Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas
12 de noviembre de 2020
Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo sobre cómo construir un microscopio de espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual (svFCS) para medir la difusión molecular en la membrana plasmática de las células vivas.
La visión actual de la organización lateral de la membrana plasmática sigue siendo incompleta. Por esta razón, es importante implementar algunas técnicas nuevas e innovadoras, como la espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual. Esta es una técnica muy poderosa que se caracteriza por una excelente resolución temporal y espacial.
Además, no es invasivo y permite estudiar las membranas celulares en condiciones fisiológicas. Cada día, antes de realizar un experimento, abra todos los diafragmas del iris y use un medidor de potencia para medir la potencia del láser con el primer iris completamente abierto. Gire la placa intermedia para ubicar la potencia máxima.
Si la potencia del láser es inferior a la habitual, utilice los iris para comprobar la alineación y mueva alternativamente L1 y M1 según sea necesario. A continuación, anote el valor de energía en un cuaderno de laboratorio. Para comprobar la ruta de detección, coloque agua, un cubreobjetos y una gota de dos nanomolares de solución de rodamina 6G sobre el objetivo.
A continuación, inicie el software del correlacionador y registre los datos. La función de correlación automática debe mostrar una baja cantidad de ruido, un tamaño de residuo pequeño y una alta tasa de recuento por molécula por segundo. Para calibrar el tamaño del punto, coloque un cubreobjetos codificado para cultivos celulares en el objetivo de inmersión en agua y añada 200 microlitros de dos nanomolares de solución de rodamina 6G al cubreobjetos.
Ajuste la potencia del rayo láser de 488 nanómetros a 300 microvatios y, en el software, seleccione el puerto del microscopio de detección de iluminación svFCS. Encienda el APD y abra el iris hasta que caiga una señal para obtener el tamaño mínimo de residuo o ciérrelo para un residuo de mayor tamaño. Registre alrededor de 10 funciones de correlación automática de 20 segundos para mejorar la reproducibilidad estadística y apagar el APD.
En un programa de análisis de datos adecuado, verifique y descarte las corridas con fuertes fluctuaciones debidas a agregados moleculares, luego ajuste el promedio de la función de autocorrelación retenida con un modelo de difusión 3D, extraiga el tiempo promedio de difusión de los parámetros de ajuste y guarde los datos como un archivo TXT. Para el análisis svFCS, ajuste el haz de 488 nanómetros alimentado entre dos y cuatro microvatios y equilibre las muestras durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Seleccione el puerto del microscopio de detección de iluminación svFCS y en el APD.
A continuación, realice un escaneo XY y un escaneo Z de la celda seleccionada. Seleccione la membrana plasmática en la parte superior de la célula para localizar el punto confocal a la máxima intensidad de fluorescencia e iniciar la adquisición de datos. En el software del correlador, registre una serie de 20 carreras de cinco segundos.
Después de la última ejecución, apague el APD y descarte cualquier ejecución inesperada como se demuestra. Ajuste la función de autocorrelación promedio con un modelo de difusión 2D de dos especies y guarde los parámetros de ajuste en el archivo TXT guardado anteriormente. Cuando se hayan registrado todas las células de interés, analice al menos cuatro tamaños de residuos que varíen entre 200 y 400 nanómetros para establecer una única ley de difusión.
A continuación, en MATLAB, seleccione una carpeta que contenga todos los archivos TXT correspondientes a al menos cuatro experimentos de tamaño de residuo y represente el tiempo de difusión frente al residuo cuadrado. En esta figura, se puede observar una ley de difusión para Thy1-GFP expresado en células Cos7. La ley de difusión tiene un valor positivo de tiempo cero, lo que indica que el Thy1-GFP está confinado dentro de las estructuras de nanodominio de la membrana plasmática.
En este análisis, el tratamiento con colesterol oxidasa de las células que expresan Thy1-GFP resultó en el cambio del valor del tiempo cero de la ley de difusión a 7,36 más o menos 1,34 milisegundos. Confirmando que la naturaleza del confinamiento por Thy1-GFP depende del contenido de colesterol y se asocia con nanodominios de balsa lipídica. También se observó una disminución pequeña pero significativa en el contenido de colesterol total tras el tratamiento con colesterol oxidasa.
Dado que esta enzima actúa solo sobre la reserva de colesterol accesible en la valva externa de la membrana plasmática, estos datos sugieren que la disminución observada en el colesterol se asocia solo con la membrana plasmática y causa la desestabilización de los nanodominios de la balsa lipídica. Lo más importante al intentar este procedimiento es la calibración adecuada del sistema svFCS y la preparación de las celdas para el análisis. svFCS es una excelente herramienta para estudiar la organización de las membranas celulares.
Sin embargo, también se puede utilizar para analizar la difusión de moléculas intracelulares. Esta técnica se puede implementar con éxito en biomedicina con el fin de determinar la influencia de los potenciales fármacos en las células vivas como las células cancerosas.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para construir un microscopio de espectroscopía de correlación de fluorescencia con variación de punto (svFCS) para medir la difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas. La técnica ofrece una excelente resolución temporal y espacial, a la vez que es no invasiva.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- La organización lateral de la membrana plasmática no se comprende completamente.
- Se necesitan técnicas innovadoras como la svFCS para obtener mejores conocimientos.
- La svFCS permite estudiar las membranas celulares en condiciones fisiológicas.
- Una calibración adecuada y la preparación correcta de las células son cruciales para obtener resultados precisos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para microscopía svFCS.
- Medir la difusión molecular en la membrana plasmática.
- Analizar la influencia del colesterol en la organización de la membrana.
Métodos Utilizados
- Calibración del sistema svFCS utilizando una solución de rodamina 6G.
- Adquisición de datos mediante escaneos XY y Z de células seleccionadas.
- Análisis de las leyes de difusión utilizando MATLAB.
- Comparación de los parámetros de difusión antes y después del tratamiento con colesterol oxidasa.
Resultados principales
- La difusión de Thy1-GFP está confinada dentro de estructuras de nano dominios.
- El tratamiento con colesterol oxidasa modifica el valor del tiempo cero de la ley de difusión.
- Se observó una disminución en el contenido total de colesterol.
- El estudio sugiere que el colesterol influye en la estabilidad de las balsas lipídicas.
Conclusiones
- La svFCS es efectiva para estudiar la organización de la membrana celular.
- La técnica también puede analizar la difusión de moléculas intracelulares.
- Los hallazgos tienen implicaciones para comprender los efectos de fármacos en células vivas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectroscopía de correlación de fluorescencia con variación de puntos (svFCS) permite un análisis de alta resolución de la difusión molecular en la membrana plasmática bajo condiciones fisiológicas, proporcionando información esencial sobre la organización de la membrana y la dinámica de las balsas lipídicas. Esta capacidad apoya la validación de objetivos al elucidar el contexto biofísico de las proteínas asociadas a la membrana, aportando datos para la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. La naturaleza no invasiva del método y su compatibilidad con células vivas aumentan su utilidad en cribados preclínicos y estudios traslacionales de biomarcadores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del comportamiento de difusión de proteínas de membrana como Thy1-GFP dentro de estructuras de nanodominios.
- Valor operativo: Revela el confinamiento dependiente del colesterol, permitiendo la validación funcional de las asociaciones con balsas lipídicas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar dianas cuya localización en la membrana es sensible a perturbaciones del entorno lipídico.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos mediante el establecimiento de leyes de difusión basales bajo condiciones fisiológicas.
- Resultado cuantitativo: Genera mediciones reproducibles del tiempo de difusión en diferentes tamaños de cintura del haz, lo que apoya la estandarización del ensayo.
- Relevancia para cribado: Detecta cambios inducidos por compuestos en los parámetros de difusión, indicando alteraciones en la organización de la membrana o en la interacción con el blanco.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la alteración de nanodominios en el dominio de la membrana plasmática, relevante para patologías que implican disrupción de lípidos.
- Continuidad traslacional: Conecta observaciones de descubrimiento temprano con validación preclínica al demostrar cómo las perturbaciones ambientales (por ejemplo, modulación del colesterol) alteran el comportamiento del blanco.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona lecturas mecanicistas que informan criterios de avance/no avance basados en la resistencia del blanco frente a perturbaciones de la membrana.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
svFCS se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, ofreciendo una capa biofísica de caracterización que complementa los ensayos bioquímicos y fenotípicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de coeficientes de difusión e identificación de poblaciones moleculares confinadas frente a móviles.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante calibración estandarizada usando rodamina 6G y validación de la integridad del camino de detección.
- Análisis: Proporciona leyes cuantitativas de difusión mediante el análisis en MATLAB de funciones de autocorrelación, permitiendo la comparación del comportamiento molecular en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona los cambios en la organización de membranas con resultados funcionales, apoyando la alineación de biomarcadores cuando los cambios en la difusión se correlacionan con respuestas fenotípicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar la dinámica de proteínas de membrana en múltiples objetivos y líneas celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al resolver la confinamiento a escala nanométrica y la heterogeneidad de la difusión en la membrana plasmática.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la calibración estandarizada de la potencia del láser, verificaciones del camino de detección y promedio de funciones de autocorrelación replicadas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al cuantificar la estabilidad del blanco en entornos de membrana similares a los nativos, reduciendo el descarte tardío debido a limitaciones biofísicas imprevistas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos según su dependencia de la integridad de las balsas lipídicas para su correcta localización y función.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia, seguridad con láser y análisis de datos de espectroscopía de correlación.
- Necesita un microscopio de fluorescencia personalizado con fotodiodos de avalancha (APD), software correlador y control preciso de la potencia del láser (2–4 µW para mediciones de svFCS).
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de calibración (por ejemplo, validación del tamaño del punto de rodamina 6G) y de las tuberías de análisis de datos (por ejemplo, ajuste en MATLAB de modelos de difusión 2D).
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes proteínas de membrana, tipos celulares y agentes de perturbación distintos a la colesterol oxidasa.
- Está limitado por la necesidad de una preparación cuidadosa de las muestras para evitar agregados moleculares y garantizar la relevancia fisiológica durante la equilibración a 37°C.
