la etapa 8.

La etapa exacta del segmento del túbulo se puede verificar con precisión mediante microscopía de contraste de fase de las preparaciones de calabaza. La inmunotinción de preparaciones de calabaza por etapas se puede utilizar para estudiar la expresión y localización de proteínas de interés en el epitelio seminífero. La tinción de túbulos seminíferos de montaje completo se utiliza normalmente para estudiar los tipos de células que están en contacto con la membrana basal del epitelio seminífero, ya sea en el lado tubular o intersticial.

El método también se puede utilizar para estudiar células o estructuras que se encuentran más profundas dentro del epitelio, como la barrera de la sangre y los testículos o las células germinales postmeióticas. Además de la inmunotinción, podemos utilizar segmentos tubáricos en etapa para muchos otros análisis posteriores, incluidos ensayos bioquímicos de ARN y proteínas, citometría de flujo y cultivo tubárico ex vivo. Debido a que este método permite un análisis muy detallado de la espermatogénesis, realmente proporciona una herramienta útil para estudiar todos los procesos importantes necesarios para la producción de esperma y la fertilidad masculina.