Name: Segmentación Del Crecimiento De Las Células Endoteliales En Placas De 6 Pozos En Una Coctelera Orbital Para Estudios Mecanobiológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a restringir el crecimiento de células endoteliales en placas de 6 pozos usando un método de recubrimiento con agitador orbital. Este protocolo permite estudiar los efectos del estrés cortante en biología vascular.

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Los autores agradecen una subvención para proyectos de la Fundación Británica del Corazón (a PDW), una beca TAAP y DYNAMO del Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur (a XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), una beca de posgrado A*STAR (a KTP) y una beca de estudiante del Centro de Excelencia en Investigación de la Fundación Británica del Corazón (a MA).

1. Fabricación de dispositivos y preparación de reactivos
<ol><li>Fabricación de módulos de acero inoxidable<ol>
<li>Fabrique el módulo de acero inoxidable de un acero inoxidable de grado 316 utilizando una fresadora CNC de acuerdo con el dibujo de ingeniería proporcionado (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impresión 3D de un molde de polidimetilsiloxano (PDMS)<ol>
<li>Prepare un modelo de diseño asistido por ordenador (CAD) 3D del molde PDMS utilizando SolidWorks de acuerdo con el dibujo de ingeniería proporcionado (Figura 2).</li>
		<li>Exporte el modelo CAD a un archivo STL e importe el archivo STL a Cura 2.6.2.</li>
		<li>Rebanar el modelo en capas con una velocidad de impresión de 50 mm/s y una densidad de relleno del 60%.</li>
		<li>Exporte el archivo como un código G y cárguelo en una impresora 3D Ultimaker2 para imprimirlo. Utilice ácido poliláctico (PLA) como material de impresión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fundición del anillo PDMS<ol>
<li>Mezcle la base de PDMS y el agente de curado (ambos de un kit de elastómero de silicona) con la proporción de 90.9% base y 9.1% de agente de curado.</li>
		<li>Vierta aproximadamente 2,6 mL de la solución bien mezclada en el molde impreso en 3D.</li>
		<li>Retire las burbujas en una cámara de desgasificación al vacío.</li>
		<li>Curarlo durante 1 h en un horno de 80 °C.</li>
		<li>Deje que el anillo PDMS se enfríe a temperatura ambiente y, a continuación, retire el anillo PDMS curado cuidadosamente del molde. El dibujo de ingeniería del anillo PDMS se muestra en la Figura 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de 1% Pluronic F-127<ol>
<li>Pesar 5 g de Pluronic F-127, verterlo en una botella de vidrio, luego añadir 100 ml de agua estéril en la botella de vidrio. Esto da una solución pluronic F-127 al 5%.</li>
		<li>Asegúrese de que todo el polvo Pluronic F-127 esté sumergido en el agua, cierre la tapa y autoclave utilizando un programa de ciclo de esterilización líquida.</li>
		<li>Después del autoclave, deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso.</li>
		<li>Añadir 10 mL de solución Pluronic F-127 al 5% a 40 mL de agua estéril en autoclave para hacer una solución Pluronic F-127 al 1%. Realice la dilución en una campana de gabinete de bioseguridad (BSC).</li>
		<li>Guarde tanto 1% como 5% Pluronic F-127 a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de paraformadehído al 4% (PFA)<ol>
<li>Añadir 800 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un vaso de precipitados de vidrio y calentarlo a 60 °C mientras se agita (mantener la agitación de la etapa 1.5.1 a 1.5.5).</li>
		<li>Pesar 40 g de polvo de PFA y añadirlo a la solución de PBS caliente. PRECAUCIÓN: PFA es peligroso, realice los pasos 1.5.2 a 1.5.6 en una campana extractora de humos.</li>
		<li>Agregue 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) lentamente gota a gota en la solución de PFA hasta que las soluciones se despejen.</li>
		<li>Ajuste el pH de la solución de PFA a aproximadamente 7,4 con 1 M de ácido clorhídrico (HCl).</li>
		<li>Recarga la solución a 1 L con 1X PBS. Esto da 1 L de 4% PFA.</li>
		<li>Filtre la solución PFA con filtros de 0,2 μm para eliminar cualquier partícula, alícuota y congelar en un congelador de -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de 0.1% Triton-X<ol>
<li>Añadir 50 μL de Tritón-X puro en 50 mL de PBS para hacer una solución de Tritón-X al 0,1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de albúmina sérica bovina al 1% (BSA)<ol>
<li>Pesar 0,5 g de BSA, verterlo en un tubo de centrífuga de 50 mL, y luego añadir 50 mL de PBS en el tubo.</li>
		<li>Dejar rodar durante 1 h a temperatura ambiente sobre un rodillo para disolverlo.</li>
		<li>Conservar 1% BSA a 4 °C durante un máximo de dos semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Recubrimiento de una placa de 6 pozos
<ol><li>Módulo de acero inoxidable de autoclave, anillo PDMS y pinzas antes de su uso. Realice todos los procedimientos posteriores en una campana BSC y observe técnicas asépticas para asegurar esterilidad.</li>
	<li>Coloque el anillo PDMS en un pozo de 6 pozos con pinzas. Utilice el borde externo del anillo PDMS para alinear el anillo PDMS de forma concéntrica con el pozo. NOTA: Sólo se deben utilizar placas de pozos tratados con cultivo no tisular.</li>
	<li>Coloque el módulo de acero inoxidable en la parte superior del anillo PDMS usando pinzas.</li>
	<li>Inserte las puntas de los alicates internos del anillo de retención en los orificios de agarre del anillo de retención, apriete el soporte para reducir el diámetro del anillo de retención. Encajándolo en el pozo de 6, presione firmemente en el módulo de acero inoxidable y suelte los alicates para asegurar el anillo PDMS en el pozo.</li>
	<li>Agregue 1 mL de fibronectina de 5 μg/mL en el centro o el borde del pozo (dependiendo de la región de interés) a través de la apertura del anillo PDMS y el módulo de acero inoxidable.</li>
	<li>Gire la placa para asegurarse de que la solución de fibronectina cubre toda la región de interés.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C en una incubadora humidificada bajo 95% aire/5%CO2.</li>
	<li>Retire la solución de fibronectina del pozo y lave dos veces con PBS. Retire completamente el PBS del pozo.</li>
	<li>Retire el anillo de retención, el módulo de acero inoxidable y el anillo PDMS del pozo.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de Pluronic F-127 al 1% en el centro o en el borde del pozo (superficie sin recubrimiento) e incubar durante 1 h a temperatura ambiente para pasivar la superficie sin recubrimiento.</li>
	<li>Retire la solución Pluronic F-127 del pozo y lave tres veces con PBS.</li>
	<li>Use el pozo recubierto inmediatamente o guárdelo a 4 °C durante un hasta dos semanas con una capa de PBS en el pozo recubierto.</li>
</ol>3. Siembra de HUVECs
<ol><li>Utilice HUVECs debajo del pasaje 5 en el experimento.</li>
	<li>Retire todo el medio de cultivo y lave las células una vez con PBS.</li>
	<li>Añadir 3 mL de tripsina al 0,05% e incubar durante 3 min a 37 °C en una incubadora humidificada bajo 95% de aire/5% deCO2. Toque suavemente el matraz para desalojar las células. NOTA: Este protocolo ha sido probado usando HUVECs y la concentración de tripsina y su tiempo de incubación pueden ser diferentes para otro tipo de CE.</li>
	<li>Transfiera la solución a un tubo centrífugo de 15 mL y neutralice la tripsina utilizando 6 mL de medio de cultivo (por ejemplo, Lonza EGM-2) precalentado a 37 °C.</li>
	<li>Centrífuga a 200 x g durante 5 min. Retire la solución de tripsina neutralizada y las células resuspend con 1 mL de medio de cultivo precalcinado.</li>
	<li>Cuente las células usando un hemocitómetro y sed las células 180k en una placa recubierta de 6 pozos en 1.5 mL de medio de cultivo precalcinado.</li>
	<li>Agite la placa del pozo lateralmente para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente en el pozo.</li>
	<li>Déjelo en una incubadora humidificada de 37 °C bajo 95% de aire/5% de CO2 durante la noche.</li>
	<li>Retire las células no unidas y el medio de cultivo y reemplácelo con 2 mL de medio de cultivo precalentado. Nota : se esperan muchas celdas no adjuntas que flotan en el medio.</li>
</ol>4. Aplicación de tensión de cizalladura utilizando una coctelera orbital
<ol><li>Los HUVECs deben alcanzar la confluencia después de 3 días de crecimiento. Substituya el medio por 1,9 mL de medio de cultivo preguerra (para alcanzar una altura de 2 mm).</li>
	<li>Coloque la placa en la plataforma de una coctelera orbital en una incubadora humidificada bajo 95% de aire/5% de CO2 y gire a 150 rpm durante 3 días. NOTA: Limpie la superficie exterior de la coctelera orbital con etanol al 70% antes de colocarla en la incubadora.</li>
	<li>(Opcional) Después de 2 días de cizallamiento, los cytokines se pueden agregar al medio de cultivo para investigar la interacción entre los cytokines y la tensión del esquileo. Después del tratamiento, cizalla las células para otro día. En este estudio, el TNF-α fue utilizado para activar las células.</li>
	<li>Realizar análisis después de 3 días de aplicación de esfuerzo de cizalladura.</li>
</ol>5. Tinción e imágenes de células
<ol><li>Después de 3 días de cizalladura, retire la placa de la incubadora y lave las células dos veces con PBS.</li>
	<li>Fije las células agregando 1.5 mL de PFA al 4% en el pozo e incube durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el PFA al 4% del pozo y lave dos veces con PBS.</li>
	<li>Permeabilizar las células añadiendo 0,1% de Tritón-X en el pozo e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la solución tritón-X al 0,1% del pozo y agregue 1,5 mL de BSA al 1% en el pozo para bloquearla. Incubar las células con BSA al 1% durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluya el anticuerpo anti-humano ZO-1 del conejo en una dilución 1:200 en el 1% BSA. Añadir 1,5 mL de anticuerpo diluido en el pozo e incubarlo con las células durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Después de la incubación durante la noche, retire el anticuerpo diluido y lave las células tres veces con PBS.</li>
	<li>Diluya el anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra etiquetado con Alexa Fluor 488 a una dilución de 1:300 en PBS. Añadir 1,5 mL de anticuerpo secundario diluido en el pozo e incubarlo con las células durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el anticuerpo secundario diluido y lave las células dos veces con PBS.</li>
	<li>Diluir DRAQ5 a una dilución de 1:1000 en PBS. Añadir 1,5 mL de DRAQ5 diluido en el pozo e incubarlo con las células durante 15 min a temperatura ambiente para teñir los núcleos celulares.</li>
	<li>Retiramos el DRAQ5 diluido y lavamos tres veces con PBS.</li>
	<li>Realice un escaneo de baldosas desde el borde hasta el centro del pozo con un microscopio confocal.</li>
</ol>6. Cuantificación del índice de forma y el número de celdas
<ol><li>Postprocese las imágenes utilizando MATLAB R2016a.</li>
	<li>Lea el archivo LIF del microscopio confocal en MATLAB y convierta el escaneo de teselas combinado en una imagen binaria, luego calcule el umbral de la imagen por área e intensidad para distinguir los núcleos del fondo.</li>
	<li>Subdivida el escaneo de teselas binarias en segmentos radiales de 1 mm.</li>
	<li>Ajuste una elipse a cada núcleo individual.</li>
	<li>Cuente el número de elipses dentro de cada segmento radial para dar un número de celda.</li>
	<li>Definir el índice de forma = como SI = 4π x Área / Perímetro2. Calcular el índice de forma para cada elipse18.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de remolino-pozo es capaz de generar perfiles de flujo complejos en un solo pozo - Flujo multidireccional de baja magnitud (LMMF) en el centro y Flujo uniaxial de alta magnitud (HMUF) en el borde del pozo. Sin embargo, las secreciones mediadas por estrés de cizallamiento del mediador soluble se mezclarán en el medio de remolino y afectarán a las células en todo el pozo, potencialmente enmascarando el verdadero efecto de un perfil particular de esfuerzo de cizallamiento en las células.
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Las respuestas de las células vasculares a su entorno mecánico son importantes en el funcionamiento normal de los vasos sanguíneos y en el desarrollo de la enfermedad1. La mecanobiología de las células endoteliales (CE) que recubre la superficie interior de todos los vasos sanguíneos ha sido un foco particular de la investigación mecanobiológica porque los CE experimentan directamente el estrés de cizallamiento generado por el flujo sanguíneo sobre ellos. Diversos cambios fenotípicos como las respuestas inflamatorias, la alteración de la rigidez y la morfología, la liberación de sustancias vasoactivas y la localización y expresión de proteínas de unión dependen de la exposición de la CE al estrés de cizallamiento2,3,4. Las propiedades endoteliales dependientes del cizalladura también pueden explicar el desarrollo irregular de enfermedades como la aterosclerosis5,6,7.
Es útil estudiar el efecto de la cizalladura sobre los CE en cultivo, donde las tensiones pueden ser controladas, y los CE pueden ser aislados de otros tipos de células. Los dispositivos in vitro comúnmente utilizados para aplicar tensión de cizalladura a los CE incluyen la cámara de flujo de placa paralela y el viscosímetro de cono y placa, pero solo se puede aplicar un flujo uniaxial constante, oscilatorio y pulsátil8,9. Aunque se han desarrollado cámaras de flujo modificadas con geometrías cónicas o ramificadas y chips microfluídicos que imitan una geometría estenótica, su bajo rendimiento y la duración relativamente corta del cultivo que es posible plantean un desafío10, 11.
El método de coctelera orbital (o pozo de remolino) para el estudio de la mecanotransducción endotelial, en la que las células se cultivan en utensilios de plástico de cultivo celular estándar colocados en la plataforma de una coctelera orbital, está ganando cada vez más atención porque es capaz de imponer crónicamente patrones de tensión de cizallamiento complejos y espacialmente variables en ces con alto rendimiento (véase la revisión de Warboys et al.12). Las simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) se han empleado para caracterizar la variación espacial y temporal de la tensión de cizalladura en un pozo girando. El movimiento de remolino del medio de cultivo causado por el movimiento orbital de la plataforma agitadora en la que se coloca la placa conduce a flujo multidireccional de baja magnitud (LMMF, o flujo supuestamente pro-aterogénico) en el centro y flujo uniaxial de alta magnitud (HMUF, o flujo supuestamente ateroprotector) en el borde de los pozos de una placa de 6 pozos. Por ejemplo, la tensión de cizalladura de pared promediada en el tiempo (TAWSS) es de aproximadamente 0,3 Pa en el centro y de 0,7 Pa en el borde de una placa de 6 pozos arremolinada a 150 rpm con un radio orbital de 5 mmde 13. El método requiere sólo utensilios de plástico disponibles comercialmente y la coctelera orbital en sí.
Hay, sin embargo, un inconveniente en el método (y en otros métodos de imposición de flujos in vitro): los CE liberan mediadores solubles y micropartículas de manera dependiente del cizallamiento14,15,16 y este secretoma puede afectar a los CE en regiones del pozo distintas de aquella en la que se liberaron, debido a la mezcla en el medio girante. Esto puede enmascarar los efectos reales de la tensión del esquilés sobre fenotipo de la EC. Por ejemplo, Ghim et al. han especulado que esto explica la influencia aparentemente idéntica de diferentes perfiles de cizalladura en el transporte transcelular de partículas grandes17.
Aquí se describe un método para promover la adhesión de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en regiones específicas de una placa de 6 pozos utilizando recubrimiento de fibronectina durante el uso de Pluronic F-127 para pasivar la superficie y prevenir el crecimiento en otros lugares. El método resuelve la limitación descrita anteriormente porque, al segmentar el crecimiento celular, los CE experimentan solo un tipo de perfil de cizallamiento, y no están influenciados por secretomas de CE expuestos a otros perfiles en otras partes del pozo.

<table><tbody><tr><td>Cell and Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Growth Medium (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>cc-3162</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Aisladas de cordones obtenidos de donantes con trabajo de parto sin complicaciones en el Hospital</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Hammersmith<tr><td><fuerte>Reactivos y materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fuor 488 etiquetada cabra anti-conejo IgG Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-50G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom No Tratado&nbsp;</td><td>Suministros de laboratorio científico Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>351146</tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>TNF-A humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Filamento de impresora 3D RS Pro 2,85 mm Negro, 1 kg</td><td>RS</td><td>832-0264</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable 316</td><td>Metal Supermercado</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Farnell</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) anticuerpo</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>13663</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (5mM)</td><td>Bio Status</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>SHA7930</tr><tr><td>Microscopio confocal Leica TCS SP5</td><td></td><td></td> Alicates de anillo de retención Leica NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Misumi</td><td>RTWP32-58</td><td></td></tr><tr><td>Anillos de retención/internos/tipo C</td><td>Misumi</td><td>RTWS35</td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2+3-D</td><td>impresora Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cura 2.6.2</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016</td><td>Dassault Systèmes</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentación del crecimiento de las células endoteliales en placas de 6 pozos en una coctelera orbital para estudios mecanobiológicos

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

La tensión del esquileo impuesta en la pared arterial por el flujo de sangre afecta a morfología y a la función endoteliales de la célula. Las tensiones de esquileo de baja magnitud, oscilatorias y multidireccionales se han postulado para estimular un fenotipo favorable-aterosclerótico en células endoteliales, mientras que la alta magnitud y el esquileo unidireccional o uniaxial se piensan para promover homeostasis endotelial. Estas hipótesis requieren la posterior investigación, pero las técnicas ines vitro tradicionales tienen limitaciones, y son particularmente pobres en la imposición de tensiones multidireccionales del esquilamiento en células. 
Un método que está ganando uso cada vez mayor es cultivar células endoteliales en placas estándar de múltiples pozos en la plataforma de una coctelera orbital; en este método simple, de bajo costo, de alto rendimiento y crónico, el medio de remolino produce diferentes patrones y magnitudes de cizallamiento, incluida la cizalladura multidireccional, en diferentes partes del pozo. Sin embargo, tiene una limitación significativa: las células de una región, expuestas a un tipo de flujo, pueden liberar mediadores en el medio que afectan a las células en otras partes del pozo, expuestas a diferentes flujos, distorsionando así la relación aparente entre el flujo y el fenotipo. 
Aquí presentamos una modificación fácil y asequible del método que permite que las células se expongan sólo a características específicas de esfuerzo de cizalladura. La siembra celular se restringe a una región definida del pozo mediante el recubrimiento de la región de interés con fibronectina, seguida de pasivación con solución pasivante. Posteriormente, las placas se pueden arremolinar en el agitador, lo que resulta en la exposición de las células a perfiles de cizallamiento bien definidos, como la cizalladura multidireccional de baja magnitud o la cizalladura uniaxial de alta magnitud, dependiendo de su ubicación. Como antes, el uso de plastificaciones estándar de cultivo celular permite un análisis adicional directo de las células. La modificación ya ha permitido la demostración de mediadores solubles, liberados del endotelio bajo características definidas de esfuerzo de cizalladura, que afectan a las células ubicadas en otras partes del pozo.

La adherencia de HUVECs a las regiones de la placa bien no revestida con fibronectin fue abrogada por la pasivación plurónica F-127; el crecimiento se limitó a la región recubierta de fibronectina incluso después de 72 h de cultivo, con y sin aplicación de esfuerzo de cizalladura(Figura 4A, Figura 4C). Sin la pasivación Pluronic F-127, los HUVECs se unieron a la superficie sin fibronectina y habían proliferado aún más por 72 h de...

Este protocolo describe un método de recubrimiento para restringir el crecimiento de células endoteliales a una región específica de una placa de 6 pozos para la aplicación de esfuerzo de cizalladura utilizando el modelo de agitador orbital.

Segmentación Del Crecimiento De Las Células Endoteliales En Placas De 6 Pozos En Una Coctelera Orbital Para Estudios Mecanobiológicos

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Este protocolo describe un método de recubrimiento para restringir el crecimiento de células endoteliales a una región específica de una placa de 6 pozos para la aplicación de estrés pura utilizando el modelo de agitador orbital. Una forma común de estudiar los efectos del flujo sobre el endotelio es cultivar células endoteliales en placas de cultivo de múltiples pozos en un agitador orbital. La coctelera orbital induce una onda que gira alrededor del pozo.Las células en el centro del pozo experimentan la clase de flujos que se piensan para llevar a la ateroesclerosis. Las células más cercanas al borde experimentan un flujo que se cree que es protector. Se supone que las propiedades de las células en cada región dependen de las tensiones que experimentan.Sin embargo, hay un piso potencial en esta lógica. Las células endoteliales liberan mediadores de forma dependiente del flujo. Estos mediadores alcanzarán una concentración uniforme en el medio arremolinado y, por lo tanto, afectarán a las células en regiones distintas de aquella en la que fueron liberadas.Eso puede corromper u ocultar los verdaderos efectos de la cizalladura en el comportamiento celular. El efecto no se limita al sistema de pozos girando. Puede ocurrir incluso en modelos simples, como la cámara de flujo de placa paralela.Se puede evitar mediante el cultivo de células en una sola parte del sistema. Aquí, describimos métodos para permitir la adhesión celular sólo en el centro o sólo en el borde del pozo arremolinado. Fabricación de módulo de acero inoxidable.Fabrique el módulo de acero inoxidable de un acero inoxidable de grado 316 de acuerdo con un dibujo de ingeniería proporcionado. Impresión 3D en PDP. Prepare un modelo CAD 3D de molde de PDMs utilizando SOLIDWORKS de acuerdo con el dibujo de ingeniería proporcionado.Exporte el modelo CAD a un archivo STL e importe el archivo STL en Cura 2.6.2. Divida el modelo en capas con una velocidad de impresión de 50 milímetros por segundo y una densidad de relleno del 60% Exporte el archivo como un GCode. Lo subió a una impresora 3D Ultimaker para imprimir.Utilice ácido poliláctico como material de impresión. Fundición del anillo PDMS. Mezcle bien la base de PDMS y el agente de curado con la proporción de 90.9% base y 9.1% agente de curado.Vierta la solución bien mezclada en el molde impreso en 3D. Retire las burbujas en una cámara de desgasificación al vacío. Curarlo durante una hora en un horno de 80 grados.Deje que el anillo PDMS se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, retire el anillo PDMS curado cuidadosamente del molde. Preparación del 1%Pluronic F-127.Pesa cinco gramos de Pluronic F-127. Vierta en una botella de vidrio. Luego agregue cien mil de agua Milli-Q en la botella de vidrio.Esto da una solución 5%Pluronic F-127. Asegúrese de que todo el polvo Pluronic F-127 esté sumergido en el agua. Cierre la tapa y autoclave usando un programa de ciclo de esterilización líquida.Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso. Agregue 10 mil de solución 5% Pluronic F-127 a 40 mil de agua Milli-Q en autoclave para hacer una solución 1% Pluronic F-127. Realice la dilución en una campana del gabinete de bioseguridad.Guarde tanto 1% como 5% Pluronic F-127 a temperatura ambiente. Recubrimiento de placa de 6 pozos. Módulo de acero inoxidable en autoclave, anillo PDMS y pinzas antes de su uso.Realice todos los procedimientos subsecuentes en una capilla de BSC y observe técnicas asépticas para asegurar esterilidad. Coloque el anillo PDMS en un pozo de 6 pozos con pinzas. Utilice el borde externo del anillo PDMS para alinear el anillo PDMS de forma concéntrica dentro del pozo.Tenga en cuenta que solo se deben usar placas de pozos no tratadas con tejidos. Coloque el módulo de acero inoxidable en la parte superior del anillo PDMS usando pinzas. Inserte las puntas de los alicates internos del anillo de retención en las bodegas de agarre del anillo de retención.Apriete el soporte para reducir el diámetro del anillo de retención. Colómelo en el pozo de 6, presione firmemente en el módulo de acero inoxidable y suelte los alicates para asegurar el anillo PDMS en el pozo. Agregue una mil de cinco microgramos por microlitro de fibronectina en el centro o el borde del pozo, dependiendo de la región de interés, a través de la apertura del anillo PDMS y el módulo de acero inoxidable.Gire la placa para asegurarse de que la solución de fibronectina cubra toda la región de interés. Incubar durante 30 minutos a 37 grados en una incubadora humidificada bajo 95% de aire y 5% de CO2. Retire la solución de fibronectina del pozo.Y ahora lavar dos veces con PBS. Una vez hecho esto, retire completamente el PBS del pozo. Retire el anillo de retención, el módulo de acero inoxidable y el anillo PDMS del pozo.Agregue 1.5 mil de 1% Pluronic F-127 en el pozo e incube durante una hora a temperatura ambiente para pasivar la superficie sin recubrimiento. Retire la solución Pluronic F-127 del pozo y lave tres veces con PBS. Una vez lavado, use el pozo recubierto inmediatamente o guárdelo a cuatro grados durante un hasta dos semanas con la capa de PBS en el pozo recubierto.Siembra de células endoteliales. Cuente las células usando un hemocytometer y la semilla 180, 000 células en una placa revestida 6-well en 1,5 mil del medio de cultivo celular pre-caliente. Agite la placa del pozo lateralmente para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente en el pozo.Déjelo en una incubadora humidificada de 37 grados bajo un 95% de aire y un 5% de CO2 durante la noche. Aplicación de esfuerzo de cizalladura utilizando un agitador orbital. Las células deben alcanzar la confluencia después de tres días de crecimiento.Reemplace el medio con 1.9 mil de medio de cultivo celular de pre-advertencia para lograr una altura de dos milímetros. Coloque una placa de pozo en la plataforma de una coctelera orbital en una incubadora humidificada y gire a 150 RPM durante tres días. Opcional, después de dos días de cizallamiento, las citoquinas se pueden agregar al medio de cultivo celular para investigar la interacción entre las citoquinas y el estrés.Después del tratamiento, cizalla las células para otro día. En este estudio, la TNF-alfa fue utilizada para activar las células. Realice el análisis después de tres días de aplicación de la tensión del esquilo.Las imágenes del microscopio demuestran que Pluronic F-127 previno la adherencia de HUVEC a la región sin la capa del fibronectin. No se adjuntó NINGÚN HUVECs a la parte de la superficie del pozo que no había sido pretratada con fibronectina antes de la pasivación del Pluronic F-127 después de 24 horas, en la figura A, y 72 horas, en la figura C, de crecimiento. Sin la pasivación Pluronic F-127, los HUVECs se unieron a la superficie sin fibronectina, 24 horas después de la siembra, en la figura B, y proliferan aún más en 72 horas, en la figura D.La barra de escala es igual a 500 micrómetros.La mancha roja nuclear muestra la morfología de huvecs cizallados, A, en el centro, y B, en el borde de un pozo lleno. La barra de escala es igual a cien micrómetros. A y B también muestran contornos celulares delineados por inmunostaining de ZO-1.Tenga en cuenta la alineación y elongación de las celdas en el borde, pero no en el centro. No muestra ninguna diferencia significativa en el índice de forma nuclear, lo que indica redodez, entre los HUVECs crecidos en pleno pozo y los pozos segmentados se observaron para huvecs no tratados o TNF-alfa-tratados. Las células eran más alargadas cerca del borde del pozo.Una tendencia para un mayor alargamiento en HUVECs TNF-alfa-tratado no era constantemente significativa a través de localizaciones. No se observó ninguna diferencia significativa entre los pozos llenos y segmentados en número de la densidad de A, no tratado, y de B, TNF-alfa-tratado HUVECs en diversas localizaciones radiales. En ambos casos, había más celdas por unidad de área en el borde que en el centro del pozo.En conclusión, el método que hemos descrito aquí le permite cultivar células en una sola región del pozo de remolino o, de hecho, de cualquier sistema de cultivo celular a base de plástico. Eso significa que las células en una parte del pozo que experimentan un tipo de flujo no están influenciadas por mediadores liberados de células en otra región que experimentan diferentes flujos. No solo eso, podemos observar las células cultivadas en una región con o sin células que se cultivan en otras regiones.Eso permite demostrar los efectos de tales mediadores solubles. Probar los efectos del medio condicionado en células ingenuas permite lo mismo. Mediante el análisis del medio de condición, los mediadores pueden ser identificados.

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Bioingeniería

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Segmentación Del Crecimiento De Las Células Endoteliales En Placas De 6 Pozos En Una Coctelera Orbital Para Estudios Mecanobiológicos

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