Purificación de tubulina con modificaciones posttranslacionales controladas e isotipos de fuentes limitadas por ciclos de polimerización-despolimerización

Este método permite generar tubulina pura competente para el ensamblaje con modificaciones postraduccionales definidas en cantidades suficientes para realizar conjuntos completos de experimentos in vitro. Este protocolo basado en ciclos de polimerización y despolimerización de tubulina es fácil de realizar en cualquier laboratorio de biología celular. Permite generar buenas cantidades de tubulina con muy poco tiempo de manipulación.

Para purificar la tubulina de los cultivos en suspensión, nueve días antes de la preparación de la tubulina, se revive y amplifica el tipo de célula deseado para obtener seis placas confluentes de 15 centímetros. Ocho días antes de la preparación de la tubulina, agregue un litro de medio precalentado a cada botella giratoria por plato debajo de un gabinete de cultivo celular y coloque las hilanderas en una mesa de agitación dentro de la incubadora de cultivo celular. Deje las tapas giratorias laterales ligeramente abiertas para permitir que el medio se equilibre con la atmósfera de la incubadora.

Al día siguiente, usa las células de los platos confluentes para inocular las botellas giratorias. Regrese los biberones giratorios a la incubadora durante una semana con las válvulas laterales ligeramente abiertas. Para recolectar las células, transfiera los cultivos de las botellas giratorias a botellas centrífugas de un litro y recoja las células por centrifugación.

Vuelva a suspender cada pellet en 10 mililitros de PBS helado y agrupe las células resuspendidas en un tubo de 50 mililitros para centrifugarlo a cuatro grados centígrados. Para un pellet de celdas de 10 mililitros, agregue 10 mililitros de tampón de lisis al pellet e invierta el tubo varias veces para volver a suspender las celdas. Para purificar la tubulina de los cultivos celulares adherentes, reviva y amplifique el tipo de célula deseado para obtener 10 placas confluentes de 15 centímetros el día de la preparación de la tubulina.

Para recolectar las células adheridas, tratando tres placas a la vez, incline las placas de cultivo para eliminar el medio mientras una segunda persona lava suavemente las células con siete mililitros de PBS-EDTA. Después del lavado, la segunda persona debe tratar las células con cinco mililitros de PBS-EDTA por plato antes de que una tercera persona use un elevador de células para empujar suavemente las células hacia un borde del plato. Cuando se hayan separado las células, agrupe las células de las tres placas en un tubo de 50 mililitros con hielo y enjuague cada placa con dos mililitros adicionales de PBS-EDTA para recoger las células restantes.

Después de recolectar las células por centrifugación, deseche el sobrenadante para determinar el volumen de la pastilla celular. Agregue el tampón de lisis, vuelva a suspender las células y transfiéralas a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros. Sonicar las células durante aproximadamente 45 pulsos.

Para la lisis del cerebro del ratón, agregue 500 microlitros de tampón con licencia a un solo cerebro extraído de un ratón adulto y use una licuadora de pañuelos para lisar el tejido. Después de obtener el lisado a 1/100 de su volumen a un volumen igual de 2X tampón Laemmli y hervir la solución durante cinco minutos. Guárdelo a menos 20 grados centígrados hasta la cuantificación.

Recoja una muestra de esta manera en cada paso de la preparación de la tubulina. Para clarificar el lisado, centrifugue la muestra y use una aguja larga para transferir cuidadosamente el sobrenadante transparente a un nuevo tubo, teniendo cuidado de evitar la capa superior flotante. Después de la clarificación del lisado, es esencial eliminar el material flotante en el sobrenadante, de lo contrario, podría afectar negativamente la eficiencia de la purificación de la tubulina.

Para polimerizar la tubulina a partir del lisado clarificado, mezcle todo el volumen de sobrenadante con un volumen de 1/200 de GTP molar y medio volumen de glicerol caliente en un tubo de tamaño adecuado. Pipetear suavemente la mezcla, tenga cuidado de evitar introducir burbujas de aire. Selle los tubos con parafilm y colóquelos en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 20 minutos.

Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Para despolimerizar los microtúbulos presentes en el pellet dos, vuelva a suspender el pellet en BRB 80 helado durante cinco minutos sobre hielo. Pipetear la muestra primero con una pipeta P1000, luego con una pipeta P200, cada cinco minutos durante 20 minutos en hielo.

Una vez que la muestra sea homogénea, centrifugarla y transferir el sobrenadante obtenido a un nuevo tubo. Para eliminar las proteínas asociadas a los microtúbulos de la tubulina, mezcle todo el volumen de sobrenadante tres con un volumen igual de tubo molar precalentado S, el mismo volumen de glicerol precalentado y un volumen de 1/100 de GTP molar 0,2. Incubar la mezcla durante 20 minutos a 30 grados centígrados antes de centrifugar.

Transfiera el sobrenadante cuatro que contiene proteínas asociadas a microtúbulos a un nuevo tubo, el pellet contiene microtúbulos polimerizados. Después de realizar una tercera polimerización y despolimerización, la cantidad de tubulina recolectada se puede cuantificar mediante el análisis de página SDS. El éxito del proceso de purificación se puede confirmar en una página SDS teñida de Coomassie.

Un rendimiento inferior al esperado de la tubulina purificada puede deberse a una polimerización ineficiente de la tubulina, como lo demuestra la menor cantidad de tubulina en la segunda, cuarta y sexta fracciones de pellets y una mayor cantidad en la segunda, cuarta y sexta fracciones sobrenadantes. Para cuantificar la tubulina purificada, las muestras se pueden analizar junto a cantidades conocidas de albúmina sérica bovina. La densitometría cuantitativa de las bandas de proteínas permite calcular la cantidad de tubulina purificada.

El estado de modificación de la tubulina puede confirmarse mediante el análisis de inmunotransferencia de las muestras. Nuestro protocolo permite el aislamiento de la tubulina con modificaciones post-traduccionales controladas. Con esta tubulina podemos poner en marcha experimentos de reconstitución in vitro que nos permiten determinar el impacto de las modificaciones de la tubulina en las propiedades de los microtubáricos, así como en sus interacciones con las proteínas asociadas a los microtúbulos.