Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Esta técnica permite a los investigadores alimentarse y realizar por sí solos mediciones de alto rendimiento para comparar los volúmenes de comida consumidos por cientos de mosquitos individuales. Puede ser adaptativo para alterar el contenido de la comida, o para comparar el volumen consumido por diferentes grupos experimentales. Este protocolo tiene como objetivo ser fácil de usar y de bajo costo.

Para manipulaciones farmacológicas y genéticas, para estudiar la alimentación sanguínea de los mosquitos y el comportamiento de alimentación después de una inundación. La organización es fundamental para este protocolo. Prepare la configuración y los reactivos con anticipación, para que pueda entregar rápidamente las comidas a los mosquitos.

Para comenzar, transfiera de 1,98 a dos mililitros de sangre de oveja desfibrinada en un tubo cónico de 15 mililitros. Si realiza una cuantificación basada en fluorescencia del tamaño de la comida, agregue la solución de fluoresceína a una concentración final de 0,002%, reduciendo el volumen de sangre en la misma cantidad que la fluoresceína agregada. Conserve un mililitro de la formulación final de la comida para generar la curva estándar de referencia.

Todas las comidas y soluciones que contengan fluoresceína deben envolverse en papel de aluminio o mantenerse en la oscuridad. Para preparar comidas salinas sin proteínas, combine 600 microlitros de bicarbonato de sodio de 400 milimolares con 1,39 mililitros de agua destilada doble en un tubo cónico de 15 mililitros. Si posteriormente se va a llevar a cabo una cuantificación del tamaño de la harina basada en fluorescencia, se añade una solución de fluoresceína hasta una concentración final del 0,002%Reduciendo el volumen de agua en la misma cantidad que la fluoresceína añadida.

Conserve al menos un mililitro de la formulación final de la comida que contenga 0,002% de fluoresceína para generar la curva estándar de referencia. Deje a un lado las comidas preparadas hasta que esté listo para entregarlas. Todas las comidas y soluciones que contengan fluoresceína deben envolverse en papel de aluminio o mantenerse en la oscuridad.

Coloque el grupo experimental de mosquitos hembra en un recipiente y cúbralos con una malla. Permita que estas hembras se aclimaten en la cámara de alimentación. Reserve un grupo de control de mosquitos no alimentados a los que no se les ofrecerá comida.

Para construir un tubo GLI, llene un tubo cónico de 50 mililitros con 40 mililitros de glicerol al 100%. Selle el tubo cónico abierto con dos piezas de parafilm para minimizar la posibilidad de fugas. Opcionalmente, sujete el parafilm en su lugar con bandas elásticas.

Invierta el tubo para asegurarse de que no haya agujeros ni espacios. Para crear el dispositivo de entrega de comidas, corte un orificio centrado de 2,5 centímetros en el tapón de rosca del tubo cónico con una cuchilla de afeitar afilada o un lave. Estire un trozo de parafilm de manera uniforme para que aproximadamente duplique su tamaño.

El parafilm debe ser lo suficientemente delgado como para que los mosquitos puedan atravesarlo fácilmente, pero no debe haber fugas. Selle la superficie exterior de la tapa de rosca con el parafilm para cubrir completamente el orificio y deje la tapa a un lado. Caliente tanto el tubo sellado de glicerol como la sangre y las comidas salinas y un baño de agua de 42 a 45 grados centígrados durante al menos 15 minutos.

Agregue ATP a la comida caliente y vórtice completamente. Pipetee dos mililitros de la harina calentada en la cámara interior del tapón de rosca y coloque suavemente el tubo cónico invertido lleno de glicerol calentado sobre él. Enrosque parcialmente la tapa con la harina en el tubo lleno de glicerol, lo suficiente para evitar fugas de la harina o del glicerol.

Coloque el tubo gly ensamblado en la parte superior del contenedor para mosquitos, aplique dióxido de carbono y permita que los mosquitos accedan a alimentarse durante al menos 15 minutos para lograr las tasas máximas de alimentación. Después de la alimentación, la tapa del tubo GLI se puede desechar como residuo de riesgo biológico o reutilizar después de remojarla en una solución de lejía de bajo porcentaje y enjuagarla bien con agua. Para generar una curva estándar de referencia, se preparó una dilución seriada de la misma harina que contenía 0,002% de fluoresceína que se ofreció al grupo experimental de mosquitos.

Para hacer la primera solución de la curva estándar, agregue 50 microlitros de harina que contenga 0.002% de fluoresceína a 950 microlitros de PBS y vórtice completamente. Realice diluciones dobles para el resto de las soluciones de curva estándar, vórtice mucho antes de cada dilución. Pipetear 100 microlitros de cada una de las soluciones de curva estándar en cada uno de los ocho pocillos de la primera columna de una placa de PCR de 96 pocillos.

Agregue un mosquito de control anestesiado o congelado sin alimentar a cada uno de los mismos ocho pocillos. Repita en la segunda columna de la placa para obtener una medición repetida. Agregue 100 microlitros de PBS a cada pocillo restante para los grupos de control y experimentales no alimentados.

Como control negativo, agregue un mosquito sin alimentar a cada pocillo en las siguientes dos columnas del plato. Agregue un mosquito por pocillo a los pocillos restantes de los grupos experimentales a los que se les ofreció una comida. Agregue perlas de vidrio sólido de borosilicato de tres milímetros a cada pocillo si altera el tejido con el homogeneizador del molino de cuentas.

Selle la placa con cuidado y rompa el tejido, luego centrifugue la placa a 2000 RPM durante uno o dos minutos para recoger el lisado. Prepare una placa negra de 96 pocillos con 180 microlitros de PBS en cada pocillo. A continuación, añade 20 microlitros de lisado a cada pocillo y mezcla.

Mida la intensidad de la fluoresceína utilizando un lector de placas con los 485 canales de excitación y 520 canales de emisión. Genere la curva estándar de referencia trazando el volumen conocido de harina frente a la medición de intensidad de fluorescencia correspondiente. Utilizando la curva estándar de referencia generada, extrapolar el volumen de comida ingerido por cada uno de los mosquitos del grupo experimental.

Reste la lectura de la intensidad de fluorescencia promedio del grupo de control negativo no alimentado de la lectura de la intensidad de fluorescencia de cada grupo experimental individual para corregir la autofluorescencia tisular basal. Para medir el tamaño de la harina de fluoresceína de un experimento de alimentación con sangre, se generó una curva estándar trazando las lecturas de fluorescencia de los pocillos de referencia designados que contenían un mosquito no alimentado y un volumen conocido de la harina con 0,002% de fluoresceína. Las lecturas de fluorescencia de los pozos restantes que contienen mosquitos del grupo de mosquitos de control negativo no alimentados o del grupo experimental de mosquitos a los que se les ofreció una comida, se comparan con esta curva estándar para cuantificar el volumen de comida consumido.

Aunque a todas las hembras del grupo experimental se les ofreció la comida de sangre, algunos mosquitos se alimentaron y otros no. Este protocolo se puede utilizar para entregar y cuantificar comidas con diversas composiciones de proteínas. Los datos recopilados utilizando comidas con fluoricina añadida se muestran aquí.

También se llevó a cabo un experimento independiente en el que se puntuó a los mosquitos como alimentados o no alimentados a simple vista, después de que se les ofrecieran comidas sin fluoricina. Este protocolo se utilizó para determinar el volumen consumido de comidas con fármacos que regulan el comportamiento de búsqueda de mosquitos hospederos. En estos experimentos, a las hembras se les ofreció comida salina y ATP con un agonista de dos receptores NPY humanos.

Esta técnica también se utilizó para medir el comportamiento de alimentación del néctar, intercambiando el tubo gly por una bola de algodón saturada con 10% de sacarosa que contiene 0,002% de fluoresceína, lo que demuestra que se puede utilizar para medir tamaños de comida más pequeños o más variables que no se pueden discernir con precisión a partir de las mediciones de peso de grupo. Lo más importante a la hora de realizar este protocolo, es organizar las muestras en eventos y reservar los mosquitos no alimentados y un ML de cada comida para generar la curva estándar. Siguiendo este procedimiento, se puede observar el comportamiento de los animales después de la alimentación con sangre y se puede rastrear la digestión.

Este método permite a los investigadores evaluar los cambios en el consumo de comidas en mosquitos modificados genéticamente. También proporciona una forma sencilla, rápida y no invasiva de administrar medicamentos a los mosquitos y probar sus efectos en el comportamiento.