Name: Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a cuantificar metástasis pulmonar en modelos preclínicos de cáncer de mama 4T1 mediante análisis de imágenes con Fiji-ImageJ. Este método mejora la precisión y reduce errores humanos en el conteo.

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Este trabajo fue apoyado por el Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), el Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA), y National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La realización de este protocolo requiere el permiso de las instituciones apropiadas y el cumplimiento de todas las directrices apropiadas.
1. Cultivo celular
<ol><li>Hacer medios de cultivo completos (RPMI + 10% Suero Bovino Fetal +1% Pluma Strep). Reavice 4T1 células de acuerdo con el ProtocoloATCC 10 e incubar a 37oC y 5% co2 en un matraz T-25 hasta que se confluencia. Cambie los medios el día después de revivir para eliminar las células muertas, y de nuevo si los medios se gastan antes de que las células sean lo suficientemente confluentes como para pasarlas.</li>
	<li>Una vez que el matraz T-25 es confluente, pasaje de células a un matraz T-75 desechando los medios, lavando el matraz con 5 ml de 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), y añadiendo 500 l de Trypsin-EDTA. Incubar durante 5-10 minutos a 37 oC hasta que las células se desprenden.<ol>
<li>Una vez separado, agregue 5 mL de medios de cultivo completos calentados a las células. Aspirar y transferir los 5 ml a un matraz T-75 que contenga 15 ml de medios de cultivo completos calentados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de paso en matraces T-75 al menos cuatro veces. Haga esto una vez que el matraz sea confluente lavando con 8 ml de 1x DPBS, añadiendo 1 ml de trypsin-EDTA para separar las células, añadiendo 10 ml de medios calentados a las células y diluyendo 1:6-1:8 en un nuevo matraz T-75 que contiene 20 ml de medios de cultivo caliente completos.</li>
	<li>Células de paso hasta el número adecuado de matraces T-150 que contienen 40 ml de medios de cultivo completos calentados para el número de ratones que se van a inyectar. La mayoría de los estudios requerirán varios matraces T-150 para asegurar suficientes células para la inyección.</li>
	<li>Cuando los ratones estén listos para ser inyectados (8 semanas de edad o pesando más de 20 g, dependiendo de los protocolos institucionales o IACUC), cosecha las células desechar los medios, lavando cada matraz con 10 ml de 1x DPBS y añadiendo 2 ml de trippsina-EDTA. Incubar durante 5-10 minutos a 37 oC hasta que las células se desprenden.</li>
	<li>Lavado del matraz con 10 ml de soporte completo y transferir todo el contenido (10 ml de medios + 2 ml de mezcla celular de trippsina-EDTA) al siguiente matraz. Continúe lavando y recogiendo células de cada matraz utilizando los mismos 10 ml de medios para evitar el uso de una cantidad excesiva de medios.<ol>
<li>Una vez recogidos todos los matraces, transfiera el contenido a un tubo centrífugo de 50 ml. Recoger una muestra de 10 ml para el recuento en un tubo de microcentrífuga y centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 125 x g durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mientras que las células están siendo centrifugadas, agregue 10 l de azul de Trypan a 10 l de muestra de celda. Cuenta las células usando un hemocitoómetro. Una vez que se determina el número total de células, calcule la concentración de células necesarias para inyectar ratones durante 1,2 x 106 células por ratón (por 100 l).</li>
	<li>Después de la centrifugación, los medios decantación y el pellet de células resuspendidas en la cantidad correcta de DPBS estéril 1x para 1,2 x 106 células por cada 100 l. Divida la mezcla de células/DPBS en tubos de microcentrífuga para facilitar el acceso con la jeringa al aspirar células para inyección. Mantenga las células en hielo e inyecte poco después, ya que las células comenzarán a morir después de estar en hielo durante largos períodos de tiempo.</li>
</ol>2. Inyecciones
<ol><li>Prepare las células para la inyección tocando o mezclando suavemente el tubo de microcentrífuga para resuspender las células, y luego aspirar 600 l en una jeringa de 1 ml. Gire la jeringa hacia arriba y tire del émbolo hacia abajo para alejar las células de la abertura de la jeringa. Toque la jeringa para deshacerse de las burbujas de aire.</li>
	<li>Vuelva a colocar la aguja en el bisel y dispensar las células en el tubo de microcentrífuga hasta que sólo queden 500 l en la jeringa. Ponga la jeringa sobre hielo. NOTA: Las células 4T1 se caen de la suspensión rápidamente. Por lo tanto, es importante mezclar las células de nuevo en la suspensión tocando con frecuencia.</li>
	<li>Anestfetizar 8 semanas de edad/>20 g ratón BALB/c hembra usando isoflurano u otro agente anestésico aprobado. Monitoree la respiración del ratón para evaluar la profundidad de la anestesia.</li>
	<li>Una vez que el ratón esté correctamente anestesiado como se indica por falta de reflejo corneal, coloque el ratón sobre su espalda. Con el pulgar, el puntero y el dedo medio, mantenga suavemente presionado el ratón. Utilice el puntero y los dedos medios para mantener presionada la parte superior del cuerpo y el pulgar del ratón para su pierna trasera izquierda. Sé gentil pero firme.</li>
	<li>Con el bisel de la aguja hacia arriba, inyecte 100 ml de células por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria abdominal izquierda del ratón. Monitor para un buen bleb y cualquier fuga, y asegúrese de que el ratón se despierta y se mueve fácilmente después de la inyección.<ol>
<li>Cambie las agujas entre cada ratón. NOTA: No permita que la aguja entre en la cavidad peritoneal. Esto haría que el cáncer se propagara rápidamente y no fuera representativo del modelo. Para garantizar una inyección subcutánea, tire suavemente hacia arriba de la aguja cuando se inserte en la almohadilla de grasa mamaria abdominal izquierda. Si la aguja se levanta fácilmente hacia arriba, se coloca correctamente por vía subcutánea.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Monitoreo
<ol><li>Monitoree a los ratones al menos 3 veces a la semana para detectar peso, puntuación de condición corporal, tamaño del tumor, condición del tumor, respiración, nivel de actividad, apariencia y movimiento. Una vez que el tumor alcanza 0,7-0,8 cm de diámetro, comience a monitorear diariamente.<ol>
<li>Considere la eutanasia cuando el tamaño del tumor alcance 1,5 cm, o la pérdida de peso alcance el 20%, o la disminución clínica grave en la puntuación de la condición corporal, la condición del tumor, la respiración, el nivel de actividad, la apariencia o el movimiento se observen en base a las pautas institucionales. NOTA: Puntuación de condición corporal es crucial para monitorear ya que el peso corporal puede aumentar a medida que el tumor aumenta de tamaño, negando la pérdida de condición corporal debido a la carga de enfermedad. Los protocolos de monitoreo exactos dependerán de los protocolos institucionales o de la UICC aprobados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Necropsía
<ol><li>Eutanasia el ratón utilizando CO2 siguiendo las pautas institucionales.</li>
	<li>Rocíe el ratón con 70% de etanol para desinfectar. Haga una incisión en la línea media ventral del ratón para exponer la cavidad corporal.</li>
	<li>Retire el riñón. Continúe cortando la línea media hasta que el diafragma sea visible. Usa tijeras para perforar el diafragma y desinflar los pulmones. Recorte el diafragma para obtener un mejor acceso a la cavidad.</li>
	<li>Utilice tijeras contundentes para cortar el centro de la caja torácica. La caja torácica de los pines vuelve a exponer el pulmón y el corazón.</li>
	<li>Perfuie el corazón con 2 ml de 1x DPBS no estéril insertando una aguja en el ápice del corazón hasta que se afique en la cavidad abdominal donde se extirpó el riñón.</li>
	<li>Para extirpar el corazón y los pulmones, usa tijeras contundentes para cortar el esófago y la tráquea directamente por encima del corazón. Usando fórceps, comienza a alejar el corazón del cuerpo y corta cualquier tejido conectivo manteniéndolo unido. Los pulmones saldrán con el corazón.</li>
	<li>Identifique los pulmones multilobulados (derecha) y monolobulados (izquierda). Mantenga el corazón unido como referencia, pero una vez que se identifiquen los pulmones, corte el corazón.</li>
	<li>Etiquetar una placa de 12 pozos que contenga 1x Solución Salina Equilibrada (HBSS) de Hank en cada pozo. Cada ratón necesita 2 pozos. Coloque el pulmón multilobulado (derecha) en la placa de 12 pozos para la evaluación de la metástasis y manténgalo en hielo. Mantenga el pozo vecino vacío por ahora. NOTA: Es importante utilizar el mismo pulmón (multilobulado) de cada ratón para asegurarse de que cada muestra está cerca de su tamaño. El pulmón de un solo lóbulo se puede utilizar para otros análisis, como la histopatología. NOTA: Las muestras son estables sobre hielo o a 4oC durante unas horas.</li>
</ol>5. Procesamiento de tejidos
NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse utilizando una técnica estéril.
<ol><li>Etiquetar 1 tubo cónico de 15 ml por ratón y añadir 2,5 ml de mezcla de colagenasa tipo IV y 30 unidades de elastasa a cada tubo. Para hacer mezcla de colágeno tipo IV, disolver 2 mg de colagenasa tipo IV por ml 1x HBSS y filtro estéril. Esto se puede almacenar hasta 12 meses a -20 oC y descongelarse cuando sea necesario.</li>
	<li>Transfiera el pulmón al segundo, limpie bien 1x HBSS para esa muestra. Gire usando fórceps para extraer la sangre restante. Transfiera el pulmón limpio a una placa de cultivo de tejido vacía de 3,5 cm. Pulmón picado con tijeras. Enjuagar la placa con 2,5 ml de 1x HBSS, transferir 1x HBSS y piezas pulmonares en un tubo cónico de 15 ml que ya contiene colagenasa/cóctel de elastasa (5 ml en total).</li>
	<li>Incubar durante 75 minutos a 4oC. Continúe mezclando muestras durante este tiempo, así que coloque tubos en una mecedora o rueda giratoria. Durante este paso de incubación, etiquete tubos centrífugos de 50 ml y placas de cultivo de tejido de 10 cm para cada ratón. Si se realiza una dilución, etiquete suficientes placas de cultivo de tejido de 10 cm para las diluciones. NOTA: Etiquete la tapa de las placas de cultivo de tejido. Si se etiqueta la placa en sí, la escritura interferirá con el análisis Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Lleve el volumen de cada tubo hasta 10 ml de total con 1x HBSS. Vierta el contenido sobre un colador celular de 70 m en un tubo cónico de 50 ml para cada muestra. Utilice el émbolo de una jeringa de 1 ml para moler suavemente la muestra a través del colador para permitir que más células se filtren.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 minutos a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 ml de 1x HBSS. Repita este paso dos veces.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 10 mL de 60 m 6TG medios de cultivo completos, ya sea RPMI o IMDM. Muestras de placas en placas de cultivo celular de 10 cm, utilizando un esquema de dilución si se desea. Incubar a 37oC, 5%co-2 durante 5 días. NOTA: 1:2, 1:10 y 1:100 son diluciones comunes que deberán determinarse empíricamente en función de los parámetros del estudio. ADVERTENCIA: 6TG es tóxico. Tenga cuidado al manipular y siga todas las pautas de salud y seguridad ambiental para su eliminación.</li>
</ol>6. Placas de tinción
<ol><li>Vierta los medios de cultivo de las placas en el contenedor de residuos adecuado. Fijar las células añadiendo 5 ml de metanol sin diluir por placa e incubar durante 5 minutos en RT, asegurándose de remolino de metanol para que cubra toda la placa. ADVERTENCIA: El metanol es peligroso si se ingiere, inhala o está en la piel. Utilice una campana de humo para este paso.</li>
	<li>Vierta el metanol de las placas en el contenedor de residuos apropiado. Enjuague las placas con 5 ml de agua destilada por placa y vierta agua en el contenedor de residuos adecuado. Añadir 5 ml de 0,03% azul de metileno por placa e incubar durante 5 minutos en RT, asegurándose de remolino de solución azul de metileno para que cubra toda la placa.</li>
	<li>Vierta el azul de metileno en el recipiente de desecho adecuado. Enjuague las placas de nuevo con 5 ml de agua destilada por plato. Gire las placas al revés y borre contra una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa en su tapa y deje secar al aire durante la noche en RT. NOTA: Las colonias metastásicas serán azules. Una vez que las placas se secan, se pueden almacenar en RT indefinidamente.</li>
</ol>7. Análisis de imagen
<ol><li>Retire las tapas etiquetadas de las placas, teniendo cuidado de garantizar una identificación clara de las muestras. Alinee todas las placas pulmonares manchadas en una superficie limpia y ligera para tomar una foto de todas las placas en una sola imagen.</li>
	<li>Tome una foto de la colección de placas en un área bien iluminada, asegurándose de minimizar los reflejos ya que las placas son muy reflectantes. Las reflexiones en las placas influirán en el análisis de la imagen y, por lo tanto, deben evitarse. NOTA: Fiji-ImageJ tiene un límite superior de 2 gigapíxeles. La mayoría de los teléfonos inteligentes modernos tendrán suficientes cámaras. No utilice una cámara de menos de 8 megapíxeles. La cámara utilizada en este experimento era de 12,2 megapíxeles en un Google Pixel 2.</li>
	<li>Recorte la imagen para incluir las placas, pero excluya las tapas o cualquier otra cosa en el fondo de la imagen. Cargue la imagen recortada en Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Cambie la imagen a blanco y negro mediante los siguientes comandos: Imagen, Ajustar, Umbral de color, Método de umbral: Predeterminado, Color de umbral: Blanco y negro, Espacio de umbral: Laboratorio. La imagen ahora debe ser en blanco y negro. El negro representa el fondo claro, y el blanco representa las colonias metastásicas azules.</li>
	<li>Con la herramienta Círculo de la barra de herramientas Fiji-ImageJ, seleccione el área que desea analizar. Dibuje un círculo para utilizar para todas las placas para asegurarse de que cada placa se analiza para el mismo área del mismo tamaño. Elija un tamaño que maximice el área analizada en las placas mientras minimiza el ruido de fondo que aparece en el borde de las placas. El tamaño aparece en la barra de herramientas a medida que se dibuja, por lo que es posible hacer un círculo perfecto mediante la supervisión de la altura y la anchura a medida que se dibuja el círculo.</li>
	<li>Analice el círculo seleccionado para determinar qué porcentaje del área es blanca, que representa el área de la placa que tiene colonias metastásicas azules. Utilice los siguientes comandos: Analizar, Analizar partículas, Tamaño (píxel2):0-Infinito, Circularidad: 0.00-1.00, Mostrar: Nada y marque la casilla Resumir. Golpea OK.</li>
	<li>Registre el resultado % de área. Este es el porcentaje del área seleccionada que es blanca y, por lo tanto, representa la carga metastásica. NOTA: Se recomienda guardar los resultados en Fiji-ImageJ o copiar/pegar toda la página de resultados en un documento independiente. Si los resultados del área % son inesperados o sospechosos, es posible ver si alguna de las otras mediciones también fue sospechosa o si % de área se registró incorrectamente.</li>
	<li>Mueva el círculo, sin alterar su tamaño agarrándolo en su centro, a la siguiente placa de la imagen. Repita los pasos 7.6 y 7.7 para todas las placas de la imagen.</li>
	<li>Repita los pasos 7.1 a 7.8 en al menos dos imágenes más. Una vez analizadas todas las placas e imágenes, promediar el % de resultados de área entre diferentes imágenes para cada placa para mitigar cualquier incoherencia entre las imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
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<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se ha demostrado, el recuento manual de las colonias metastásicas en cada placa pulmonar puede ser un método inexacto e impreciso para cuantificar la metástasis pulmonar, demostrando la necesidad de un mejor medio de cuantificación(Figura 2). El análisis histopatológico difería ligeramente tanto del conteo manual como del análisis Fiji-ImageJ(Figura 2B y 4D),probablemente porque las diapositivas H&E no son una muestra representativa de todo...

Una de cada ocho mujeres será diagnosticada con cáncer de mama en su vida, y sin embargo, a pesar de múltiples opciones de tratamiento, el cáncer de mama es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en mujeres estadounidenses1. Estas mujeres no están muriendo por el tumor primario en su mama. En su lugar, la carga metastásica es responsable de la mortalidad de esta enfermedad, ya que comúnmente se propaga al pulmón, hueso, cerebro, hígado, y los ganglios linfáticos2. Debido a esto, los modelos de cáncer de mama necesitan evaluar la metástasis para contribuir a frenar la mortalidad de esta enfermedad. El modelo de cáncer de mama murino 4T1 es un excelente protocolo para lograr esto. El método descrito aquí ofrece una mejora en el modelo 4T1 mediante el uso de Fiji-ImageJ para cuantificar la metástasis pulmonar, produciendo resultados consistentes y rápidos.
El modelo 4T1 está bien establecido, con la mayoría de los laboratorios utilizando protocolos como los descritos por Pulaski y Ostrand-Rosenberg en 20013. La línea celular 4T1 es 6-Thioguanine (6TG) resistente y representativa de la etapa IV, triple cáncer de mama negativo3,4,5. Es clínicamente relevante ya que es un modelo ortotópico y espontáneamente metástasis a los mismos órganos que en el cáncer de mama humano3,4. Las células 4T1 hacen metástasis espontáneas a una velocidad predecible basada en la cantidad de células inyectadas3,4. Es importante destacar que las diferencias genéticas entre ratones utilizados aquí causaron la variabilidad interinsular esperada en la carga metastásica. Para evaluar la metástasis, los tejidos se cosechan para recolectar y cuantificar las células cancerosas en sitios distantes utilizando la selección de 6TG y la tinción azul de metileno. El resultado es una colección de placas de cultivo de tejido con puntos azules que representan colonias metastásicas. Sin embargo, el protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg cuantifica las colonias metastásicas contándolas manualmente, y por lo tanto este ha sido el medio estándar de evaluar la metástasis en este modelo. Si bien esto es fácil para los tejidos con baja carga metastásica, los tejidos como los pulmones a menudo están cargados de metástasis. Como las placas pulmonares pueden ser altamente confluentes, cuantificar con precisión y precisión las colonias metastásicas mediante el recuento manual es difícil y propenso a errores humanos. Para cuantificar mejor la carga metastásica, describimos el uso de Fiji-ImageJ para una solución informática al error de recuento humano. El análisis histopatológico con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) es otro medio para cuantificar metástasis pulmonares, y curiosamente también se ha mejorado con el software Fiji-ImageJ6,7. Sin embargo, debido a que el análisis histopatológico observa una sola porción del pulmón, puede ser inexacto y poco representativo. Esto se debe a que el modelo 4T1 causa varias lesiones metastásicas en todo el órgano que no se distribuyen uniformemente. Si bien las tendencias generales entre el análisis histopatológico y el recuento manual pueden ser similares8, los valores individuales pueden diferir y, por lo tanto, el análisis histopatológico no debe utilizarse como único medio de cuantificación. Demostramos el beneficio en comparación con el análisis histopatológico y las incoherencias en el recuento manual entre diferentes contadores, al tiempo que demostramos la coherencia del uso de Fiji-ImageJ. Además, mostramos que este método puede reducir el tiempo de incubación de 10-14 días a 5 días, lo que significa que los investigadores pueden analizar los datos de su estudio mucho antes que cuando se basa en el conteo manual.
Este método es una colección de ajustes simples al protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg3. Debido a que el modelo 4T1 es ampliamente utilizado, y debido a que la metástasis pulmonar es un parámetro crítico para medir en modelos preclínicos, creemos que este método puede ser ampliamente utilizado y es muy valioso para los investigadores de cáncer de mama. Los únicos suministros adicionales necesarios son una cámara y el acceso a un ordenador con Fiji-ImageJ, un software gratuito utilizado con frecuencia en el análisis de imágenes9. Este método se centra específicamente en la metástasis pulmonar, pero podría utilizarse para otros tejidos con una carga metastásica significativa.

<table><tbody><tr><td>Cámara de anestesia</td><td>Ver comentarios Ver</td><td>comentarios Utilice</td><td>materiales aprobados en las políticas de su institución</td></tr><tr><td>Agente anestésico</td><td>Ver comentarios</td><td>Ver comentarios</td><td>Utilice materiales aprobados en las políticas de su institución</td></tr><tr><td>BALB/c Ratones hembra</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras sin filo</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Calculadora</td><td>Cualquiera</td><td>Cualquier</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Cualquier</td><td>Mínimo</td><td>de 8 megapíxeles</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Cualquiera</td><td>Cualquiera Necesita</td><td>ser capaz de 125 x g y 300 x g</td></tr><tr><td>CO2 Configuración de la eutanasia</td><td>Ver comentarios</td><td>Ver comentarios</td><td>Utilice materiales aprobados en las políticas de su institución</td></tr><tr><td>Cámaras frigoríficas, refrigeradores, cámaras frigoríficas</td><td>Cualquiera</td><td>Cualquiera</td><td></td></tr><tr><td>Computadora con Fiji-ImageJ</td><td>Cualquiera</td><td>Cualquiera</td><td>Necesita ser capaz de ejecutar Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>Cámara de conteo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Cualquiera Cualquiera</td><td></td> Elastase <td></td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Báscula electrónica</td><td>Cualquier</td><td>Cualquiera</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> Ver <td>comentarios</td><td>Ver comentarios</td><td>Debe ser capaz de 5% de CO2 y 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres o agujas</td><td>Cualquiera</td><td>Cualquiera</td><td>Para sujetar ratones durante la necropsia</td></tr><tr><td>Pinzas de plástico</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Balancín o rueda giratoria</td><td>Cualquiera</td><td>Tijeras</td><td></td></tr><tr><td>afiladas</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Filtro desechable estéril con membrana PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T-150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T-25 Fisher</td><td>Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T-75 Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de plástico de tres esquinas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Se utiliza para pesar ratones</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 3,5 cm</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Solución salina tamponada con phostfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific SH30028FS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 en agujas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&tímido; 2539&comercio;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Tioguanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de celdas M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Diluido al 70% con agua desionizada</td></tr></tbody></table>

uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4t1

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

El cáncer de mama es una tumoral devastadora, que representa 40.000 muertes femeninas y el 30% de los nuevos diagnósticos de cáncer femenino en los Estados Unidos solo en 2019. La principal causa de muertes relacionadas con el cáncer de mama es la carga metastásica. Por lo tanto, los modelos preclínicos para el cáncer de mama deben analizar la carga metastásica para que sea clínicamente relevante. El modelo de cáncer de mama 4T1 proporciona un modelo de ratón cuantificable y cuantificador de forma espontánea para el cáncer de mama humano en estadio IV. Sin embargo, la mayoría de los protocolos 4T1 cuantifican la carga metastásica contando manualmente las colonias manchadas en placas de cultivo de tejidos. Si bien esto es suficiente para los tejidos con menor carga metastásica, el error humano en el conteo manual causa resultados inconsistentes y variables cuando las placas son confluentes y difíciles de contar. Este método ofrece una solución basada en computadora para el error de recuento humano. Aquí, evaluamos el protocolo usando el pulmón, un tejido altamente metastásico en el modelo 4T1. Las imágenes de placas teñidas de azul de metileno se adquieren y se cargan para su análisis en Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina a continuación el porcentaje del área seleccionada de la imagen que es azul, lo que representa el porcentaje de la placa con carga metastásica. Este enfoque basado en computadora ofrece resultados más consistentes y expeditivos que el conteo manual o la evaluación histopatológica para tejidos altamente metastásicos. La consistencia de los resultados de Fiji-ImageJ depende de la calidad de la imagen. Pueden producirse ligeras variaciones en los resultados entre las imágenes, por lo que se recomienda que se tomen varias imágenes y se promedan los resultados. A pesar de sus limitaciones mínimas, este método es una mejora para cuantificar la carga metastásica en el pulmón al ofrecer resultados consistentes y rápidos.

Este método contiene ajustes simples del protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg 4T13 y se puede visualizar en la Figura 1. Cuando 3 investigadores separados contaron manualmente colonias metastásicas para 12 placas pulmonares (1:10 dilución), los resultados fueron muy inconsistentes entre diferentes contadores (Figura 2A). Todos los investigadores fueron dirigidos a "contar las colonias metastásicas que aparecen como puntos azules", sin em...

Describimos un método más consistente y expeditivo para cuantificar la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1 mediante Fiji-ImageJ.

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Este protocolo cuantifica la metástasis pulmonar, que es una causa agresiva y común de muerte relacionada con el cáncer de mama, con mayor precisión y eficiencia en un modelo preclínico de cáncer de mama. En comparación con la técnica original, este protocolo proporciona a los investigadores resultados más rápidos y consistentes. Alivia el error de conteo humano a través de la tecnología informática fácil de usar.Esta técnica puede extenderse absolutamente a la investigación preclínica que estudia los efectos de las terapias contra el cáncer de mama en la metástasis pulmonar al permitir a los investigadores demostrar una menor carga metastásica después de un tratamiento exitoso. Comience por etiquetar un tubo cónico de 15 mililitros para la muestra de tejido. A continuación, añadir 2,5 mililitros de mezcla de colagenasa tipo cuatro y 30 unidades de elastasa al tubo.Mueva el pulmón a un pozo LIMPIO de 1X HBSS y arremolinarlo con fórceps para extraer cualquier sangre restante, luego transfirtelo a una placa de cultivo de tejido vacía de 3,5 centímetros. Picar el pulmón con tijeras, luego enjuagar la placa con 2,5 mililitros de HBSS y transferir el HBSS con las piezas pulmonares en un tubo cónico preparado de 15 mililitros con el cóctel de colagenasa y elastasa. Incubar el tubo durante 75 minutos a cuatro grados centígrados en una rueda basculante o giratoria.Mientras tanto, etiqueta un tubo centrífugo de 50 mililitros y una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros para cada ratón. Si realiza una dilución, etiquete suficientes placas de cultivo de tejido para las diluciones. Lleve el volumen del tubo hasta 10 mililitros con 1X HBSS, luego vierta el contenido sobre un colador celular de 70 micrómetros en el tubo cónico de 50 mililitros.Utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para moler suavemente la muestra a través del colador. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 350 veces G y desechar el sobrenadante, luego lave el pellet dos veces con 10 mililitros de 1X HBSS. Resuspender el pellet en 10 mililitros de 60 micromolares 6-tioguanina completo medio de cultivo, y placar las muestras en las placas de cultivo celular de 10 centímetros utilizando un esquema de dilución si se desea.Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco días. Vierta los medios de cultivo fuera de las placas en el contenedor de residuos apropiado. Para fijar las células, agregue cinco mililitros de metanol sin diluir a cada plato e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, asegurándose de girar el metanol para que cubra todo el plato.Vierta el metanol de las placas en el recipiente de residuos apropiado y, a continuación, enjuague cada plato con cinco mililitros de agua destilada. Añadir cinco mililitros de 0,03% azul de metileno por placa e incubarlo durante cinco minutos a temperatura ambiente, asegurándose de girar la solución azul de metileno para que cubra todo el plato. Vierta el azul de metileno en el recipiente de residuos apropiado y enjuague cada plato de nuevo con cinco mililitros de agua destilada.Gire la placa al revés y sobra la toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa sobre su tapa y déjela secar al aire durante la noche. Las colonias metastásicas serán azules.Una vez que las placas se han secado, se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente. Retire las tapas etiquetadas de las placas, teniendo cuidado de asegurar una identificación clara de las muestras. Alinee todas las placas pulmonares manchadas sobre una superficie limpia y ligera.Tome una foto de la colección de placas en un área bien iluminada, asegurándose de minimizar los reflejos. Las reflexiones en las placas influirán en el análisis de imágenes y deben evitarse. Preste mucha atención a las fotografías tomadas y tome varias fotografías desde varios ángulos.Después de fotografiar las placas, recorte la imagen para excluir las tapas o cualquier cosa en el fondo. Abra la imagen en Fiji ImageJ y cámbielo a blanco y negro haciendo clic en imagen, ajuste y umbral de color. A continuación, seleccione el valor predeterminado para el método de umbral, el blanco y negro para el color de umbral y el laboratorio para el espacio de color.Asegúrese de que el cuadro de fondo oscuro no está seleccionado. La imagen ahora debe ser en blanco y negro. El negro representa el fondo claro, y el blanco representa las colonias metastásicas azules.Utilice la herramienta de círculo para seleccionar el área que se va a analizar. Dibuje un círculo para utilizar para todas las placas para asegurarse de que cada placa se analiza para el mismo área de tamaño. Elija un tamaño que maximice el área analizada en las placas mientras minimiza el ruido de fondo que aparece en el borde de las placas.El tamaño aparece en la barra de herramientas a medida que se dibuja. Analice el círculo seleccionado para determinar el porcentaje de área blanca. Haga clic en analizar y analizar partículas, luego seleccione de cero a infinito para el tamaño, de cero a uno para la circularidad, y nada para mostrar.Marque la casilla resumida y pulse OK. Mueva el círculo a la siguiente placa de la imagen agarrándola en el centro y repita el análisis. Copie y pegue el resultado en una hoja de cálculo.El área de porcentaje, que es el porcentaje del área seleccionada que es blanca, representa la carga metastásica. Una vez analizadas todas las placas e imágenes, promedia los resultados del área porcentual entre las diferentes imágenes de cada placa para mitigar cualquier incoherencia entre las imágenes. El análisis de Fiji ImageJ se comparó con el conteo manual y el análisis histopatológico.Cuando tres investigadores separados contaron manualmente colonias metastásicas, los resultados fueron inconsistentes entre los contadores. Los resultados de Fiji ImageJ fueron coherentes entre los contadores de cada una de las tres imágenes. Los resultados de las tres imágenes y los tres contadores se combinaron para cada placa pulmonar.Los resultados se promediaron para cada placa para tener en cuenta las variaciones entre las imágenes, lo que proporcionó resultados consistentes entre los contadores. Al clasificar las placas de mayor a menor metastásica, el conteo manual estuvo de acuerdo en la placa más confluente, pero todos los rangos siguientes eran inconsistentes. Las filas de los resultados medios de Fiji ImageJ fueron mucho más consistentes entre los contadores.Para demostrar la importancia de evitar reflexiones en las imágenes, se muestra una imagen con el reflejo de una mano y su posterior análisis De Fiji ImageJ junto con una imagen de la misma placa sin reflejo. Las imperfecciones oscuras de una superficie de fondo sucia o un residuo de muestra de sangre en las placas también pueden afectar negativamente al análisis de Fiji ImageJ. Esta placa de sangre sólo tiene dos colonias metastásicas, pero el residuo oscuro hizo que Fiji ImageJ lo considerara como 31.6%metastásico.Al intentar este protocolo, recuerde examinar cuidadosamente las imágenes para la reflexión, utilice el mismo círculo de tamaño para cada placa de la imagen y promedió los resultados de cada placa entre al menos tres imágenes separadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

Se describe un protocolo para la preclínica en vivo rastreo de metástasis del cáncer. Se basa en un reportero con radionúclidos-fluorescencia combina el sodio yoduro symporter, detectado por tetrafluoroborato de no invasivo [18F]-PET y una proteína fluorescente para la confirmación de racionalización ex vivo . El método es aplicable para la preclínica en vivo de la célula de seguimiento más allá de la biología del tumor.

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

En este protocolo, se describe cómo utilizar [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomografía por emisión de positrones y tomografía computada (18F-FDG PET/CT) la proyección de imagen para medir la respuesta metabólica del tumor a la terapia dirigida MLN0128 en un  KRAS/Lkb1 ratón mutante modelo de cáncer de pulmón y se juntaron con autorradiografía ex vivo de alta resolución y la histología cuantitativa la proyección de imagen.

Utilizando 18F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aprende a cuantificar metástasis pulmonar en modelos preclínicos de cáncer de mama 4T1 mediante análisis de imágenes con Fiji-ImageJ. Este método mejora la precisión y reduce errores humanos en el conteo.

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1 (Video) | JoVE Journal

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

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