Name: CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学。電気穿孔法で遺伝子ノックアウトとノックインを実現し、CD19発現95%以上の低下を確認。B細胞生物学と治療薬開発の研究に応用可能。

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この研究は、小児がん研究基金(CCRF)とNIH R01 AI146009からB.S.Mに資金提供されました。

健康なドナーからの白血病サンプルは、地元の血液銀行から得られた。ここで説明したすべての実験は、機関審査委員会(IRB)によって研究のために免除されると判断され、ミネソタ大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。
注:すべての実験は、無菌/無菌技術と適切なバイオセーフティレベル2機器で、血液媒介病原体のための普遍的な予防措置に従って行われました。
1. B細胞拡張培地用サプリメントを準備する
<ol><li>1 mg/mLの濃度にCpGオリゴヌクレオチドを再構成する。</li>
	<li>CD40リガンド(CD40L)を100μg/mLの濃度に再構成します。</li>
	<li>組換えヒトIL-10(rhIL-10)を50μg/mLの濃度に再構成する。</li>
	<li>組換えヒトIL-15(rhIL-15)を10μg/mLの濃度に再構成する。 注:各サプリメントを-20°C~-80°Cで6ヶ月間小さなアリコートに保管してください。</li>
</ol>2. 基底培地の準備
<ol><li>B細胞基底培地と5%(v/v)インビトロ免疫細胞拡張用の培地サプリメント(例えば、CTS免疫細胞SR)および1%(v/v)ペニシリンおよびストレプトマイシンを組み合わせます。</li>
	<li>0.22 μmフィルターアダプターを使用して、基底媒体を殺菌ボトルに入れます。</li>
	<li>基底培地を4°Cで1ヶ月以内に保管してください。</li>
</ol>3. B細胞拡張培地の準備
<ol><li>必要量の基底培地を無菌容器に移し、5×10個 の細胞/mLでB細胞を培養する。</li>
	<li>基礎培地に1 μg/mL CPG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10、および10 ng/mL rhIL-15を添加します。</li>
	<li>0.22 μmフィルターを使用して、B細胞拡張培地をフィルター処理します。</li>
	<li>B細胞拡張培地を37°Cで組織培養インキュベーターに平衡化し、使用前に少なくとも30分間湿度を有する5%CO2を用いた。 注意:1日使用する新鮮なB細胞拡張培地を準備してください。B細胞拡張培地を複数日使用する準備 をしないでください 。このメディアレシピは、メモリB細胞および活性化された原発ヒトB細胞の増殖を促進する。</li>
</ol>4. ヒトB細胞の精製と拡張
注:温度制御冷凍容器に99~100%のイソプロピルアルコールを加え、メーカーの指示に従い、凍結容器を4°Cで冷やしてからステップ4.1を開始します。
<ol><li>白血病サンプルからPBMCsを分離する
	<ol>
<li>白血病サンプル(およそ8〜10 mL)を無菌50 mL円錐管に移します。</li>
		<li>滅菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で体積を35 mLに上げる。</li>
		<li>密度勾配培地の15 mLに35 mLの白血病サンプルを慎重に重ねてください。</li>
		<li>ブレーキなしで25分間500×gで遠心分離機、バフィーコート(PBMC層)を邪魔することなくプラズマ層を取り外し、界面からPBMCsを収集し、新しい無菌50 mL円錐形チューブに移します。 </li>
		<li>1x PBS で PBMCs を 50 mL まで持ち出します。</li>
		<li>ブレーキなしで5分間500×gで遠心分離機。PBMCペレットを邪魔することなく上清を除去し、赤色に見えることがあります。</li>
		<li>7 mLの塩化アンモニウム - カリウムリシスバッファーを加え、ピペットを3回よく混合し、室温(RT)で3分間インキュベートします。</li>
		<li>1x PBSでボリュームを50 mLに上げてください。</li>
		<li>400×gで遠心分離機を5分間低抵抗ブレーキで。ペレットを邪魔することなく上清を除去します。ペレットはピンクがかったか白く見えるはずです。 注:分離したばかりのB細胞を培養し続けるには、B細胞の分離を開始する前にB細胞拡張培地を準備します(ステップ4.2)。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒトの一次B細胞陰性分離キットを用いたPBMCsからのB細胞分離
	<ol>
<li>分離バッファー内の PBMC を 5 × 107 セル/mL の濃度まで再中断します。 注: PBMCs の総数が 5 × 107 セル 未満の場合は、分離バッファーのボリュームをスケールダウンして、5 × 107 セル/mL を維持します。細胞懸濁液の最小容積および最大容積はそれぞれ0.25 mLおよび8 mLである。</li>
		<li>最大8 mL(5×10個の7 セル/mL)を、キャップ付きの無菌、ポリプロピレン、ラウンドボトムチューブに移します。</li>
		<li>50 μL/mL のカクテルエンハンサーを PBMC に追加します。</li>
		<li>50 μL/mLのアイソレーションカクテルをPBMCに加え、チューブをキャップし、2~3回反転して混ぜます。</li>
		<li>RTで5分間インキュベートします。インキュベーションの4分目 に、少なくとも30sの渦磁気マイクロビーズ。</li>
		<li>PBMCsの1 mLあたり50μLの磁気マイクロビーズを移し、管をキャップし、2〜3回反転して混合します。</li>
		<li>分離バッファーで最大 10 mL を上に置き、ピペットを 2 ~3 回上下に緩やかにします。</li>
		<li>チューブを磁性ステーションに置き、RTで3分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石とチューブを一緒に持ち、1つの動きで磁石とチューブを反転させ、セルの懸濁液を新しいチューブに注ぎます。古いチューブを破棄します。</li>
		<li>ステップ 4.2.8 (2 分にインキュベーション時間を短縮) を繰り返し、B 細胞懸濁液をクリーンな円錐形チューブに注ぎます。</li>
		<li>濃縮された B 細胞を使用する準備が整いました。セルがすぐに使用される場合は、セクション 4.3 (ヒト B 細胞拡張) に進みます。フローサイトメトリー(任意)により単離されたB細胞の純度を確認する。セルを使用する前に凍結する場合は、ステップ 4.2.12 に進みます。</li>
		<li>B細胞を凍結させるために、遠心分離機を400×gで5分間、ペレットを乱すことなく上清を捨てる。 </li>
		<li>凍結培地中の細胞を107 個の細胞/mLで再懸濁し、アリコート1 mL/cryovialを再懸濁する。</li>
		<li>冷蔵冷凍容器にクライオビシャルを入れ、一晩で-80°Cで保管します。その後、液体窒素タンクに凍結性の凍結を移します。1年まで凍結細胞を保ちます。 注: 単離された B 細胞の期待収量は、PBMCs 全体の 2%~8% であり、生存率は 95% ~99% です。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒトB細胞拡張 注: 分離された新しい B セルを使用する場合は、手順 4.3.1 ~ 4.3.5 を省略してください。細胞を数え、必要な数の細胞を無菌の円錐形チューブに移し、ステップ4.3.6に進みます。<ol>
<li>B細胞を解凍する前に、水浴中の胎児胎児血清(FBS)を前温め。B細胞拡張培地20mLを調製し、T25フラスコに移し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度で)で培地を事前平衡化します。</li>
		<li>37°Cの水浴でB細胞を解凍する。待っている間、2 mLの予温されたFBSを無菌15 mL円錐形管に移す。</li>
		<li>B細胞が完全に解凍された後、すぐにサンプルに1mLの予め温めたFBSを滴下して加えます。RTで1分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペットを静かにピペットを使用してサンプルを再中断し、ボリューム全体を、2 mLの予め温めたFBSを含む円錐管にドロップして移動させます。</li>
		<li>滅菌1x PBS、キャップで体積を15 mLに持ち上げ、チューブを2~3回緩やかに反転します。</li>
		<li>400×gで5分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を細胞ペレットを乱さずに捨て、あらかじめ平衡化されたB細胞増殖培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントする。セルの総数は約 107 個のセルである必要があります。</li>
		<li>細胞を事前平衡化されたB細胞拡張培地の20mLを含むフラスコに移す。細胞の最終的な濃度はおよそ5 x 105 細胞/mLでなければならない。</li>
		<li>フラスコを組織培養インキュベーターで縦にインキュベートします。</li>
		<li>B細胞の全容を無菌の円錐管に移し、ステップ4.3.6~4.3.9を繰り返して、2日ごとに膨張培地を完全にリフレッシュします。 注:T25フラスコは、培地の10〜20 mLを保持することができます。T75フラスコは、最大20~60mLの培地を保持できます。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 初発ヒトB細胞工学
<ol><li>B細胞を48±2時間で拡張/活性化して最適な結果を得ます。B細胞膨張培地を調製し、48ウェル組織培養プレートに培地のアリコート1mLを調製し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーターで事前平衡化する。 注: 目的の遺伝子に対応する CRISPR/Cas9 sgRNA を設計する場合は、以下の手順に従ってください。 - オンラインツール11を使用してsgRNAを設計する。 - タンパク質のすべてのアイソフォームに共通のエキソン上にsgRNAを設計します。 - 評判の良い企業から化学修飾sgRNAを注文します。 - sgRNAは通常凍結乾燥した形で来る;滅菌DNase/RNaseフリートリスEDTA(TE)バッファー内のsgRNAを1μg/μLの濃度に再構成します。</li>
	<li>化学修飾されたsgRNAの1 μL(1 μg/μL)を化学修飾 されたレンサ球菌のpyogenes Cas 9(S.p.Cas9)の1回のトランスフェクション反応のヌクレアーゼと混合して、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板を調製します。制御のために、sgRNAの代わりに1 μLのTEバッファを使用してください。 注: CD19 sgRNA を遺伝子 KO 実験に使用する場合、結果については 図 2 を参照してください。AAVS1 sgRNAを遺伝子KI実験に使用する場合、結果については 図5 を参照してください。<ul>
<li>すべてのコンポーネントを氷の上に保管してください。</li>
	</ul></li>
	<li>穏やかに混合し、0.2 mL 8管ストリップのチューブに反応ごとにCRISPR / Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを転送します。RTで脇に置きます。</li>
	<li>核の核(エレクトロポレーター)をオンにし、 表1に示すようにトランスフェクション試薬を調製する。 注:これは、必要に応じて、氷の上にすべての試薬を置くことによって、一時停止のための良いステップです。実験を再開する準備ができたら、氷からすべての試薬を取り除きます。S.p. Cas9タンパク質を使用する場合、研究者は、1 μg sgRNAと5 μgのS.P.Cas9タンパク質を混合し、気泡を避け、最適な結果を得る前に少なくとも20分間RTで混合物をインキュベートすることによって、CRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質を事前に複合体化する 必要があります 。</li>
	<li>トランスフェクション反応ごとに106B 細胞を無菌の円錐管に数え、移送する。</li>
	<li>滅菌1x PBSで体積を15 mLに、遠心分離機を400×gで5分間持ち上げる。待ちながら、一次細胞トランスフェクション試薬を準備し(表2)、RTに置いておく。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を捨てます。</li>
	<li>細胞ペレットを10 mLの無菌1x PBSと遠心分離機を400×gで5分間再懸濁します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を完全に捨てます。</li>
	<li>106 B細胞当たり0.5μgの化学修飾GFP mRNA(トランスフェクションレポーターとして)を細胞ペレットに移します(任意)。</li>
	<li>106 B細胞当たり20μL一次細胞トランスフェクション試薬で細胞ペレットを再懸濁する。5~6回ピペットで軽く混ぜます。トランスフェクション反応ごとに20.5 μLを、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを含む8チューブストリップの0.2 mLチューブに移します。</li>
	<li>ピペットを 1回 上下にして、全ボリューム(23 μL)をトランスフェクションキュベットに混合して転送します。ベンチのキュベットをキャップして軽くタップして、液体がキュベットの底部を覆っていることを確認します。</li>
	<li>トランスフェクターの核形成にヒトの一次B細胞プロトコルを使用する。 注意:核の核(エレクトロポレーター)は、組織培養フードの外側に配置して使用することができます。キュベットをキャップして、滅菌を確実にします。</li>
	<li>RTでキュベットの電気ポレートされた細胞を15分間休まします。</li>
	<li>前平衡化されたB細胞拡張培地の80μLを、キュベット内のトランスフェクション反応に組織培養板から移す。キュベットを組織培養インキュベーターに30分間入れる。</li>
	<li>ピペットを数回軽くピペットし、サンプルの全容をキュベットから混合し、B細胞膨張培地の1mLを含む48ウェル組織培養プレートの適切なウェルに移した。細胞の最終的な濃度は106 細胞/mLでなければなりません。</li>
	<li>遺伝子KI実験を行う場合 、rAAV6ベクターを500,000の感染多重度で、エレクトロポレートされた細胞を含む適切なウェル(約45分後エレクトロポレーション)に移す。 図 4Aの rAAV6 ベクトル・コンストラクトの例を参照してください。 注:例: コントロールサンプルはCRISPR/Cas9またはrAAV6ベクトルなしでエレクトロポレートされます。ベクトルのみのサンプルはCRISPR/Cas9なしで電気ポレートされ、rAAV6ベクターで伝達されます。KIサンプルはCRISPR/Cas9でエレクトロポレートされ、rAAV6ベクターでトランスデューシングされます。rAAV6 は、HDR のターゲット DSB サイトの上および下流に相同性アームを含んでいる必要があります。</li>
	<li>プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに入れ、湿度が5%のCO2 を入れる。</li>
	<li>1日目のポストエンジニアリングで細胞を数え、生存率を記録します。</li>
	<li>細胞を数え、きれいな1.5 mLのマイクロ遠心管に細胞の全体の容積を移すことによって、2日ごとにB細胞の膨張媒体をリフレッシュしなさい。400×gで5分間遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。100 μLの新鮮な B 細胞拡張培地で細胞を再懸濁し、24 ウェル組織培養プレートのウェルに移します。培地容量を上げて、5×10個の5細胞/mLで最終的な細胞濃度を達成します。 注:48ウェルプレートは、最大1 mLの媒体/ウェルを保持することができます。24ウェルプレートは、最大2 mL培地/ウェルを保持することができます。12ウェルプレートは最大4 mL培地/ウェルを保持でき、6ウェルプレートは最大8 mL培地/ウェルを保持できます。</li>
	<li>流量サイトメトリー解析、TIDE分析、および接合PCRなどのダウンストリーム解析を実行する前に、少なくとも5日間は、操作した細胞を拡張できます。</li>
</ol>

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</ol>

ゲノム編集されたB細胞をM.J.J、K.L.、B.S..Mを発明者として作り、使用する方法に関する特許が出願されています。B.S.Mは、Immusoft Inc.の株式のコンサルタントであり、B.S..Mの研究室で研究を後援しています。

原発ヒトB細胞における精密ゲノム工学は最近9,10まで挑戦されてきた。我々は以前にCRISPR /Cas9を使用して主要なヒトB細胞9を設計するプロトコルを公開していた。ここでは、CD19の効率的なKOまたはノックインEGFPを可能にするB細胞の分離、拡張、およびエンジニアリングのための改良されたプロトコルの概要を説明します。
ここでは、当社の拡張プロトコルにより、培養中のB細胞を7日間で最大44倍に拡大することが可能であることを示します(図1)。このプロトコルは、ジョンソンら9およびHung et al.10で報告されたものよりも速い膨張率を示し、1次B細胞の健全かつ迅速な増殖を確実にするための重要なステップは、2日ごとに新鮮な活性化因子を培地に...

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球系統のサブグループである。彼らは免疫課題に応答して大量の抗体を産生することによって適応体性免疫系において重要な役割を果たす1.B細胞はまた、メモリB細胞および末期分化された、長命の形質細胞の前駆体であり、それによって持続性の液性免疫2を提供する。特に、形質細胞は、何年も何十年も生存しながら特定の抗体を大量に産生する能力において、免疫細胞の中でユニークである3。さらに、末梢血からの分離の容易さは、B細胞系統を新しい細胞ベース療法の優れた候補にする4.
これまで、レンチウイルスベクターや眠れる森の美女トランスポゾンを用いたようなランダムな統合方法は、トランスジーン送達および発現5、6、7、8のB細胞を設計するために使用されてきた。しかし、これらのアプローチの非特異的な性質は、B細胞における特定の遺伝子の生物学的機能を研究することを困難にし、治療環境における挿入突然変異誘発および可変トランスジーン発現および/またはサイレンシングの固有のリスクを伴う。
CRISPR/Cas9システムは、研究者が多くの種の様々な細胞のゲノムを正確に編集することを可能にする強力なゲノム工学ツールです。最近、我々を含む2つのグループは、初原ヒトB細胞9,10のex vivo拡張および標的ゲノム工学の方法の開発に成功している。白血病サンプルから初等ヒトB細胞を精製するプロセスについて説明する。その後、B細胞拡張および単離されたB細胞の活性化のための我々の更新されたプロトコルを説明する。次に、特異的B細胞受容体およびB細胞の特徴である分化19(CD19)のクラスターをノックアウトするプロセスを、活性化B細胞にCRISPR/Cas9 mRNAと共に導入するエレクトロポレーションによって説明する。
Cas9 mRNAは翻訳され、CD19 sgRNAに結合してCRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体(RNP)を形成します。続いて、複合体中のsgRNAはCas9を導き、遺伝子のエキソン2上の標的配列で二本鎖破断(DSB)を作成する。細胞はヌクレオチドを導入または削除することによって「非相同端結合」によってDSBを修復し、フレームシフト突然変異を引き起こし、遺伝子をノックアウトさせる。次に、フローサイトメトリーによるCD19の損失を測定し、分解(TIDE)解析によるインデルの追跡によりインデル形成を解析します。
次に、CRISPR/Cas9を組換えAAV6ベクター(相同性特異的修復(HDR)のドナーテンプレート)と共に使用し、アデノ関連ウイルスインテグレーションサイト1(AAVS1)遺伝子で強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の部位特異的挿入を仲介するプロセスについて説明する。AAVS1遺伝子は、既知の生物学的機能を持たない活性な遺伝子であり、ヒトゲノム上のAAVウイルス集積部位である。したがって、ゲノム工学の「安全な港」と考えられています。ここでは、B細胞の拡張と活性化により、培養7日間で最大44倍の拡張が可能であることを報告する(図1)。B細胞のエレクトロポレーションは、トランスフェクション後24時間で全体的な細胞健康(図2A)のわずかな減少を示した。CD19マーカーの散布図分析(図2B)は、編集されたセルの83%の減少を示した(図2C)。
クロマトグラフのTIDE分析(図3A)は、インデル%がフローサイトメトリーによる%タンパク質損失と類似していることを明らかにした(図3B)。KI実験のフローサイトメトリー分析は、AAVベクターを受けた細胞(図4)をRNPとともに、最大64%のEGFP陽性細胞(図5A)まで発現し、後に接合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による積分化に成功したことを示した(図5B)。細胞数は、すべてのサンプルがエンジニアリング後3日以内に迅速に回復したことを示した(図5C)。

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>Smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap 化学修飾 Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>異なるサイズが利用可能</td></tr><tr><td>クライオスター CS10、100 mL</td><td>STEMCELL テクノロジー</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS 免疫細胞 SR</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト B 細胞分離キット</td><td>STEMCELL テクノロジー</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 固定生存率染料 eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B細胞培地、Xeno-free</td><td>R&D Systems</td><td>CCM031</td><td>B細胞基礎培地</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>コーニング</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>R&D Systems</td><td>S11550</td><td>B細胞の解凍のみ</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>ロンザ 4D Nucleofector X unit</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>メガ CD40 リガンド</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>細胞凍結用</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 反ヒト CD19 クローン HIB19</td><td>バイオレジェンド</td><td>302228</td><td>小さいサイズも利用可能</td></tr>です <tr><td>rAAV6 SA-GFP パッケージ (当社の SA-GFP カセットを使用) 図 4 を参照)。</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>大規模包装、1e13 GC/mL、500 mL</td></tr><tr><td>組換えヒト IL-10 タンパク質 250 ug</td><td>R&D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>さまざまなサイズが利用可能</td></tr><tr><td>組換えヒト IL-15 タンパク質 25 ug</td><td>R&D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>異なるサイズが利用可能</td></tr><tr><td>Big Easy EasySep</td><td>Magnet STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>異なるサイズが利用可能</td></tr><tr><td>Tris-EDTA(TE)バッファ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ックBP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9を用いた初等ヒトb細胞のゲノム工学

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球であり、適応免疫系の体液性アームの重要な構成要素である。彼らは、末梢血からの隔離の容易さ、インビトロでの拡大能力、および生体内での長寿のために、細胞ベースの治療法の魅力的な候補を作ります。また、その通常の生物学的機能は、大量の抗体を産生する—感染と闘う組換え抗体や、エンジモパシーの治療のための酵素など、非常に大量の治療タンパク質を発現するために利用することができる。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)から初代ヒトB細胞を単離し、インビトロで単離されたB細胞を活性化/拡大するための詳細な方法を提供する。次に、B細胞内因性遺伝子の部位特異的KOにCRISPR/Cas9システムを用いたステップを実証する。この方法は、様々な遺伝子の効率的なKOを可能にし、目的の遺伝子の生物学的機能を研究するために使用することができる。次に、B細胞におけるトランスジーン発現カセットの効率的な部位特異的な統合のための組換え、アデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターと共にCRISPR/Cas9システムを使用するためのステップを示す。このプロトコルは、遺伝子の生物学的機能を研究し、B細胞治療薬の開発のために、一次ヒトB細胞で使用できるステップバイステップのエンジニアリングプラットフォームを提供します。

更新された拡張および活性化プロトコルにより、7日間でB細胞の急速な拡張が最大44倍になりました(図1;n =3ドナー)。KO実験では、トリパンブルー染色を用いたB細胞数は、24時間のポストエレクトロポレーションでの対照およびCD19 KOサンプルの両方で細胞回収のわずかな減少を伴う80%以上の生存細胞を示した(図2A;p≥0.05、n=3ドナー)。この結果は、エレクトロポレーションが全体的なB細胞の健康にわずかに影響を与えたことを示しています。B細胞を、流動サイトメトリーおよびTIDE分析のためにトランスフェクション後5日目に採取した。対照およびKOサンプルの代表的な散布図は、それぞれ14%および95%のCD19陰性細胞を示した(図2B)。フロープロットの定量は、コントロールと比較した場合にKOサンプル中のCD19発現の有意な減少を示した(図2B;p≤0.0001、n=3ドナー)。ゲノムシーケンシング...

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

このプロトコルにより、研究者はB細胞内の遺伝子を正確に排除して、その遺伝子の機能喪失効果を研究したり、研究や治療目的に使用できる安定したトランス遺伝子発現のためのトランス遺伝子を挿入したりできます。この方法の主な利点は、B細胞を高効率で簡単かつ正確に操作できるユニバーサルプラットフォームを提供することです。この方法は、B細胞を操作して組換え抗体または酵素を発現させ、それらのB細胞を感染症の治療や酵素腫発に移植するために使用できます。まず、B細胞を摂氏37度の水浴で解凍します。待っている間に、2ミリリットルの予熱したFBSを滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移します。B細胞が完全に解凍されたら、すぐに1ミリリットルの予熱したFBSをサンプルに滴下します。室温で1分間インキュベートします。静かにピペットでサンプルを再懸濁し、全量を滴下して、2ミリリットルの予熱FBSを含む円錐形のチューブに移します。滅菌PBSで容量を15ミリリットルにしてから、チューブにキャップをして2〜3回静かに反転させます。サンプルをGの400倍で5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄します。ペレットを1ミリリットルの平衡化済みB細胞増殖培地で再懸濁し、細胞をカウントします。合計セル番号は、約 10 から 7 番目のセルまでである必要があります。細胞を20ミリリットルの予め平衡化したB細胞増殖培地を含むフラスコに移します。細胞の最終濃度は、ミリリットル当たりの約5×10〜第5細胞であるべきである。フラスコを組織培養インキュベーターで垂直にインキュベートします。トランスフェクション反応ごとに1マイクログラムの化学修飾sgRNAと1.5マイクログラムの化学修飾化膿連鎖球菌Cas9核mRNAを混合することにより、CRISPR/Cas9トランスフェクション基質を調製します。制御のために、sgRNAの代わりに1マイクロリットルのTEバッファーを8チューブストリップの0.2ミリリットルチューブに追加します。エレクトロポレーターの電源を入れ、核感染試薬を調製します。トランスフェクション反応ごとに100万個のB細胞をカウントし、滅菌コニカルチューブに移します。滅菌PBSで容量を15ミリリットルにし、Gの400倍で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。10ミリリットルの滅菌PBSで細胞を再懸濁し、Gの400倍で5分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱さずに上清を完全に廃棄します。B細胞100万個あたり0.5マイクログラムの化学修飾GFP mRNAを細胞ペレットに加えます。B細胞100万個あたり20マイクロリットルの初代細胞トランスフェクション試薬でペレットを再懸濁し、5〜6回ピペッティングして穏やかに混合します。トランスフェクション反応ごとに20.5マイクロリットルをCRISPR/Cas9試薬を含む0.2ミリリットルのチューブに移します。ピペットを一度上下に動かして、全量を混合し、トランスフェクションキュベットに移します。ベンチのキュベットにキャップをして軽くたたいて、液体がキュベットの底を覆うようにします。トランスフェクションには、エレクトロポレーターでヒト初代B細胞プロトコルを使用します。エレクトロポレーションされたセルをキュベット内で室温で15分間休ませます。次に、80マイクロリットルの予め平衡化したB細胞増殖培地をキュベット内のトランスフェクション反応に移します。キュベットを組織培養インキュベーターに30分間置きます。ヘッドを数回静かにパイプでつなぎ、キュベットからサンプルの全量を混合し、1ミリリットルのB細胞増殖培地を含む48ウェル組織培養プレートの適切なウェルに移します。細胞の最終濃度は、ミリリットルあたり100万個の細胞である必要があります。遺伝子ノックイン実験を行い、500, 000の感染多重度で組換えアデノ関連6型ウイルスベクターをエレクトロポレーション細胞を含む適切なウェルに移します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の湿度にある組織培養インキュベーターに置きます。ノックアウト実験では、B細胞数は80%を超える生存細胞を示し、エレクトロポレーションの24時間後にコントロールサンプルとCD19ノックアウトサンプルの両方で細胞回収率がわずかに減少しました。トランスフェクション後5日目にB細胞を採取し、フローサイトメトリーおよび潮汐解析を行いました。対照サンプルとノックアウトサンプルの代表的な散布図では、それぞれ14個および95%のCD19陰性細胞が示され、ノックアウトサンプルにおけるCD19発現の有意な減少が示されました。ゲノムシーケンシングのクロマトグラムでは、CD19ノックアウトB細胞にダブルピークが示され、CRISPR/Cas9を介した二本鎖切断後のヌクレオチドの挿入または欠失が示されました。ノックアウトサンプルのクロマトグラフのインデル分析では、CD19遺伝子座でのインデル形成の割合が高いことが示され、これはフローサイトメトリーによって検出されるCD19タンパク質の損失の割合と一致しています。ノックイン実験のB細胞は、エンジニアリング後の12日目に収集されました。散布図では、組換えアデノ関連6型ウイルスベクターをRNPとともに投与されたサンプル中のEGFP陽性細胞の64%が示されましたが、対照サンプルとベクターのみのサンプルでは、それぞれEGFP陽性が観察されなかったか、最小限でした。ジャンクションPCR増幅では、ノックインサンプル中に1.5 kgbaseペアのアンプリコンが示され、コントロールサンプルまたはベクターのみのサンプルいずれにもPCR産物は観察されませんでした。細胞数から、エンジニアリングプロセスは、コントロールサンプルやベクターのみのサンプルよりもノックインサンプルの細胞回収率に大きく影響することが示されました。しかし、すべてのサンプルはエンジニアリング後3日以内にすぐに回復しました。この手順は、B細胞ゲノムの単一点突然変異を誘導または修正するために、単一塩基対を変更するための塩基エディタエージェントを導入するためにも使用できます。また、早期の終止コドンの導入やスプライス部位の変更にも使用でき、染色体転座のリスクなしに複数の遺伝子ノックアウトが可能になります。この技術が開発される前は、ヒトB細胞のエンジニアリングには、他のより困難な遺伝子エンジニアリングアプローチの使用が求められていました。この手法は、より簡単で、より安価で、より迅速な代替手段です。また、臨床使用のための細胞治療製品の合成にも使用できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニア リングする強力な技術です。ここでは、我々 は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々...

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

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大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

学ぶCRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学。電気穿孔法で遺伝子ノックアウトとノックインを実現し、CD19発現95%以上の低下を確認。B細胞生物学と治療薬開発の研究に応用可能。

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

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