Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Este protocolo para purificar la enzima triptófano sintasa de Salmonella typhimurium es rápido, sencillo y corto. El fraccionamiento de sulfato de amoníaco y la cromatografía de exclusión por tamaño permiten purificar el complejo de triptófano sintasa de tipo salvaje y mutante en un solo día. Esta técnica se puede aplicar para purificar otras proteínas relacionadas, ya que el fraccionamiento de sulfato de amoníaco y la cromatografía de exclusión por tamaño se utilizan comúnmente para purificar proteínas no marcadas.

Para empezar, interrumpa la pellet de la célula mediante sonicación en un baño de agua helada al 80% de amplitud durante 20 ciclos utilizando pulsos de 10 segundos y descansos de 20 segundos. Centrifugar el lisado celular a 30.000 veces g durante 30 minutos a 25 grados centígrados y aspirar el sobrenadante sin desalojar el pellet. Filtrar la fracción sobrenadante clarificada con un filtro de 0,45 micrómetros a temperatura ambiente.

Agregue lentamente pequeñas cantidades de sulfato de amonio al filtrado hasta alcanzar una saturación del 20%. Realizar el fraccionamiento del sulfato de amonio a 25 grados centígrados, y agitar suavemente la solución durante 10 minutos, teniendo cuidado de evitar burbujas. Centrifugue la solución nuevamente durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a un matraz limpio para su uso posterior.

Vuelva a suspender suavemente el pellet en 20 mililitros de tampón de muestra y prepare una muestra para ejecutar SDS-PAGE. Añadir sulfato de amonio al sobrenadante hasta alcanzar el 30% de saturación, y agitar la solución, evitando la formación de burbujas. Centrifugar la solución nuevamente durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a un matraz limpio para su uso posterior.

Vuelva a suspender suavemente la fracción de pellets del 40% obtenida en 10 mililitros de tampón de muestra dos y prepare una muestra para ejecutar SDS-PAGE. A continuación, microcentrifugar la muestra de proteína al 40% a 10.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, y cargar el sobrenadante obtenido en una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR previamente equilibrada conectada a un instrumento de cromatografía líquida rápida de proteínas a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Evalúe las fracciones pico recolectadas y las fracciones de sulfato de amonio en un gel SDS-PAGE al 12% teñido con azul brillante de Coomassie.

Concentre el complejo de triptófano sintasa de Salmonella typhimurium beta-dos de tipo salvaje o mutante alfa-dos con un filtro centrífugo de 100 kilodalton girando a 3.000 veces g, a cuatro grados centígrados. Transfiera la proteína concentrada a un tubo nuevo de dos mililitros y vuelva a centrifugar a 10.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados para eliminar los agregados. Después de determinar la concentración de proteína de la muestra, prepare alícuotas de 0,5 mililitros a razón de 20 a 25 miligramos por mililitro.

Congélelos rápidamente en nitrógeno líquido y guárdelos a menos 80 grados. Prepare una solución madre de cinco mililitros de espermina de 200 milimolares en agua y guárdela en alícuotas de 500 microlitros a menos 20 grados. A continuación, prepare una solución madre de 50 mililitros de polietilenglicol 8.000 al 30% en agua y mantenga 25 mililitros en un matraz cónico de centrífuga desechable de 50 mililitros a 25 grados centígrados.

Prepare soluciones madre de 25 mililitros de cloruro de cesio y cloruro de sodio de un molar, cada una en agua, y manténgalas a 25 grados centígrados. Prepare tres juegos de soluciones madre de 50 mililitros de bicina de un molar y titule con hidróxido de cesio o hidróxido de sodio para obtener soluciones tamponadas a pH 7,6, 7,8 y ocho. Mantenga las alícuotas de 25 mililitros de las soluciones a cuatro grados centígrados.

Descongele una muestra del complejo de triptófano sintasa alfa-dos beta-dos de Salmonella typhimurium en un baño de hielo. A continuación, microcentrífugalo a 10.000 veces g durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Transfiera la fracción sobrenadante clara a un tubo de centrífuga limpio.

Estime la concentración de proteína del sobrenadante y diluya las alícuotas a 15 miligramos por mililitro con hidróxido de cesio bicina de 50 milimolares o hidróxido de sodio bicina de pH 7.8, que contenga cesio o cloruro de sodio de 50 milimolares. Prepare 500 microlitros de soluciones de depósito para tres placas de caída de 24 pocillos en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros. Varíe la concentración de PEG 8, 000 y espermina, y cambie el pH del tampón como se describe en el manuscrito del texto para cada conjunto.

Tape los tubos y agite vigorosamente durante 10 segundos, antes de centrifugarlos a 10.000 veces g durante 10 minutos a 25 grados centígrados para eliminar las burbujas de aire. Dispensar 500 microlitros de esta solución en cada depósito. Dispensar cinco microlitros de solución proteica a 15 microgramos por litro en cada pozo de gota sentada utilizando una micropipeta P-10.

A continuación, añada cinco microlitros de cada solución de depósito correspondiente a la gota de proteína. Evite las burbujas de aire durante la mezcla y no pipetee hacia arriba y hacia abajo. Por último, cubre el plato con cinta adhesiva transparente y guárdalo a 25 grados.

Los cristales aparecen en dos a cinco días y crecen a sus dimensiones completas en dos semanas. Este protocolo se utilizó para subclonar la subunidad alfa y la subunidad beta de la triptófano sintasa de Salmonella typhimurium en el vector SUMO pET modificado. Aquí se muestran los resultados representativos de SDS-PAGE de dos bandas fuertes correspondientes a la proteína de fusión de triptófano sintasa His6-SUMO-alfa e His6-SUMO-beta.

Cada proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad de ácido níquel-nitrilotricacético y precipitación de sulfato de amonio, seguida de la escisión de la etiqueta His-SUMO, la eliminación de las trazas de la etiqueta His-SUMO y la medición de la concentración de proteína. Aquí se muestra el perfil de elución de la subunidad alfa, la subunidad beta y el complejo alfa-dos beta-dos Salmonella typhimurium triptófano sintasa en SEC, y la pureza de sus fracciones máximas. Después de generar formas mutantes del complejo triptófano sintasa, se utilizó el fraccionamiento de sulfato de amonio para eliminar las proteínas contaminantes del sistema de expresión heterólogo.

Aquí se muestra un perfil de elución representativo con una posición de elución relativa del complejo alfa-dos beta-dos Salmonella typhimurium triptófano sintasa en una columna de cromatografía de exclusión. La pureza de las fracciones pico excluidas se analizó mediante SDS-PAGE antes de la agrupación. Los monocristales de gran tamaño se obtuvieron mediante una optimización de la cristalización fina variando las concentraciones de PEG 8.000 y espermina y el pH del tampón de bicina.

Los cristales con diferentes morfologías aparecieron en dos a cinco días y crecieron hasta alcanzar su tamaño completo en dos semanas. La validación de los mapas de densidad electrónica para la estructura cristalina del complejo alfa-dos beta-dos Salmonella typhimurium triptófano sintasa de tipo salvaje se dilucidó después del refinamiento de la estructura cristalina. Al realizar este protocolo, complete los pasos iniciales de purificación a temperatura ambiente lo antes posible para evitar la pérdida de actividad de la triptófano sintasa.

Se prevé que las estructuras cristalinas de los mutantes proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones que desempeñan los residuos clave en la síntesis de L-triptófano.