Inserción co-traduccional de proteínas de membrana en nanodiscos preformados

El protocolo es altamente eficiente y versátil. Se puede aplicar a casi cualquier proteína de membrana y todo el procedimiento de producción se completa en un día. Las proteínas de membrana sintetizadas pueden ser estabilizadas ya co-traduccionalmente por ligandos suministrados.

Se evitan por completo los contactos con el detergente, y las proteínas se insertan y pliegan directamente en los entornos de membrana proporcionados y adaptados. Los enfoques estructurales, la caracterización funcional y la generación de anticuerpos son las principales áreas de aplicación. Además, la técnica es sencilla para analizar los efectos de los lípidos en el plegamiento y la función de las proteínas de membrana.

En el tercer día de cultivo, inocular 10 litros de medio YPTG estéril a 37 grados Celsius en un reactor de tanque agitado de 15 litros con 100 mililitros de precultivo. Y cultivar las bacterias a 37 grados centígrados con 500 revoluciones por minuto en alta aireación. Para evitar el exceso de espuma, agregue antiespumante estéril.

Cuando las células alcancen la fase logarítmica media, se añadan 300 mililitros de etanol al cultivo y se incuben las células a 42 grados centígrados con 500 rotaciones por minuto en alta aireación durante otros 45 minutos. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y use una espátula y una pipeta para resuspender las células por completo en 300 mililitros de tampón S30A. Centrifugar las bacterias resuspendidas dos veces, lavando el pellet con 300 mililitros de S30A fresco por lavado.

Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un volumen de 1,1 tampón S30B. Cargue la suspensión en una celda de presión de prensa francesa preenfriada y rompa las celdas a 1,000 libras por pulgada cuadrada una vez. Para eliminar cualquier componente inestable y liberar el ARNm de los ribosomas, ajuste el lisado a cloruro de sodio de 0,4 molares e incube la muestra durante 45 minutos en un baño de agua a 42 grados centígrados.

Para ensamblar los nanodiscos de proteínas de andamio de membrana, mezcle la solución de MSP1E3D1 con la solución lipídica y agregue DPC hasta una concentración final de 0.1%Ajuste la reacción al volumen final apropiado de acuerdo con la tabla e incube las reacciones durante una hora a 21 grados Celsius bajo agitación suave. Al final de la incubación, humedezca previamente la membrana de un casete de diálisis con un tampón de formación de discos y utilice una jeringa para cargar la mezcla de montaje en el casete. A continuación, dialice la reacción contra tres volúmenes de cinco litros de tampón de formación de disco durante 10 a 20 horas a temperatura ambiente con agitación antes de transferir la mezcla a unidades de filtro centrífugo equilibradas de tampón de formación de disco con un corte de peso molecular de 10 kilodalton.

A continuación, concentre la reacción en al menos 300 micromolares mediante centrifugación utilizando un lector UV-Vis para medir la concentración. Para preparar una reacción libre de células de intercambio continuo de tres mililitros, equilibre la membrana de un casete de diálisis de tres mililitros en tris-acetato de 100 milimolares. Y use una jeringa para transferir la mezcla de reacción al casete.

Con una jeringa, elimine el exceso de aire del compartimiento de la mezcla de reacción y coloque el casete en la cámara de diálisis. Llene la cámara con 60 mililitros de mezcla de alimentación y coloque la tapa en la cámara. Después de colocar la tapa en su lugar, incube la cámara durante 12 a 16 horas a 30 grados centígrados en 200 revoluciones por minuto.

Para preparar una configuración de reacción sin celdas de intercambio celular de 60 microlitros para el cribado de iones de magnesio, agregue 60 microlitros de nuestra mezcla maestra 3X recién preparada a la mezcla de reacción y 825 microlitros a la mezcla de alimentación. Y llene la mezcla de alimentación con agua. Después del vórtice, agregue 825 microlitros de mezcla de alimentación a cada uno de los tres pocillos de una microplaca de 24 pocillos.

Corte los tubos de diálisis de celulosa regenerada con un límite de peso molecular de 10 a 14 kilodalton en piezas de aproximadamente 25 por 20 milímetros y almacene las piezas en agua suplementada con azida de sodio al 0,05%. Antes de ensamblar el contenedor sin celdas de intercambio de minicélulas, use un pañuelo de papel para eliminar el exceso de agua de las membranas de diálisis y coloque una pieza de membrana en cada recipiente. Fije las membranas con un anillo de politetrafluoroetileno y transfiera el mini recipiente a un pocillo de mezcla de alimentación.

Agregue los componentes de alto peso molecular a la mezcla de reacción, como se indica en la tabla, y mezcle por pipeteo. Agregue 60 microlitros de mezcla de reacción al recipiente de reacción, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. Y envuelva dos láminas de ocho por 10 centímetros de una película termoplástica de sellado alrededor de la placa de 24 pocillos.

Fije la tapa de la placa del pocillo en su lugar con cinta adhesiva y coloque la placa a 30 grados centígrados en 200 revoluciones por minuto con agitación durante 12 a 16 horas. A la mañana siguiente, utilice una punta de pipeta para perforar la membrana de diálisis en el contenedor sin células de intercambio de minicélulas y aspire la mezcla de reacción. Transfiera la mezcla de reacción a nuevos tubos de centrífuga y centrifuga para eliminar los precipitados.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Aquí se muestra un impacto representativo de los compuestos de reacción de ajuste fino en el rendimiento final o la calidad de las proteínas de membrana sintetizadas. En este análisis, la síntesis general y la solubilización en nanodiscos del receptor adrenérgico T-beta-ona fueron similares en todas las composiciones de membrana analizadas.

Por el contrario, se detectó una variación mucho mayor en la calidad del receptor acoplado a la proteína G sintetizado, con la menor actividad obtenida con los lípidos DMPC y POPC, y la más alta cuando se aplicaron DOPG y POPG. En conjunto, estos resultados indican que la carga del grupo principal de lípidos, así como la flexibilidad de la cadena de ácidos grasos, son moduladores importantes para el plegamiento y la actividad de esta proteína de la membrana celular. La concentración final de nanodiscos también puede ser un factor importante para la calidad de las proteínas de membrana.

Por ejemplo, si la concentración de nanodiscos se examina dentro de un rango de 3,75 a 60 micromolares, se obtiene una solubilización completa del receptor acoplado a la proteína G en aproximadamente 30 nanodiscos micromolares, lo que da una relación de una a tres proteínas de membrana a nanodiscos. Por el contrario, se puede lograr una solubilización completa de la proteorrodopsina con aproximadamente 10 nanodiscos micromolares, lo que da una proporción de 10 a uno entre proteorrodopsina y nanodisco. Sin duda, es obligatorio un pipeteo preciso y componentes de alta calidad.

Los pasos críticos para la preparación del lisado son la recolección de las células en la fase media del registro y la aplicación del paso con alto contenido de sal. La técnica reduce drásticamente la complejidad de la síntesis de proteínas de membrana. Objetivos que antes eran difíciles se sintetizan de manera eficiente, lo que permite trabajar en estructuras moleculares de proteínas farmacéuticamente relevantes hasta ahora inexploradas.