Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones
25 de octubre de 2021
Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.
Los hepatocitos primarios de ratón son importantes en los estudios hepáticos. Especialmente para el metabolismo de la glucosa y las pruebas de drogas hepáticas. En cuanto al tiempo, el proceso de aislamiento puede llevar mucho tiempo y la energía es costosa.
Este protocolo puede proporcionar una forma eficiente de aislar los hepatocitos primarios de ratón. Es amigable con el tiempo y el trabajo. Requiere muy pocos pasos con todas las regiones disponibles comercialmente.
Comience usando la bomba peristáltica para comenzar a bombear agua destilada doble calentada a una velocidad de 4 ml por minuto, durante cinco minutos. Luego cambie el tubo de bombeo de agua a medio de perfusión calentado. Monitoreo de la burbuja de aire entre el agua y el medio de perfusión.
Ayudará a rastrear el flujo del medio de perfusión a través del sistema. A continuación, desinfecte el abdomen de un ratón hembra C57 negro 6J anestésico de ocho semanas de edad con 70% de etanol. Y usando una tijera, corte el abdomen para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior.
Luego detenga la bomba peristáltica. Después de asegurarse de que el tubo de bombeo contiene medio de perfusión y no agua. Inserte un catéter de calibre 24 en la vena cava inferior.
Vuelva a encender la bomba y abra la vena porta. Mientras se bombea el medio de perfusión, presione la vena porta cada minuto para que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando durante aproximadamente tres a cinco minutos o hasta que el líquido eliminado esté limpio.
A continuación, cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio de dispasa de colagenasa. Y presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando hasta que se agoten los 25 ml del medio de dispasa colagenasa.
A continuación, aísle todo el hígado sin la vesícula biliar. Y lo colocamos en 30 mL de medio de lavado en una placa de Petri sobre hielo. El uso de fórceps rompe el hígado en pedazos para liberar hepatocitos primarios en la solución.
En esta etapa, el medio de lavado se convierte en una solución turbia que contiene hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado. Filtre esta solución turbia a través de un colador de células de 70 micras, en 20 mL de 1X por llamada HBSS en un tubo de 50 mL sobre hielo. Y mezcle la solución invirtiendo el tubo 20 veces.
A continuación, centrífuga la solución. Luego, en la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Y lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
Pellet las células una vez más con centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml de medio de cultivo. Cuente las células y colóquelas en placas de cultivo deseadas.
Según el diseño experimental. Después del recubrimiento, los hepatocitos primarios aislados se unieron firmemente por una hora y se expandieron completamente después de 12 horas. En los hepatocitos aislados, los niveles de ARNm de los marcadores de hepatocitos, como transtiretina, CD95, ASGR1 y ASGR2 aumentaron significativamente en comparación con todo el hígado.
En contraste, la presencia de células inmunes, células estrelladas y células endoteliales fue menor. Como lo demuestra una fuerte disminución en los niveles de ARNm de CD45, colágeno tipo 1 alfa 1 y célula endotelial 2 quinasa 2. Lo que sugiere que este protocolo puede reducir en gran medida la interferencia de otras células hepáticas.
Después del recubrimiento, los niveles de ASGR1 y ASGR2 disminuyeron con el tiempo, pero permanecen comparables a todo el hígado hasta el punto de tiempo de 12 horas. Especialmente para ASGR1. El nivel de expresión de CD81 unido a la membrana fue consistente hasta por 48 horas.
En comparación, la expresión del receptor 4 tipo toll generalmente aumentó y se volvió más alta que los niveles in vivo después de 48 horas. Los ensayos de sensibilidad a la insulina demostraron que la insulina promovió significativamente la fosforilación de ambos AKT en la serina 473. Y la caja de tenedor 01 en la serina 256, en los hepatocitos.
Indicando la sensibilidad de los hepatocitos primarios a la insulina. Los niveles de proteína fosfoenolpiruvato carboxiquinasa aumentaron significativamente después del tratamiento con glucagón. Sugiriendo que la vía de producción de glucosa se activó.
Esta activación se confirmó aún más por el aumento de la producción de glucosa. Y con otros estimuladores de producción de glucosa como Forskolin+IBMX. Este protocolo puede ahorrar tiempo y energía para estudios con hepatocitos primarios de ratón.
Siguiendo este protocolo, se pueden llevar a cabo experimentos relacionados, como el hipotético metabolismo de la glucosa y los ensayos de biomarcadores farmacéuticos.
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Visión general
Este estudio presenta un protocolo eficiente en tiempo y trabajo para aislar hepatocitos primarios de ratón, que son críticos para la investigación en función y metabolismo del hígado. El método utiliza reactivos comercialmente disponibles para mejorar el rendimiento y minimizar la interferencia de células no parenquimales.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Metabolismo hepático
- Metabolismo de la glucosa
- Pruebas de medicamentos
Antecedentes
- Los hepatocitos primarios de ratón son esenciales para estudiar la biología del hígado.
- Los métodos de aislamiento tradicionales suelen ser lentos y laboriosos.
- Reducir el tiempo de aislamiento puede facilitar una experimentación biológica más eficiente.
Métodos utilizados
- Protocolo de aislamiento usando bomba peristáltica y medio de dispase de colagenasa.
- Modelo de ratón: ratones hembras C57BL/6J.
- Técnicas para cultivo celular y medición de la expresión génica.
Principales resultados
- Aumento de los niveles de ARNm de marcadores de hepatocitos en comparación con el hígado entero.
- Disminución de la presencia de células inmunes y endoteliales después del aislamiento.
- Demostración de sensibilidad a la insulina y vías de producción de glucosa activadas.
Conclusiones
- Este protocolo mejora significativamente la eficiencia del aislamiento de hepatocitos primarios.
- Mayor comprensión del metabolismo de la glucosa y la respuesta a los medicamentos en estudios hepáticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary hepatocytes is critical for liver metabolism and drug testing studies, where time and labor constraints impact throughput in discovery workflows. This protocol reduces isolation time to ~35 minutes while maintaining hepatocyte yield and purity, supporting rapid hypothesis testing in preclinical models. The method enables scalable preparation of disease-relevant systems for mechanistic de-risking in target validation and lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides purified hepatocytes for interrogating therapeutic hypotheses in glucose metabolism and hepatic drug response pathways.
- Operational Value: Reduces time and labor burden, enabling higher throughput in target validation assays.
- Predictive Value: Yields hepatocytes with demonstrated insulin sensitivity and gluconeogenesis activation, supporting mechanistic de-risking of liver targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hepatocytes with low non-parenchymal cell interference, improving assay specificity for compound screening.
- Operational Value: Uses commercially available reagents and standardized steps, enhancing reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems suitable for high-content or phenotypic screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems for preclinical validation of liver-targeted compounds.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates hepatocytes with validated glucose production and insulin response, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Maintains hepatocyte marker expression (ASGR1, ASGR2, CD81) for up to 12 hours, enabling biomarker-assay compatibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, providing a reliable source of primary hepatocytes for liver metabolism assays.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of hepatic pathways by delivering hepatocytes with confirmed marker expression and functional responses.
- Screening: Produces hepatocytes suitable for compound evaluation due to reduced stromal cell contamination and consistent insulin sensitivity.
- Analytics: Supports quantitative readouts such as glucose production, phosphorylation assays, and mRNA expression of hepatocyte markers.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by providing hepatocytes that maintain key metabolic functions for up to 48 hours.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that standardizes hepatocyte preparation across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver metabolism studies through reduced cellular interference and functional validation.
- Operational Value: Streamlines workflow with minimal steps and commercially available reagents, improving lab efficiency.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by reducing isolation time from hours to ~35 minutes, increasing assay frequency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of liver targets by providing reliable preclinical models for mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and perfusion techniques.
- Depends on access to a peristaltic pump and sterile tissue culture environment.
- Necessitates standardized reagent preparation (perfusion medium, collagenase dispase, wash and culture media).
- Involves adaptation considerations for different mouse strains or ages beyond the C57BL/6J female model used.
- Limited by the need for immediate use of isolated hepatocytes to maintain functional integrity, as marker expression declines after 12 hours.
