Un biorreactor multipíca para evaluar la capacidad inflamatoria y regenerativa de los biomateriales bajo flujo y estiramiento

Hasta ahora, ha sido realmente difícil identificar las relaciones de causa y efecto entre la hemodinamia y la regeneración del tejido vascular. Y esto se debe a que es un desafío controlar las cargas mecánicas individuales. Este biorreactor nos permite investigar mecánicamente los efectos individuales y combinados del estrés puro y el estiramiento cíclico en el potencial regenerativo de una amplia variedad de injertos vasculares de ingeniería tisular.

La comprobante de este procedimiento será Suzanne Koch, doctoranda de nuestro grupo. Y la Dra. Tamar Wissing, que es investigadora postdoctoral de nuestro laboratorio. Para montar el andamio electrohilado en el tubo de silicona, enrosque una sutura de prolene 4-0 en un extremo de un trozo de tubo de silicona y sáquelo del otro.

Haz un pequeño nudo a ambos lados del tubo dejando aproximadamente 10 centímetros de alambre en ambos nudos y haz un tercer nudo encima de los dos. Después de quitar una aguja de sutura, recorte los bordes del tubo de silicona en forma triangular y haga un nudo final al final de los dos cables de 10 centímetros. Sumerja el andamio electrohilado en etanol al 30% y coloque el andamio sobre un extremo del cable de sutura libre.

A continuación, estire suavemente ambos lados del tubo de silicona y el nudo de sutura de 10 centímetros mientras el segundo investigador utiliza pinzas con una punta interior lisa para deslizar suavemente el andamio electrohilado sobre el tubo. Suelte lentamente el estiramiento del tubo de silicona mientras alisa simultáneamente el andamio electrohilado con las pinzas. Y sumerja el andamio y el tubo de silicona en agua ultrapura dos veces.

Construya el compartimento inferior y asegúrese de que la junta tórica esté colocada correctamente. Coloque un casquillo adaptador en la parte superior del compartimento inferior y coloque el conducto de presión con orificios a través del compartimento inferior. Ata la junta tórica de silicona alrededor del extremo inferior del conducto de presión para evitar fugas.

Y atornille la parte inferior del compartimento inferior a la parte superior del compartimento inferior para asegurar el conducto de presión. Asegúrese de que la ranura inferior grabada del conducto de presión esté aproximadamente de tres a cinco milímetros por encima del borde del casquillo del adaptador del compartimento inferior. Tire del tubo de silicona con el andamio electrohilado sobre el conducto de presión y haga un movimiento de cabeza y el alambre de sutura en el extremo inferior del andamio electrohilado, en la ubicación de la ranura grabada en el conducto de presión.

Haga un segundo movimiento de cabeza en el lado opuesto para asegurar firmemente el tubo de silicona con el injerto electrohilado. Y colocando una pinza de tijera equipada con una regla en el extremo superior del tubo de silicona, tire de la pinza de tijera hacia arriba de manera consistente y tire suavemente del andamio de desove eléctrico para eliminar las arrugas. Use un alambre de sutura para hacer dos nudos en ambos extremos del andamio en la ranura superior grabada del conducto de presión.

Cuando se hayan hecho ambos nudos, suelte la abrazadera de tijera y use un cuchillo para eliminar el exceso de tubo de silicona. Atornille los conos de punta en la rosca del tornillo de los conductos de presión para las muestras que se cargarán dinámicamente. Sumerja el conducto de presión, la tubería y el andamio una vez en etanol al 30% y dos veces en agua ultrapura para humedecer previamente la instalación.

Coloque el tubo de vidrio sobre el conducto de presión y empuje suavemente el compartimento inferior para asegurar el tubo de vidrio en su lugar. A continuación, coloque el enderezador de flujo, una junta tórica de silicona y el casquillo adaptador en el compartimento superior. Y asegure el compartimento sobre el extremo abierto del tubo de vidrio.

Retire el tapón de señuelo macho de la salida de flujo, trabaje en una cabina de flujo laminar estéril. Abra la tapa blanca del señuelo y coloque un pañuelo de papel de remojo de etanol frente a la salida de flujo. Deconstruya la cámara de cultivo de flujo quitando el tubo de vidrio con el compartimento superior.

Coloque un tubo de pasto al vacío en el andamio electrohilado para eliminar la mayor cantidad de medio posible. Y agregue la solución de fibrinógeno en una proporción de uno a uno con la suspensión celular suplementada con trombina. Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo una vez e inmediatamente gotee la solución sobre toda la longitud del andamio.

Cuando se hayan entregado todas las celdas, mueva lentamente el andamio de izquierda a derecha y de arriba a abajo para lograr una distribución uniforme de las celdas. Cuando se hayan sembrado ambos lados del andamio, reconstruya cuidadosamente la cámara de cultivo de flujo volviendo a colocar el tubo de vidrio y el compartimento superior. Y coloque la cámara de cultivo de flujo en la incubadora para que la fibra se solidifique.

Para acoplar el biorreactor al sistema de bombeo, coloque la cámara de cultivo de flujo en una de las ocho roscas de tornillo en la base del biorreactor. Y coloque un clip anfitrión en el tubo mediano. Retire la tapa blanca del señuelo, cubriendo la entrada de flujo del compartimiento superior de la cámara de cultivo de flujo y retire el acoplador de señuelo hembra del tubo mediano.

Conecte el tubo mediano con un lado de la entrada de flujo en el compartimiento superior. Y el otro lado con la salida de flujo en el compartimento inferior. Transfiera la configuración completa de la cabina de flujo laminar a la incubadora.

Y conecte una unidad de fluidos y la base del biorreactor a la tubería de presión de aire y al cable eléctrico. Inicie el software e inicialice las bombas. Inicie el flujo de medio para las muestras una por una.

A continuación, cambie los parámetros de la bomba de deformación a los ajustes deseados e inicie la deformación. Controle el estiramiento aplicado al andamio cada dos días. El monitoreo de la tensión de estiramiento y corte de la pared durante períodos de cultivo a largo plazo muestra que estos valores se pueden mantener en niveles relativamente constantes durante un período de hasta 20 días.

Después de tres días de carga hemodinámica, la tinción inmunofluorescente revela una distribución homogénea de macrófagos y miofibroblastos derivados de monocitos en todo el andamio. Después de 20 días de cocultivo, el estiramiento cíclico da como resultado la deposición de fibras de colágeno tipo 1 más numerosas y gruesas. Mientras que en el grupo de carga hemodinámica combinada, el efecto de estiramiento cíclico es anulado por el estrés puro, lo que resulta en una deposición de colágeno tipo 1 menos pronunciada.

Después de ocho días de monocultivo de macrófagos, se observa erosión y escisión de fibras en todos los regímenes de carga hemodinámica, con la reabsorción más pronunciada en el grupo estático y la reabsorción menos pronunciada en el grupo de estrés puro. Tanto el estiramiento cíclico como la tensión pura afectan el perfil de secreción de citocinas de la configuración de cocultivo. Curiosamente, los efectos combinados de ambas cargas muestran el dominio de una de las dos cargas o los efectos sinérgicos de ambas cargas.

Los experimentos de cocultivo también muestran que el entorno mecánico y los entornos inflamatorios dependientes de la carga resultante modulan el fenotipo de los miofibroblastos. Además, los patrones de expresión génica de la actina del marcador contráctil alfa del músculo liso se correlacionan con la síntesis de proteínas. Lo más importante a la hora de realizar este protocolo es que la aplicación de estiramiento, es fundamental que tu configuración esté libre de fugas.