Name: Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprende el análisis automatizado de marcha para evaluar la recuperación funcional en roedores con lesiones de nervio periférico o médula espinal. Este método permite estudiar cambios locomotores y regeneración nerviosa.

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Los autores quieren agradecer a Karin Brenner por su apasionado cuidado de los animales. Los autores también quieren agradecer a Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner y Susanne Drechsler por su ayuda durante las cirugías experimentales.

Los autores declaran que este trabajo fue apoyado por Noldus Inc. por la cobertura de la tarifa de publicación de acceso abierto. Ninguno de los autores recibió ningún salario personal o ningún tipo de propina financiera. Los autores no tienen otros intereses en competencia que declarar.

La evaluación de la recuperación funcional en modelos animales de PNI y SCI sigue siendo difícil debido a la gran variedad de métodos de evaluación, cada uno con ventajas y desventajas individuales. Sólo unos pocos enfoques han sido probados y validados en múltiples modelos de lesiones nerviosas periféricas y centrales, aunque nuevas técnicas prometedoras que combinan el seguimiento del movimiento y el aprendizaje automático podrían potencialmente impulsar la investigación neuroconductual al siguiente nivel de pruebas funcionales. Estamos convencidos de que pronto surgirán métodos de vanguardia ampliamente aplicables a una amplia variedad de modelos de animales y lesiones. A la luz de estas consideraciones, una de las ventajas de AGA es la posibilidad de evaluar la recuperación funcional en múltiples modelos de lesión nerviosa utilizando un solo dispositivo. Desde principios de la década de 2000 este enfoque se ha utilizado en modelos experimentales de PNI como elciático 37,peroneal38,y lesión del nervio femoral modelo22, así como después de la avulsión de raíz tanto dellumbar 39 como del plexo braquial40. Varias lesiones nerviosas centrales, incluyendo la lesión por contusión de la médula espinal, también se han estudiado con el método41,42. Con este artículo, presentamos un protocolo detallado sobre cómo inducir tres lesiones nerviosas comúnmente estudiadas, así como cómo evaluar la recuperación funcional después. En nuestra opinión, una guía práctica para los investigadores interesados en el área de la lesión, reparación y regeneración de nervios experimentales sobre cómo hacer un uso óptimo de las características ventajosas del método sería de gran ayuda.
Varios autores han abordado el potencial de AGA para evaluar la recuperación funcional en roedores, destacando la ventaja del método para evaluar simultáneamente los parámetros de marcha relacionados con la reinnervación motora y sensorial27,28. Además, la comparación de datos de una pata experimental, por ejemplo, una lesión nerviosa reconstruida a una pata no operada como se muestra en ambos modelos presentados permite la inclusión de un control positivo intra-animal. Inversamente, una pata operada sin reconstrucción quirúrgica o tratamiento adicional podría servir como un control negativo intra-animal. También se demostró que es posible combinar AGA con enfoques de aprendizaje automático43. A pesar de las ventajas del método, también tiene varias limitaciones e inconvenientes, como los esfuerzos de entrenamiento que consumen mucho tiempo, que son obligatorios para acostumbrar al animal al procedimiento de adquisición28,44. Otra limitación de AGA es el tamaño máximo de los animales elegibles para las pruebas debido a las dimensiones limitadas del aparato. Por lo tanto, el uso de AGA se limita actualmente a los animales del tamaño de roedores y hurones45. Además, los enfoques de evaluación neuroconductual recientemente emergentes en el campo del seguimiento del movimiento capaces de aprendizaje automático pueden superar a AGA tanto en la amplitud como en las posibles aplicaciones18,19,46. Lo más notable, pero de acuerdo con otros métodos de evaluación, parece que la recuperación funcional evaluada por AGA es fuertemente limitada, si incluso ocurre, en modelos de neurotmesis del nervio ciático47,48. Por otro lado, AGA permite una evaluación integral del curso de la recuperación funcional después de la neurotmesis del nervio femoral como se muestra en nuestros datos. Con este trabajo, demostramos que el área de impresión de patas es un parámetro representativo de la marcha evaluable a través de AGA, que es ejemplar para el curso de la recuperación funcional en los dos modelos de lesiones de nervios periféricos antes mencionados presentados por nosotros. Mientras que la recuperación funcional ad integrum fue observable después de la reparación del autoinjerto del nervio femoral, los parámetros de AGA todavía cambiaron significativamente desde el inicio al final del período de observación después de la reparación del autoinjerto del nervio ciático. En este contexto, cabe destacar que las contracturas de las extremidades son un fenómeno común en ratas con lesión del nervio ciático y es necesario tener precaución para no confundir estos signos de desequilibrio muscular y parálisis con el procedimiento de recuperación funcional32. Esto, por un lado, subraya la incapacidad del método AGA para detectar una recuperación funcional significativa después de una lesión de neurotmesis en este modelo. Por otro lado, plantea la cuestión de si es factible evaluar el modelo de lesión nerviosa ciática de la rata, que sigue siendo el modelo de reparación del nervio experimental más utilizado, mediante análisis de la marcha en general en caso de que la lesión nerviosa sea más grave que la axonotmesis48. Los detalles de solución de problemas se proporcionan en el archivo suplementario 1.
También proporcionamos datos ejemplares sobre el uso del método para evaluar la función locomotora en ratas con lesión de la médula espinal, que es posible sin ningún cambio necesario en el procedimiento de configuración o adquisición del hardware. El mismo principio se aplica a otros modelos de roedores de lesión nerviosa central (CNI)26,49,50 y lesión por avulsión de raíz. A diferencia de los PNI aislados, las lesiones de la médula espinal son mucho más complejas en sus consecuencias fisiopatológicas, ya que una multitud de estructuras muy importantes están dañadas, que implican vías eferentes como los tracto corticospinal y rubrospinal y vías aferentes como las columnas dorsales y las vías espinootálmicas35. El desafío de evaluar adecuadamente estos cambios patológicos se refleja en el armamentario integral de las pruebas de comportamiento, como la puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB)36. El parámetro de marcha Base de Apoyo se ha divulgado para aumentar después de lesiones nerviosas centrales, muy probablemente para tener en cuenta una marcha instable resultante. La base de soporte cambió significativamente desde la línea de base de WPO10 hasta WPO14 en nuestro modelo, apoyando nuestra presunción de que este parámetro permite evaluar el curso de la recuperación funcional por AGA después de una lesión de contusión torácica en la médula espinal.
Estamos convencidos de que AGA es una herramienta factible para evaluar la recuperación funcional en roedores con lesiones del sistema nervioso. Sin embargo, aconsejamos reflejar los cambios observados de la marcha cuidadosamente y a fondo en cada configuración experimental respectiva. Las alteraciones en los parámetros de marcha, por ejemplo, un aumento en el área de impresión después de un decremento postoperatorio inmediato o una disminución del tiempo de oscilación que provoca una elevación postoperatoria inmediata de este parámetro, en el transcurso del período de observación no se relacionan inevitablemente con la recuperación funcional. En cambio, estos cambios también pueden estar relacionados con una posible adaptación funcional para mantener una marcha discreta, dado que las ratas son una especie de presa y tratan de evitar mostrar dolor o discapacidad a los depredadores potenciales51. Por lo tanto, se recomienda utilizar el análisis automatizado de la marcha como herramienta complementaria para relacionar los cambios de marcha con otras medidas de resultado de la lesión y regeneración de los nervios periféricos21. Como se mencionó anteriormente, también creemos que debe reflejarse cuidadosamente si los roedores con neurotmesis del nervio ciático deben ser investigados por medio de AGA, ya que nuestro hallazgo indica fuertemente que la recuperación funcional está severamente limitada en este caso.
Como se muestra en nuestro trabajo, el principal activo de AGA es la posibilidad de estudiar tanto la reinnervación motora como sensorial en una multitud de modelos experimentales de PNI, así como en CNI, a la vez que requieren una sola configuración. Por lo tanto, el método es, en nuestra opinión, una herramienta muy valiosa para las pruebas neuroconductuales integrales. Uno de los activos de AGA, que es la posibilidad de estudiar la reinnervación motora y sensorial en varios modelos animales de PNI y CNI mientras se requiere una sola configuración, es en nuestra opinión la principal ventaja del método en comparación con otros métodos de evaluación para estudiar la recuperación funcional, como el análisis de pista a pie52,von Frey testing53, o la cinemática de la marcha16. El potencial de evaluar simultáneamente los cambios de marcha que se correlacionan con los resultados de las investigaciones electrofisiológicas del músculo reinnervado22 o los métodos de evaluación de la función sensorial54 es prometedor con respecto a las aplicaciones futuras del método. Por lo tanto, recomendamos utilizar AGA para investigar la recuperación funcional en modelos de roedores de PNI de extremidades anteriores, como el nervio cubital, radial o mediano, o los modelos experimentales de transferencia de nervios55,que aún no se han estudiado con este método.
Por la presente proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo utilizar el análisis automatizado de la marcha para estudiar la recuperación funcional en tres modelos de roedores de lesión nerviosa. Si bien el método requiere una cuidadosa consideración de varios aspectos clave, como el entrenamiento adecuado y la calibración meticulosa de hardware y software, es una herramienta complementaria factible y valiosa para evaluar la regeneración nerviosa en modelos de roedores de lesión nerviosa central y periférica.

Las lesiones del sistema nervioso periférico y central a menudo se estudian en roedores, lo que resulta en una gran cantidad de datos comparativos sobre el curso de la lesión nerviosa, reparación, o neuroprotección para contrarrestar otras lesiones secundarias y la regeneración1,2,3. El resultado de las estrategias de tratamiento experimental en modelos de roedores se puede evaluar mediante una variedad de técnicas tales como histología, inmunohistoquímica, electrofisiología y técnicas de imagen, como las exploraciones por microtomografía de rayos X (ECC), pero el criterio más importante para determinar el éxito de un tratamiento es, como en los pacientes humanos, el grado de recuperación funcional4,5. Los primeros estudios que investigan el rendimiento locomotor en roedores se remontan a la década de 19406,7,8. Ratas y ratones fueron sometidos a una gran cantidad de estudios que investigaron su comportamiento locomotor en las décadas siguientes9,10,11. Hoy en día, existe una amplia gama de técnicas de evaluación para modelos de roedores de lesiones nerviosas periféricas y centrales, que van desde el análisis de la vía a pie con tinta y papel12,13,14 sobre cinemática de tobillo y marcha15,16,17 hasta métodos mejorados de aprendizaje automático, que permiten la estimación compleja de la marcha, las extremidades y las trayectorias articulares18,19.
El Análisis Automatizado Computarizado de Gait (AGA) se utiliza para evaluar la función locomotora después de lesiones nerviosas periféricas y centrales y el tratamiento experimental potencial de dichas lesiones. El dispositivo consiste principalmente en una pasarela de vidrio y una fuente de luz que ilumina las impresiones de la pata del roedor en correlación con la presión excedida por ellos. A continuación, estos datos se informatizan para calcular una amplia gama de parámetros estáticos y dinámicos. Según Deumens, estos parámetros se pueden subdividir en las categorías de parámetros generales, parámetros relacionados con el dolor, así como parámetros relacionados con la coordinación de la marcha20 (Tabla 1). La viabilidad de AGA para detectar cambios en el comportamiento de la marcha se ha demostrado en varios modelos animales de lesión nerviosa periférica (PNI)21,como el nervio ciático20,el nervio femoral22y el nervio mediano23,24. También se utiliza habitualmente para evaluar la función locomotora en ratas con lesiones nerviosas centrales, por ejemplo, accidente cerebrovascular25 o contusión de la médula espinal26. Los avances del método residen en la gran cantidad de datos comparables y su posibilidad de registrar una gran cantidad de parámetros relacionados con la marcha27. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores interesados en modelos animales de PNI y lesión de la médula espinal (SCI) una guía detallada y práctica para evaluar la función locomotora en estos modelos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Categoría</td>
			<td>Parámetro</td>
			<td colspan="2">Descripción</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Parámetros generales de la marcha</td>
			<td>Zona de impresión (unidad de distancia)</td>
			<td colspan="2">Zona de la huella de la pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de impresión (unidad de distancia)</td>
			<td colspan="2">Longitud de la huella de la pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Base de soporte (BoS) (unidad de distancia)</td>
			<td colspan="2">Distancia entre las dos patas traseras o delanteras</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de zancada (unidad de distancia)</td>
			<td colspan="2">Distancia entre dos colocaciones consecutivas de una pata</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parámetros relacionados con el dolor de la marcha</td>
			<td>Tiempo de oscilación (s)</td>
			<td colspan="2">Duración de la fase de oscilación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de espera (s)</td>
			<td colspan="2">Duración de la fase de postura</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intensidad media de impresión de pata (unidad arbitraria)</td>
			<td colspan="2">Media iIntensity de la huella de la pata durante la fase de postura</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parámetros de marcha relacionados con la coordinación</td>
			<td>Patrones de secuencia de pasos normales (NSSP)</td>
			<td colspan="2">Secuencias específicas de colocaciones de patas durante un ciclo de pasos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispersiones de fase (%)</td>
			<td colspan="2">Diferencias temporales entre los ciclos de paso de dos patas específicas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indice de regularidad (RI) (%)</td>
			<td colspan="2">Cuantificación de la coordinación entre las extremidades dividiendo la cantidad de NSSP impecable por 4 por el número total de colocación de la pata durante un ciclo de paso</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Parámetros de la marcha evaluables con el análisis automatizado de la marcha. Las categorías en las que se clasifican los parámetros se eligen según Deumens et al.20.

<table><tbody><tr><td>0.9% Solución salina</td><td>B. Braun Austria 3570410</td><td></td><td>Vehículo para la administración de medicamentos</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>B. Braun Austria</td><td>9161708V</td><td>Dispositivo de inyección</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>B. Braun Austria</td><td>4606728 V</td><td>Dispositivo de inyección</td></tr><tr><td>1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidina</td><td>Gebro Pharma</td><td>N/A</td><td>Desinfección de la piel con alcohol</td></tr><tr><td>Cánula de calibre 23 (G</td><td>) B. Braun Austria</td><td></td><td>4657667 Cánula para inyección s.c.</td></tr><tr><td>Cánula de calibre 26 (G)</td><td>B. Braun Austria</td><td></td><td>4657683 Cánula para inyección s.c.</td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>B. Braun Austria</td><td>4606710 V</td><td>Dispositivo de inyección</td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina Sigma</td><td></td><td>B9275</td><td>Agente analgésico</td></tr><tr><td>Fresas para Micro Drill</td><td>F.S.T</td><td>19007-29</td><td>Perforación de un agujero en el interior la lámina</td></tr><tr><td>Caprofeno</td><td>Zoetis Austria</td><td>N/A Agente</td><td>analgético</td></tr><tr><td>Pasarela Sistema automatizado de análisis de la marcha</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>Software de análisis automático de la marcha de los animales</td></tr><tr><td>Kit cauterizador</td><td>F.S.T</td><td>18010-00</td><td>Cauterización de vasos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Enrofloxacino</td><td>Bayer Austria</td><td>N/A</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Ethilon (10-0)</td><td>ETHICON</td><td>2810G</td><td>Material de sutura para neurrorafia</td></tr><tr><td>Ethilon (11-0)</td><td>ETHICON</td><td>EH7465G</td><td>Material de sutura para neurrorafia</td></tr><tr><td>Ungüento ocular</td><td>Fresenius Kabi Austria</td><td>4302436</td><td>Protección ocular durante la anestesia</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>F.S.T</td><td>16221-14</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Gabapentina</td><td>Farmacia Wedgewood</td><td>N/A</td><td>Agente analgético</td></tr><tr><td>Retractor Goldstein</td><td>F.S.T</td><td>17003-03</td><td>Retracción de tejidos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Recortadora de pelo</td><td>Aescular</td><td>N/A</td><td>Recortadora de pelo para el afeitado del lugar de la operación antes de la cirugía</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para roedores</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>N/A Regulación</td><td>de la temperatura corporal</td></tr><tr><td>Impactor</td><td>Sistemas de precisión e instrumentación</td><td>N/A</td><td>Inducción de contusión medular Rata de</td></tr><tr><td>Lewis (<img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg">)</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td>Animal de experimentación</td></tr><tr><td>Fijador magnético Sistema de retracción</td><td>F.S.T</td><td>18200-50</td><td>Retracción de tejidos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras para bebés Metzenbaum</td><td>F.S.T</td><td>14019-13</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Word Precision Instruments</td><td>503599</td><td>Instrumento para la perforación ósea</td></tr><tr><td>Micro Portaagujas</td><td>F.S.T</td><td>12076-12</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Microtijeras (curvas)</td><td>F.S.T</td><td>15023-10</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Microtijeras (rectas)</td><td>F.S.T</td><td>15007-08</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Pinzas con acabado espejo</td><td>F.S.T</td><td>11251-23</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>F.S.T</td><td>12002-12</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>quirúrgico Leica</td><td>M651 MSD</td><td>Aumento del lugar operatorio</td></tr><tr><td>Povidona Iod</td><td>B. Braun Melsungen</td><td>N/A</td><td>Desinfectante cutáneo sin alcohol</td></tr><tr><td>Pulsioxímetro</td><td>STARR Life Sciences</td><td>N/A</td><td>Vigilancia de la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno</td></tr><tr><td>Termómetro para roedores</td><td>BIOSEB</td><td>BIO-TK8851</td><td>Vigilancia de la temperatura corporal</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí</td><td>F.S.T</td><td>10010-00 (#10)</td><td>Instrumento quirúrgico para hacer una incisión</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td> <td>Instrumento quirúrgico para hacer una incisión</td></tr><tr><td>Sevoflurano Inhalación Vapor, Líquido (100%)</td><td>Baxter</td><td>HDG9117A</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Espátula &amp; Sonda</td><td>F.S.T</td><td>10090-13</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Sprague Dawley rat (<img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg">)</td><td>Janvier</td><td>N/A Animal de</td><td>experimentación</td></tr><tr><td>Gasa estéril 5x5cm</td><td>EVAC MEDICAL</td><td>E010.03.00215</td><td>Compresa de gasa estéril</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido</td><td>F.S.T</td><td>11021-12</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Vicryl (4-0)</td><td>ETHICON</td><td>V3040H</td><td>Material de sutura para suturas subcutáneas</td></tr><tr><td>Vicryl (5-0)</td><td>ETHICON</td><td>V303H</td><td>Material de sutura para suturas subcutáneas</td></tr><tr><td>Aguja de corte Vicryl (4-0)</td><td>ETHICON</td><td>V392ZH</td><td>Material de sutura para suturas cutáneas</td></tr><tr><td>Aguja de corte Vicryl (5-0)</td><td>ETHICON</td><td>V391H</td><td>Material de sutura para suturas cutáneas</td></tr></tbody></table>

análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Las lesiones nerviosas periféricas y centrales se estudian principalmente en roedores, especialmente ratas, dado el hecho de que estos modelos animales son rentables y se han publicado muchos datos comparativos en la literatura. Esto incluye una multitud de métodos de evaluación para estudiar la recuperación funcional después de la lesión nerviosa y la reparación. Además de la evaluación de la regeneración nerviosa por medio de histología, electrofisiología y otras técnicas de evaluación in vivo e in vitro, la recuperación funcional es el criterio más importante para determinar el grado de regeneración neuronal. El análisis automatizado de la marcha permite registrar una gran cantidad de parámetros relacionados con la marcha, como el área de impresión de patas y la velocidad de oscilación de la pata, así como medidas de coordinación entre extremidades. Además, el método proporciona datos digitales de las patas de las ratas después del daño neuronal y durante la regeneración nerviosa, lo que aumenta nuestra comprensión de cómo las lesiones nerviosas periféricas y centrales afectan su comportamiento locomotor. Además del modelo de lesión del nervio ciático predominantemente utilizado, otros modelos de lesión del nervio periférico como el nervio femoral se pueden estudiar por medio de este método. Además de las lesiones del sistema nervioso periférico, se pueden evaluar lesiones del sistema nervioso central, por ejemplo, contusión de la médula espinal. La evaluación de datos válida y reproducible depende en gran medida del ajuste meticuloso de la configuración de hardware y software antes de la adquisición de datos. Además, el entrenamiento adecuado de los animales experimentales es de crucial importancia. Este trabajo tiene como objetivo ilustrar el uso de análisis automatizados informatizados de la marcha para evaluar la recuperación funcional en diferentes modelos animales de lesión del nervio periférico, así como la lesión de contusión de la médula espinal. También hace hincapié en las limitaciones del método, por ejemplo, la evaluación de la regeneración nerviosa en ratas con neurotmesis del nervio ciático debido a la recuperación funcional limitada. Por lo tanto, este protocolo se piensa para ayudar a los investigadores interesados en lesiones nerviosas periféricas y centrales para evaluar la recuperación funcional en modelos de roedores.

12 ratas se sometieron a una cirugía experimental de nervio periférico. La resección del nervio ciático (Figura 2A) se realizó en 7 ratas, mientras que la neurotmesis del nervio femoral (Figura 2B) se indujo en 5 ratas. En todos los animales, el defecto nervioso fue reconstruido por medio de un injerto nervioso autólogo. Lesión por contusión de la médula espinal (Figura 2C) en el nivel Th11 se indujo en 6 ratas, resultando en un total de 18 ratas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig02.jpg"> Figura 2: Sitios operativos después de la reconstrucción nerviosa. Reconstrucción nerviosa con autoinjertos en el nervio ciático (A) y nervio femoral (B), así como después de la lesión por contusión de la médula espinal (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Todos los animales se recuperaron bien de la cirugía y no se produjeron casos de automutilación. Un animal del grupo de lesiones nerviosas ciáticas desarrolló fuertes contracturas de la pata trasera derecha durante el período de observación postoperatoria y tuvo que ser excluido de un análisis de datos posterior.
Neurotmesis del nervio ciático Dado que el nervio ciático proporciona inervación muscular y sensorial a la mayoría de la extremidad posterior, su resección resulta en un deterioro grave de la función locomotora. Después de la lesión, las ratas utilizan el talón de la pata para el soporte de peso solamente (Figura 3B–E) y la extremidad se mueve en un movimiento circunductorio de barrido. Por lo tanto, los cambios en la locomotora evaluados a través de AGA se hacen evidentes mediante una zona de impresión significativamente reducida (Figura 4A) y un aumento significativo del tiempo de oscilación (Figura 4B). Ambos parámetros todavía se modificaron significativamente en comparación con las mediciones pre-OP al final del período de observación. Cabe destacar que un animal desarrolló fuertes contracturas de la pata trasera derecha a partir de la semana postoperatoria (WPO) 10. Esto dio lugar a un aumento del área de impresión de la pata trasera derecha a más del 150% en comparación con la pata izquierda en WPO12 (Figura 5). Como se trataba de un extremo en comparación con todos los demás animales evaluados en este estudio, excluimos a este animal del análisis de datos con respecto a la zona de impresión.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig03.jpg"> Figura 3: Impresiones de patas representativas antes y después de la resección de tamaño crítico del nervio ciático derecho y reparación de autoinjertos. Tenga en cuenta la fuerte disminución en el área de impresión después de una lesión nerviosa (B) en comparación con preoperatoriamente (A). A pesar de un ligero incremento en el área de impresión durante el período de observación (C–E) las huellas de la pata de la extremidad posterior derecha permanecieron notablemente cambiadas de las grabaciones basales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig04.jpg"> Figura 4: El curso de la recuperación funcional después de la resección de tamaño crítico y la reparación del autoinjerto del nervio ciático. La relación de área de impresión (A) y la relación de tiempo de oscilación (B) se cambiaron estadísticamente significativamente a partir de los valores preoperatorios inmediatamente después de la resección del nervio ciático. Mientras que el área de impresión se mantuvo significativamente disminuida en comparación con la línea de base hasta WPO10, el tiempo de oscilación todavía se incrementó significativamente a los valores preoperatorios en WPO12. *: p &lt; 0.05 en comparación con Pre-OP, **: p &lt; 0.01 en comparación con Pre-OP. Las barras de error indican la media ± error estándar de la media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig05.jpg"> Figura 5: Gráfica de caja del área de impresión después de una lesión del nervio ciático. Observe el extremo (elipse roja) en WPO12, lo que se explica por el hecho de que un animal desarrolló fuertes contracturas de la pata trasera derecha a partir de WPO10. Por lo tanto, el animal fue excluido del análisis estadístico que figura en la Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Neurotmesis del nervio femoral La resección del nervio femoral da lugar a la denervación del músculo del cuádriceps del muslo33,34. En consecuencia, la extensión de la rodilla se ve afectada, lo que resulta en hiperflexión de la articulación del tobillo con elevación consecutiva del talón de la pata. Por lo tanto, el área de impresión de la pata respectiva(Figura 6B), se reduce fuertemente después de la cirugía. El área de impresión de la pata trasera izquierda aumenta debido a un desplazamiento compensatorio del peso hacia la izquierda. Esto debe tenerse en cuenta, ya que este fenómeno influye directamente en la relación calculada entre la pata "experimental" y la pata de "control". A partir de la reinnervación WPO4 del cuádriceps por el nervio femoral regenerador conduce a la reversión de estos cambios, lo que resulta en un aumento del área de impresión de la pata trasera derecha (Figura 7A). Como el músculo del cuádriceps del muslo también juega un papel en la fase de oscilación de la pata respectiva, Swing Time (Figura 7B) se prolonga en gran medida en ratas con lesión del nervio femoral. Reflejando el retorno del área de impresión, el tiempo de oscilación disminuye a medida que el nervio femoral regenerador alcanza el músculo del cuádriceps del muslo. En WPO10, ambos parámetros de la marcha regresaron a la línea de base, lo que indica una recuperación funcional completa.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig06.jpg"> Figura 6: Impresiones de patas representativas. Impresiones representativas de la pata antes de (A) y siguientes (B–E) resección del nervio femoral derecho y reparación de autoinjertos. El área de impresión de RH disminuyó fuertemente en WPO2 (B), mientras que un aumento en el área de impresión de la pata trasera izquierda (LH) debido al aumento de la carga de peso se hizo visible. El área de impresión RH comenzó a aumentar a partir de WPO6 (C) acompañada de una disminución en el área de impresión de LH. En el área de impresión WPO8 (D) y WPO10 (E) de RH se recuperó cerca de los niveles preoperatorios. (Adaptado con permiso de Heinzel et al.22, licenciado bajo CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig07.jpg"> Figura 7: El curso de la recuperación funcional después de la resección de 7 mm y la reparación del autoinjerto del nervio femoral. El curso de la relación de área de impresión (A) y la relación de tiempo de oscilación (B) revelaron un fuerte cambio inmediatamente después de la resección del nervio femoral, pero los valores se recuperaron de nuevo a los valores preoperatorios en WPO8. •: p &lt; 0.05. Las barras de error indican la media ± SEM. (Adaptado con permiso de Heinzel et al.22, licenciado bajo CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Contusión de la médula espinal El análisis de gait reveló impresiones de patas marcadamente alteradas después de una lesión de contusión de la médula espinal torácica (Figura 8), un decremento más notable en el área de impresión y una marcada rotación interna de las patas traseras en WPO2 (Figura 8B). Cabe destacar que la rotación de la pata también se implementa como una característica evaluable en el BBB, subrayando la aplicabilidad del análisis computarizado de la marcha para evaluar los cambios de marcha que fueron evaluados originalmente con pruebas de campo abierto. En cuanto al curso de los parámetros individuales de la marcha, la contusión de la médula espinal en el nivel Th11 dio lugar a una disminución de la relación de área de impresión (Figura 9A) y el incremento de la relación de tiempo de oscilación (Figura 9B). Ambos parámetros llegaron a los niveles de referencia durante el curso posterior del período de observación, pero no hubo cambios estadísticamente significativos observables. El índice de regularidad de los parámetros relacionados con la coordinación(Figura 9C)también disminuyó en WPO2, pero el grado varió mucho entre los animales. También se dirigió hacia los valores preoperatorios hasta WPO16. Base de apoyo de las patas traseras (Figura 9D), un parámetro general de marcha según Deumens, mostró un aumento marcado, que fue estadísticamente significativo desde WPO10 hasta WPO14. Se destinaba a los niveles de referencia en WPO16 y ya no se modificaba significativamente del valor preoperatorio en este momento.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig08.jpg"> Figura 8: Impresiones de pata representativas de las dos patas traseras. Las impresiones de la pata preoperatoriamente (A) y después de la lesión de contusión de la médula espinal torácica (B–F). Tenga en cuenta la reducción del área de impresión a partir de WPO2 (B) acompañada de una notable rotación interna de las patas. Durante el transcurso del período de observación (C–F) se observa un incremento del área de impresión, así como el aclaramiento de la rotación interna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig09.jpg"> Figura 9: Contusión de la médula espinal en el nivel Th 11. La contusión de la médula espinal en la th 11 dio lugar a alteraciones observables de la relación de área de impresión (A) y el tiempo de oscilación (B) y el índice de regularidad (C), pero estos cambios no fueron estadísticamente significativos. Después de la lesión, Base de apoyo de las patas traseras mostró un marcado aumento en comparación con la línea de base, lo que fue estadísticamente significativo en WPO10 hasta WPO14. *: p &lt; 0.05 en comparación con Pre-OP. Las barras de error indican la media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo suplementario 1: Detalles de solución de problemas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61852/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El análisis automatizado de la marcha es una herramienta factible para evaluar la recuperación funcional en modelos de roedores de lesión del nervio periférico y lesión por contusión de la médula espinal. Si bien sólo se requiere una configuración para evaluar la función locomotora en varios modelos experimentales, el ajuste meticuloso de software duro y suave y el entrenamiento de los animales es muy importante.

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

El análisis automatizado de la marcha es un método ampliamente utilizado para evaluar los modelos de inscripción de recuperación funcional de lesiones, reparación y regeneración de los nervios periféricos. El método se puede utilizar para estudiar los cambios en la marcha después de una lesión del nervio periférico, relacionados tanto con la función motora como con la función nerviosa sensorial. Los investigadores nuevos en el método podrían experimentar dificultades para adquirir datos de alta calidad.Los obstáculos típicos son el entrenamiento animal adecuado y la calibración precisa de hardware y software. Durante las sesiones de entrenamiento y el día de la prueba, apague todas las fuentes de luz en la sala de pruebas de comportamiento y enfrente la pantalla del ordenador para la adquisición de datos lejos de la cámara para evitar que su luz interfiera con la cámara. Confirme que el dispositivo está instalado en una posición estable de una manera que evite cualquier forma de vibración, y lleve a las ratas a la sala de pruebas conductuales en su propia jaula de casa durante al menos 30 minutos antes de la prueba, en el primer día de entrenamiento, agarre suavemente a un animal debajo de su tronco y colóquelo cuidadosamente en la entrada de la pasarela.Deje que la rata explore la abertura del pasillo sin ninguna interferencia, y espere hasta que el animal cruce voluntariamente la pasarela para llegar a su jaula doméstica sin ningún estímulo o motivación externa. En el segundo día de entrenamiento, permitir que los animales se acostumbren a entrar en la pasarela y volver a su jaula de origen sin dudarlo. En el tercer día de entrenamiento, confirme que los animales han aprendido a cruzar la pasarela a una velocidad uniforme sin dudarlo, oler u otros movimientos exploratorios.En la cuarta y quinta, repita el entrenamiento para reforzar el procedimiento de prueba. El día del experimento, utilice un limpiador de vidrio comercial y una escobilla para limpiar la parte superior e inferior de la pasarela teniendo cuidado de eliminar todo el líquido de los extremos de la pasarela. Coloque las ratas más ligeras y pesadas en la pasarela y seleccione una cámara registrada en la pestaña de configuración para permitir que la ganancia de la cámara, la luz roja del techo, la luz verde de la pasarela y el umbral de intensidad verde se ajusten para garantizar una detección óptima de la impresión de la pata para todos los animales en el análisis.A continuación, haga clic en Abrir adquisición y adquiera una instantánea de la pasarela limpia vacía que se utilizará como referencia durante todo el procedimiento de adquisición de datos. El estado cambiará de esperar la instantánea a estar listo para la adquisición. Haga clic en Iniciar adquisición.El estado cambiará de listo para la adquisición a la espera de que se inicie la ejecución. Cuando la cámara esté lista, coloque una rata en la pasarela y siga el movimiento del animal en la pantalla del ordenador. Tenga en cuenta que el cambio de estado de esperar a que se ejecute hasta empezar a grabar.Al final del análisis, haga clic en clasificar en la pestaña del explorador experimental de la prueba que se va a clasificar y reproduzca la ejecución adquirida a velocidad normal para determinar si los datos se ajustan a los requisitos de clasificación. Haga clic en Clasificación automática para la clasificación automática de las impresiones de la pata por el software. Para el cálculo correcto de los patrones de secuencia de pasos normales, asegúrese de que el algoritmo de clasificación no se confunda mediante impresiones de patas no visibles, lo que conduce a NSSP defectuoso, y que solo se incluyen las impresiones de pata que son detectables mientras que la pata contralateral también es visible para los cálculos NSSP.Para el análisis estadístico de los datos, haga clic en Ver estadísticas de ejecución para obtener una visión general completa de las estadísticas de ejecución. A continuación, seleccione archivo y exportación para exportar las estadísticas de ejecución o de prueba a un software de hoja de cálculo. Después de una lesión en el nervio ciático, las ratas usan el talón de la pata solo para el soporte de peso y la extremidad se mueve en un movimiento circunductorio de barrido.Por lo tanto, los cambios en la locomotora evaluados mediante el análisis automatizado de la marcha se hacen evidentes por un área de impresión significativamente reducida y un tiempo de oscilación significativamente mayor. La resección del nervio femoral resulta en la denervación del músculo del cuádriceps del muslo, deteriorando la extensión de la rodilla e induciendo la hiperflección de la articulación del tobillo con elevación consecutiva del talón correspondiente. A partir de la semana postoperatoria cuatro, la reenrevase del cuádriceps por el nervio femoral regenerador conduce a la reversión de estos cambios.Como el músculo del cuádriceps del muslo también juega un papel en la fase de oscilación de la pata respectiva, el tiempo de oscilación se prolonga en gran medida en ratas con lesión del nervio femoral. El análisis de gait revela impresiones de patas marcadamente alteradas después de la contusión de la médula espinal torácica. La contusión de la médula espinal en el nivel torácico 11 también da como resultado una disminución de la relación del área de impresión, un incremento de la relación de tiempo de oscilación.El índice de regularidad relacionado con la coordinación también disminuye en la segunda semana postoperatoria, mientras que la base de apoyo de las patas traseras muestra un aumento marcado. Cuando utilice el análisis automatizado de puertas para evaluar la recuperación funcional en roedores, asegúrese de entrenar cuidadosamente a los animales y de ser meticuloso al realizar cualquier ajuste de software o hardware. Mediante el análisis automatizado de la marcha, las lesiones y la regeneración del sistema nervioso central y periférico se pueden evaluar en varios modelos de roedores, incluidos los modelos nerviosos formales aún no estudiados, como el nervio mediano.

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Uso del MouseWalker para cuantificar la disfunción locomotora en un modelo de ratón de lesión de la médula espinal

Aprende el análisis automatizado de marcha para evaluar la recuperación funcional en roedores con lesiones de nervio periférico o médula espinal. Este método permite estudiar cambios locomotores y regeneración nerviosa.

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal (Video) | JoVE Journal

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

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