Name: Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Aprenda un protocolo eficiente para aislar hepatocitos primarios de ratón C57BL/6J usando bomba peristáltica y medio de colagenasa-dispasa. Este método optimiza el estudio del metabolismo hepático y la respuesta a fármacos.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvención 5R01HD095512-02 a S.W.).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).
1. Preparación:
<ol><li>Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.</li>
	<li>Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.</li>
	<li>Caliente 50 ml de H2O de doble destilación (ddH2O), 35 ml de medio de perfusión (por ejemplo, medio de perfusión hepática) (o 50 ml la primera vez que se utiliza este protocolo) y 25 ml de medio filtrado de colagenasa-dispasa en un baño de agua de 45 °C durante 30 min.</li>
	<li>Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, mezcle 2 ml de 10x HBSS y 18 mL de Percoll en un tubo de 50 mL para hacer 20 mL 1x Percoll-HBSS y mantener en hielo o 4 °C. NOTA: 1x Percoll-HBSS se puede mantener a 4 °C durante al menos 6 meses.</li>
	<li>Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, vierta 30 ml de medio de lavado (por ejemplo, hepatocyte Wash Medium) en una placa de Petri limpia y manténgalo en hielo.</li>
	<li>Sumerja el tubo de bombeo en el agua de un baño de agua a 45 °C. Los resultados son más fiables si la temperatura ambiente está a 25 °C.</li>
	<li>Preparar 2 ml de 1x anestésicos mezclando 225 μL de ketamina HCL, 93,75 μL de xilazina y 1681 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Anestesiar un ratón utilizando un método aprobado. Aquí el ratón fue inyectado intraperitonealmente con 150 μL de 1x anestésicos. Realice las pruebas para detectar la pérdida de reflejos, como la reacción al pellizco del dedo del pie para garantizar una anestesia completa.</li>
	<li>Asegure el ratón en su espalda a la almohadilla de disección por cuatro extremidades, ya sea fijando o usando cinta impermeable u otros métodos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la institución (o equivalentes).</li>
	<li>Prepare pinzas y tijeras esterilizadas para la disección. Para evitar una posible contaminación, realice todos los pasos dentro de una campana estéril.</li>
</ol>2. Procedimiento:
<ol><li>Usando una bomba peristáltica, comience a bombear ddH2O calentado a una velocidad de 4 ml / min durante 5 minutos. Cambie el tubo de bombeo de agua a un medio de perfusión calentado.</li>
	<li>Desinfecte el abdomen del ratón anestesiado con 70% de EtOH y ártelo con una tijera para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC).</li>
	<li>Detenga la bomba peristáltica. Inserte un catéter de 24 G (por ejemplo, catéter IV cerrado, 24 G, 0,75 IN) en IVC. Comience a bombear y corte la vena porta abierta.</li>
	<li>Continúe bombeando hasta que el líquido eliminado esté claro (alrededor de 3-5 min). Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Tenga cuidado de no dejar que las burbujas de aire entren en el IVC. NOTA: Este paso consiste en eliminar la mayor cantidad de sangre posible del hígado.</li>
	<li>Cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio colagenasa-dispasa. Continúe bombeando hasta que los 25 ml del medio colagenasa-dispasa se agoten mientras realiza el paso 2.6.</li>
	<li>Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. NOTA: En esta etapa, la pérdida completa de sangre es fatal para el ratón. La muerte del ratón puede confirmarse por la falta de latidos del corazón después del experimento. Deseche el cadáver según las políticas de la instalación.</li>
	<li>Aísle todo el hígado sin vesícula biliar al medio de lavado de 30 ml en la placa de Petri sobre hielo.</li>
	<li>Romperlo en pedazos con fórceps para liberar hepatocitos primarios en solución. Este paso convertiría el medio de lavado en una solución turbia llena de hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado.</li>
	<li>Filtre la solución turbia en el paso 2.8 a través de un colador celular de 70 μm en el Percoll-HBSS de 20 ml 1x en un tubo de 50 ml sobre hielo. Mezclar invirtiendo el tubo 20 veces.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Dentro de la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.</li>
	<li>Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml del medio de cultivo (u otros volúmenes apropiados) dentro de la campana de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Cuente el número de células y platee las células en las placas de cultivo deseadas de acuerdo con el diseño experimental. NOTA: Los hepatocitos primarios correctamente aislados de un ratón de 8 semanas de edad suelen ser suficientes para ser chapados en cuatro placas de 6 pocillos o cuatro placas de 12 pocillos.</li>
</ol>

<ol><li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cell+polyploidization%3A+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214(2015).</li>
<li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).</li>
<li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li>
<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+as+immunological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li>
<li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).</li>
<li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li>
<li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li>
<li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li>
<li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-147%2C+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation%2C+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).</li>
<li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169(2007).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021).</li>
<li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+cell+of+origin%2C+molecular+class%2C+and+effects+on+patient+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li>
<li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48(2017).</li>
<li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li>
<li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD95+receptor%3A+apoptosis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li>
<li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li>
<li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se han desarrollado varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. También se han mantenido optimizados y adaptados en función de las diferentes necesidades (Tabla 1). Los protocolos de aislamiento generalmente se componen de dos partes: perfusión (incluida la digestión enzimática) y purificación.
La perfusión se puede realizar con todo el hígado in vivo 2,20,21,22,23 o con lóbulos hepáticos diseca...

El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fundamental para la producción y el almacenamiento de glucosa1. Los experimentos con hepatocitos primarios in vitro son imprescindibles para la mayoría de los estudios del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, durante años, varios grupos de investigación han desarrollado protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones.
El procedimiento general del aislamiento de hepatocitos de ratón es primero eliminar la sangre en el hígado con un líquido isosmótico como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y luego usar solución que contiene colagenasa para disociar los hepatocitos. Estos protocolos comparten un procedimiento general, pero difieren en reactivos y pasos en función de las diferentes necesidades. Sin embargo, la preparación de los reactivos necesarios y la realización de pasos de aislamiento llevan tiempo. En el desarrollo del presente protocolo, se estableció la eficiencia como una prioridad, con todos los reactivos listos para usar y disponibles en el mercado, y la menor cantidad de pasos posible. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método rápido y eficiente en el trabajo de parto para aislar los hepatocitos primarios del ratón, sin poner en peligro la pureza y viabilidad de los hepatocitos primarios aislados.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>FALCON</td><td></td><td>353043 Recubrimiento no requerido</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>FALCON</td><td></td><td>353046 Recubrimiento no requerido</td></tr><tr><td>anti-AKT</td><td>Cell Signaling</td><td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica antibiótica (100x), estabilizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>anti-FOXO1</td><td>Señalización</td> celular <td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>Señalización celular</td><td>anti-GAPDH</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-AKT (S473)</td><td>Señalización celular</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>anti-PEPCK</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-FOXO1 (S256)</td><td>Señalización celular</td><td>84192S Filtro celular</td><td></td></tr><tr><td>, 70 y micro; m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>Catéter IV Cerrado, Calibre 24 0.75 IN</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, sin glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom Kit de ensayo de glucosa</td><td>BioAssay Systems</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucagón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-ratón IgG Anticuerpo Secundario</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-conejo Anticuerpo Secundario IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocitos Medio de lavado</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Señalización celular</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td>Lilly NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCL (100 mg/mL)</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Medio de digestión hepática</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>Alícuota dentro de la campana de cultivo de tejidos a 25 mL cada uno en tubo de 50 mL, y manténgalo en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>congelador Medio de perfusión hepática</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>Capaz de bombear a 4 mL/min Placa de</td></tr><tr><td>Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>refrigeradaSorvall</td><td>Legend RT</td><td>Capaz de centrifugar tubo de 50 mL a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>L-lactato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, PVDF 0.45 y micro; m 30 mm de diámetro</td><td>Jeringa de</td><td>229745</td><td></td>CELLTREAT</tr><tr><td>, 0,5 mL</td> Jeringa <td>329461</td><td></td><td>Becton Dickinson</td></tr><tr><td>, 60 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano, 0,4%</td> <td>Tubo de 15250061</td><td></td><td></td>Gibco</tr><tr><td>, 15 mL</td> Tubo <td>de 430052</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Agua Tanque de baño</td><td>Corning</td><td>CLS6783</td><td>O cualquier tanque de baño de agua capaz de calentar hasta 45 & grados; C</td></tr><tr><td>Guillermo' s E Medio (Suplemento GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>Xilozina (100 mg/mL)</td><td>Vetone Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Los hepatocitos primarios se utilizan ampliamente en la investigación in vitro del hígado, especialmente en estudios de metabolismo de la glucosa. Se ha adaptado una técnica base en función de diferentes necesidades, como el tiempo, la mano de obra, el costo y el uso de hepatocitos primarios, lo que resulta en varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. Sin embargo, los numerosos pasos y las preparaciones de reactivos que consumen mucho tiempo en el aislamiento primario de hepatocitos son inconvenientes importantes para la eficiencia. Después de comparar diferentes protocolos por sus pros y sus contras, se combinaron las ventajas de cada uno, y se formuló un protocolo de aislamiento de hepatocitos primarios rápido y eficiente. En solo ~ 35 minutos, este protocolo podría producir tanto, si no más, hepatocitos primarios sanos como otros protocolos. Además, los experimentos de metabolismo de la glucosa realizados utilizando los hepatocitos primarios aislados validaron la utilidad de este protocolo en estudios in vitro de metabolismo hepático. También revisamos y analizamos ampliamente la importancia y el propósito de cada paso en este estudio para que los futuros investigadores puedan optimizar aún más este protocolo en función de las necesidades.

Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos2, la sensibilidad a la insulina y la producción de glu...

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Los hepatocitos primarios de ratón son importantes en los estudios hepáticos. Especialmente para el metabolismo de la glucosa y las pruebas de drogas hepáticas. En cuanto al tiempo, el proceso de aislamiento puede llevar mucho tiempo y la energía es costosa.Este protocolo puede proporcionar una forma eficiente de aislar los hepatocitos primarios de ratón. Es amigable con el tiempo y el trabajo. Requiere muy pocos pasos con todas las regiones disponibles comercialmente.Comience usando la bomba peristáltica para comenzar a bombear agua destilada doble calentada a una velocidad de 4 ml por minuto, durante cinco minutos. Luego cambie el tubo de bombeo de agua a medio de perfusión calentado. Monitoreo de la burbuja de aire entre el agua y el medio de perfusión.Ayudará a rastrear el flujo del medio de perfusión a través del sistema. A continuación, desinfecte el abdomen de un ratón hembra C57 negro 6J anestésico de ocho semanas de edad con 70% de etanol. Y usando una tijera, corte el abdomen para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior.Luego detenga la bomba peristáltica. Después de asegurarse de que el tubo de bombeo contiene medio de perfusión y no agua. Inserte un catéter de calibre 24 en la vena cava inferior.Vuelva a encender la bomba y abra la vena porta. Mientras se bombea el medio de perfusión, presione la vena porta cada minuto para que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando durante aproximadamente tres a cinco minutos o hasta que el líquido eliminado esté limpio.A continuación, cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio de dispasa de colagenasa. Y presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando hasta que se agoten los 25 ml del medio de dispasa colagenasa.A continuación, aísle todo el hígado sin la vesícula biliar. Y lo colocamos en 30 mL de medio de lavado en una placa de Petri sobre hielo. El uso de fórceps rompe el hígado en pedazos para liberar hepatocitos primarios en la solución.En esta etapa, el medio de lavado se convierte en una solución turbia que contiene hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado. Filtre esta solución turbia a través de un colador de células de 70 micras, en 20 mL de 1X por llamada HBSS en un tubo de 50 mL sobre hielo. Y mezcle la solución invirtiendo el tubo 20 veces.A continuación, centrífuga la solución. Luego, en la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Y lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.Pellet las células una vez más con centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml de medio de cultivo. Cuente las células y colóquelas en placas de cultivo deseadas.Según el diseño experimental. Después del recubrimiento, los hepatocitos primarios aislados se unieron firmemente por una hora y se expandieron completamente después de 12 horas. En los hepatocitos aislados, los niveles de ARNm de los marcadores de hepatocitos, como transtiretina, CD95, ASGR1 y ASGR2 aumentaron significativamente en comparación con todo el hígado.En contraste, la presencia de células inmunes, células estrelladas y células endoteliales fue menor. Como lo demuestra una fuerte disminución en los niveles de ARNm de CD45, colágeno tipo 1 alfa 1 y célula endotelial 2 quinasa 2. Lo que sugiere que este protocolo puede reducir en gran medida la interferencia de otras células hepáticas.Después del recubrimiento, los niveles de ASGR1 y ASGR2 disminuyeron con el tiempo, pero permanecen comparables a todo el hígado hasta el punto de tiempo de 12 horas. Especialmente para ASGR1. El nivel de expresión de CD81 unido a la membrana fue consistente hasta por 48 horas.En comparación, la expresión del receptor 4 tipo toll generalmente aumentó y se volvió más alta que los niveles in vivo después de 48 horas. Los ensayos de sensibilidad a la insulina demostraron que la insulina promovió significativamente la fosforilación de ambos AKT en la serina 473. Y la caja de tenedor 01 en la serina 256, en los hepatocitos.Indicando la sensibilidad de los hepatocitos primarios a la insulina. Los niveles de proteína fosfoenolpiruvato carboxiquinasa aumentaron significativamente después del tratamiento con glucagón. Sugiriendo que la vía de producción de glucosa se activó.Esta activación se confirmó aún más por el aumento de la producción de glucosa. Y con otros estimuladores de producción de glucosa como Forskolin+IBMX. Este protocolo puede ahorrar tiempo y energía para estudios con hepatocitos primarios de ratón.Siguiendo este protocolo, se pueden llevar a cabo experimentos relacionados, como el hipotético metabolismo de la glucosa y los ensayos de biomarcadores farmacéuticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.

Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprenda un protocolo eficiente para aislar hepatocitos primarios de ratón C57BL/6J usando bomba peristáltica y medio de colagenasa-dispasa. Este método optimiza el estudio del metabolismo hepático y la respuesta a fármacos.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

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