Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda
21 de febrero de 2021
Presentamos dos diversos protocolos de coloración para la detección del ligand de NKG2D (NKG2DL) en muestras agudas primarias humanas de la leucemia mieloide (AML). El primer enfoque se basa en una proteína de fusión, capaz de reconocer todos los ligandos conocidos y potencialmente desconocidos, mientras que el segundo protocolo se basa en la adición de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.
Este protocolo muestra dos formas distintas de detectar NKG2DLs en la superficie de las células AML. La técnica proporciona un método de tinción rápido y fácil de usar para detectar todos los NKG2DLs conocidos y posiblemente desconocidos. Este método permite la separación de las células madre leucémicas de las células AML a granel, lo que permite caracterizar aún más estas células.
Comience por descongelar la biotina y los tubos de proteína de fusión NKG2D a temperatura ambiente. Gire rápidamente el polvo NKG2D FC, luego agregue 500 microlitros de PBS para reconstituir el polvo y mezclarlo a fondo usando una micropipeta P-1000. Agregue 100 microlitros de la proteína de fusión NKG2DL a un tubo de biotina para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro, y mezcle la solución a fondo con una micropipeta P-100.
Para descongelar las células de AML, retire el cryovial que contiene AML primario del almacenamiento de nitrógeno líquido, y colócalo inmediatamente en un baño de agua de 37 grados Celsius. Mueva suavemente el tubo hacia adelante y hacia atrás en el agua, permitiendo que el contenido del vial se descongele hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo. Transfiera inmediatamente las células descongeladas al tubo que contiene el medio y enjuague el vial con un mililitro de medio.
Centrifugar las células a 300 veces G durante 10 minutos y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet. Lave las células con cinco mililitros de medio RPMI que contenga 10% de FCS y repita la centrifugación. Resuspend la pelotilla de la célula con el almacenador intermediario de la coloración a una concentración final de 0,5 por 10 a las séptimas células por mililitro.
Luego transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a una placa de fondo en U de cultivo celular de 96 pozos y centrifugse la placa a 300 veces G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Prepare una mezcla maestra de proteína de fusión NKG2D biotinilada para que las células se resuspended en un volumen final de 50 microlitros por pozo con una concentración final de NKG2D de 10 microgramos por mililitro por pozo.
Añadir la mezcla maestra preparada y resuspend los pellets celulares con una pipeta de 200 microlitros. Incubar y centrifugar la placa como se describe en el manuscrito del texto. Prepare una mezcla maestra usando streptavidin PE para que las células se resuspended en un volumen final de 50 microlitros.
Añadir la mezcla maestra a las células y resuspend los pellets con una pipeta multicanal de 300 microlitros. Después de centrifumar la placa y desechar el sobrenadante, utilice una micropipeta multicanal de 300 microlitros para resuspend los pellets celulares en 200 microlitros de tampón de tinción más 7-AAD. A continuación, analice las células utilizando un dispositivo de citometría de flujo.
Las muestras de LMA analizadas son positivas para CD34 y NKG2DL, pero también existen subpoblaciones negativas, con cuatro poblaciones diferentes en total. La estrategia típica de gating comienza con la selección de la población principal de células a través de su FSC y SSC. Los dobletes y las células muertas se excluyen en el análisis aguas abajo.
Las puertas se ajustan utilizando controles FMO para garantizar la identificación adecuada de las células positivas. Las intensidades de fluorescencia de las células positivas para CD34 versus NKG2DL se destacan aquí. Las células AML que son positivas para CD34 muestran una expresión superficial más baja de NKG2DL, lo que indica que la expresión de NKG2DL se asocia con la falta de stemness.
Tres muestras primarias de AML demostraron 19,8, 49,8, y 89,4% eventos positivos para la coloración de la proteína de fusión contra 20,4, 50,4, y 90,6% para la coloración agrupada del anticuerpo anti-NKG2DL. Por otro lado, la tinción de un solo ligando mostró un rango de eventos positivos de hasta el 92% con porcentajes que variaron en función del ligando. Al intentar este método, es muy importante ser rápido al descongelar las células primarias de AML, porque son frágiles y pueden morir fácilmente durante este paso.
Después de realizar este protocolo, se puede realizar una clasificación de células basada en la señal NKG2DL para investigar más a fondo las poblaciones.
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Resumen
Este protocolo presenta dos métodos de tinción distintos para detectar ligandos de NKG2D (NKG2DLs) en muestras primarias humanas de leucemia mieloide aguda (AML). Las técnicas permiten la separación de células madre leucémicas de las células AML en masa para su posterior caracterización.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Oncología
Antecedentes
- Los ligandos de NKG2D son importantes para el reconocimiento inmunitario en el cáncer.
- La leucemia mieloide aguda (AML) presenta desafíos en la caracterización celular.
- Los métodos actuales pueden no distinguir eficazmente las células madre leucémicas.
- Los nuevos protocolos de tinción pueden mejorar las capacidades de detección.
Objetivo del estudio
- Desarrollar protocolos de tinción eficientes para la detección de NKG2DL.
- Facilitar la separación de células madre leucémicas de las células AML masivas.
- Mejorar la caracterización de muestras de AML.
Métodos Utilizados
- Utilización de una proteína de fusión para reconocer los NKG2DL.
- Aplicación de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.
- Descongelación y reconstitución de biotina y proteína de fusión NKG2D.
- Mezcla de soluciones para obtener las concentraciones deseadas para la tinción.
Resultados principales
- Ambos protocolos detectan eficazmente NKG2DLs conocidos y desconocidos.
- Se logra la separación de células madre leucémicas de las células AML masivas.
- Los métodos son fáciles de usar y rápidos.
- Es posible una caracterización mejorada de las células AML.
Conclusiones
- Nuevos protocolos de tinción mejoran la detección de NKG2DLs.
- Estos métodos pueden ayudar a comprender la biología de la LMA.
- Investigaciones futuras pueden basarse en estas técnicas para obtener conocimientos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación de células madre leucémicas frente a poblaciones masivas de LMA sigue siendo un desafío crítico en la validación de dianas y el desarrollo de modelos preclínicos. La capacidad de aislar subpoblaciones negativas para NKG2DL con propiedades de células madre permite reducir mecanismos de riesgo en hipótesis terapéuticas y respalda la confianza predictiva en flujos de trabajo de descubrimiento temprano. Este enfoque informa directamente la selección de carteras al identificar sistemas relevantes para la enfermedad con mayor potencial tumorigénico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de células madre leucémicas según la expresión superficial de NKG2DL.
- Valor operativo: Proporciona un método rápido y fácil de usar para distinguir subpoblaciones con características de células madre de las células de LMA diferenciadas.
- Valor científico: Apoya la desestimación biológica mediante la validación funcional de las propiedades de células madre en fracciones negativas para NKG2DL.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de citometría de flujo para comparar la expresión de NKG2DL entre enfoques de tinción específicos para cada ligando y tinción pan-ligando.
- Valor operativo: Proporciona protocolos de tinción estandarizados y reproducibles, compatibles con la preparación para cribado de alto rendimiento.
- Valor científico: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para estudios posteriores de cribado de compuestos y análisis de interacción con el blanco.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la alineación traslacional de biomarcadores al vincular la supresión de NKG2DL con mecanismos de evasión inmune en las células iniciadoras de leucemia (LSC).
- Valor operativo: Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el aislamiento de células iniciadoras de la enfermedad.
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos mediante el uso del estado de NKG2DL para estratificar subpoblaciones de LMA con potencial tumorigénico diferencial.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales y la evaluación preclínica, al permitir el aislamiento de subpoblaciones definidas mecanísticamente.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al separar las CSEs negativas para NKG2DL de las células de LMA positivas para NKG2DL.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la detección cuantitativa y estandarizada de superficie, compatible con plataformas de cribado basadas en citometría de flujo.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (porcentaje de eventos positivos, intensidad de fluorescencia) que permiten comparar métodos de tinción y frecuencias de subpoblaciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir el aislamiento de CSEs para su validación funcional en modelos relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el enriquecimiento de células madre aplicable a múltiples muestras de LMA y adaptable a otros tipos de cáncer con mecanismos similares de evasión inmunitaria.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el enriquecimiento de células madre, reducción de la ambigüedad mecanicista en la identificación de células madre leucémicas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la detección de NKG2DL en múltiples muestras de LMA.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción en la validación de dianas, eficiencia del capital mediante la reducción temprana de riesgos, disminución del riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de dianas basada en el potencial de enriquecimiento de células madre leucémicas y en el fenotipo de evasión inmune.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo, tinción celular y manejo de muestras primarias de LMA.
- Depende del acceso a citómetros de flujo, equipos de centrifugación y reactivos como biotina, proteína de fusión NKG2D, estreptavidina PE y 7-AAD.
- Necesita la estandarización entre equipos de las estrategias de selección de poblaciones (gating), controles FMO y ajustes de compensación para obtener resultados consistentes.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicarse en diferentes sistemas modelo debido a la variabilidad en los patrones de expresión de los ligandos de NKG2D.
- Las limitaciones prácticas incluyen la fragilidad de las células primarias de LMA durante el descongelamiento, lo que exige un procesamiento rápido para mantener su viabilidad.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
