Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas

La visión actual de la organización lateral de la membrana plasmática sigue siendo incompleta. Por esta razón, es importante implementar algunas técnicas nuevas e innovadoras, como la espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual. Esta es una técnica muy poderosa que se caracteriza por una excelente resolución temporal y espacial.

Además, no es invasivo y permite estudiar las membranas celulares en condiciones fisiológicas. Cada día, antes de realizar un experimento, abra todos los diafragmas del iris y use un medidor de potencia para medir la potencia del láser con el primer iris completamente abierto. Gire la placa intermedia para ubicar la potencia máxima.

Si la potencia del láser es inferior a la habitual, utilice los iris para comprobar la alineación y mueva alternativamente L1 y M1 según sea necesario. A continuación, anote el valor de energía en un cuaderno de laboratorio. Para comprobar la ruta de detección, coloque agua, un cubreobjetos y una gota de dos nanomolares de solución de rodamina 6G sobre el objetivo.

A continuación, inicie el software del correlacionador y registre los datos. La función de correlación automática debe mostrar una baja cantidad de ruido, un tamaño de residuo pequeño y una alta tasa de recuento por molécula por segundo. Para calibrar el tamaño del punto, coloque un cubreobjetos codificado para cultivos celulares en el objetivo de inmersión en agua y añada 200 microlitros de dos nanomolares de solución de rodamina 6G al cubreobjetos.

Ajuste la potencia del rayo láser de 488 nanómetros a 300 microvatios y, en el software, seleccione el puerto del microscopio de detección de iluminación svFCS. Encienda el APD y abra el iris hasta que caiga una señal para obtener el tamaño mínimo de residuo o ciérrelo para un residuo de mayor tamaño. Registre alrededor de 10 funciones de correlación automática de 20 segundos para mejorar la reproducibilidad estadística y apagar el APD.

En un programa de análisis de datos adecuado, verifique y descarte las corridas con fuertes fluctuaciones debidas a agregados moleculares, luego ajuste el promedio de la función de autocorrelación retenida con un modelo de difusión 3D, extraiga el tiempo promedio de difusión de los parámetros de ajuste y guarde los datos como un archivo TXT. Para el análisis svFCS, ajuste el haz de 488 nanómetros alimentado entre dos y cuatro microvatios y equilibre las muestras durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Seleccione el puerto del microscopio de detección de iluminación svFCS y en el APD.

A continuación, realice un escaneo XY y un escaneo Z de la celda seleccionada. Seleccione la membrana plasmática en la parte superior de la célula para localizar el punto confocal a la máxima intensidad de fluorescencia e iniciar la adquisición de datos. En el software del correlador, registre una serie de 20 carreras de cinco segundos.

Después de la última ejecución, apague el APD y descarte cualquier ejecución inesperada como se demuestra. Ajuste la función de autocorrelación promedio con un modelo de difusión 2D de dos especies y guarde los parámetros de ajuste en el archivo TXT guardado anteriormente. Cuando se hayan registrado todas las células de interés, analice al menos cuatro tamaños de residuos que varíen entre 200 y 400 nanómetros para establecer una única ley de difusión.

A continuación, en MATLAB, seleccione una carpeta que contenga todos los archivos TXT correspondientes a al menos cuatro experimentos de tamaño de residuo y represente el tiempo de difusión frente al residuo cuadrado. En esta figura, se puede observar una ley de difusión para Thy1-GFP expresado en células Cos7. La ley de difusión tiene un valor positivo de tiempo cero, lo que indica que el Thy1-GFP está confinado dentro de las estructuras de nanodominio de la membrana plasmática.

En este análisis, el tratamiento con colesterol oxidasa de las células que expresan Thy1-GFP resultó en el cambio del valor del tiempo cero de la ley de difusión a 7,36 más o menos 1,34 milisegundos. Confirmando que la naturaleza del confinamiento por Thy1-GFP depende del contenido de colesterol y se asocia con nanodominios de balsa lipídica. También se observó una disminución pequeña pero significativa en el contenido de colesterol total tras el tratamiento con colesterol oxidasa.

Dado que esta enzima actúa solo sobre la reserva de colesterol accesible en la valva externa de la membrana plasmática, estos datos sugieren que la disminución observada en el colesterol se asocia solo con la membrana plasmática y causa la desestabilización de los nanodominios de la balsa lipídica. Lo más importante al intentar este procedimiento es la calibración adecuada del sistema svFCS y la preparación de las celdas para el análisis. svFCS es una excelente herramienta para estudiar la organización de las membranas celulares.

Sin embargo, también se puede utilizar para analizar la difusión de moléculas intracelulares. Esta técnica se puede implementar con éxito en biomedicina con el fin de determinar la influencia de los potenciales fármacos en las células vivas como las células cancerosas.