Name: Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a establecer una cocultura de neuronas ganglionares retinales axotomizadas con glía envolvente olfativa para evaluar la regeneración axonal en adultos. Este modelo cuantitativo permite estudiar la capacidad neuroregenerativa de la GEO como terapia celular.

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Este trabajo contó con el apoyo financiero del proyecto SAF2017-82736-C2-1-R del Ministerio de Ciencia e Innovación a MTM-F y de la Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.

NOTA: La experimentación con animales fue aprobada por comités nacionales e institucionales de bioética.
1. ihOEG (Ts12 y Ts14) cultura
NOTA: Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejidos.
<ol><li>Preparar 50 mL ME10 Medio de cultivo OEG según lo dispuesto en el Cuadro 1.</li>
	<li>Preparar 5 ml de DMEM/F12-FBS, según lo dispuesto en el Cuadro 1,en un tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Caliente ambos medios a 37 °C en un baño de agua limpia, durante 15 minutos.</li>
	<li>Descongelar viales de células Ts12 y Ts14 a 37 °C en un baño de agua limpia.</li>
	<li>Resuspend y agregue células al medio de cultivo DMEM/F12-FBS preparado en el paso 2.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Aspira al sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 500 μL de ME10 medio y resuspend el pellet.</li>
	<li>Prepare un plato de cultivo celular p60 con 3 ml de ME10 y agregue la suspensión celular, en sentido dropwise.</li>
	<li>Muévase para distribuir las celdas uniformemente a través de la placa.</li>
	<li>Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2. NOTA: Después de alcanzar la confluencia, se debe hacer al menos otro pasaje para optimizar las células para la cocultura. Se necesita un 90% de confluencia antes de sembrarlas en las portadas de la cocultura. Un p-60 confluente tiene un número de celda medio de 7 x 105 para Ts14 y 2,5 x 106 para las líneas de celda Ts12. Las líneas celulares Ts12 y Ts14 deben pasarse cada 2-3 días.</li>
</ol>2. Preparación de ihOEG (Ts12 y Ts14) para el ensayo
NOTA: Este paso debe hacerse 24 h antes de la disección y cocultura de RGN.
<ol><li>Tratar 12 mm Ø coverslips con 10 μg / mL poli-L-lisina (PLL) para 1 h. NOTA: Los cubrebotas se pueden dejar durante la noche en la solución PLL.</li>
	<li>Lave las tapas con solución salina de tampón de fosfato (PBS) 1x, tres veces.</li>
	<li>Retire las células Ts12 y Ts14 ihOEG del plato de cultivo celular p60.<ol>
<li>Añadir 4 ml de medio de cultivo DMEM/F12-FBS(Tabla 1)a un tubo cónico de 15 ml. Caliente a 37 °C en un baño de agua limpia.</li>
		<li>Retire el medio de las placas y las células de lavado con 1 ml de 1x PBS-EDTA, una vez.</li>
		<li>Añadir 1 ml de trypsin-EDTA a las células OEG e incubar durante 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
</li>
		<li>Recoger celdas con una pipeta p1000 y transferirlas a medio preparado en el paso 3.1.</li>
		<li>Centrífuga durante 5 min a 200 x g.</li>
		<li>Aspira al sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 1 ml de me10 medio y resuspend el pellet.</li>
		<li>Cuente el número de celda en un hemociclo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semillas 80.000 células Ts14 o 100.000 células Ts12/pozo en las cubiertas en placas de 24 pozos en 500 μL de medio ME10.</li>
	<li>Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2,para 24 h.</li>
</ol>3. Disección del tejido retiniano
NOTA: Las ratas Wistar macho de 2 meses de edad se utilizan como fuente RGN. Dos retinas (una rata) para 20 pozos de un plato de 24 bien celulares. Autoclave material quirúrgico antes de su uso. Papain kit de disociación se compra comercialmente (Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del proveedor para la reconstitución. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfonovalerico (APV) en stock de 5 mM y preparar las alícuotas.
<ol><li>El día del ensayo, prepare los siguientes medios.<ol>
<li>Prepare un plato de cultivo celular p60 con 5 ml de EBSS frío (vial 1 del kit de disociación de papaína).</li>
		<li>Prepare un plato de cultivo celular p60 con el vial reconstituido 2 (papaína) del kit de disociación de papaína más 50 μL de APV.  A continuación, añadir 250 μL de vial 3 (DNase más 5 μL de APV).</li>
		<li>En una mezcla de tubo estéril 2,7 ml del vial 1 con 300 μL del vial 4 (inhibidor de la proteasa albúmina-ovomucoide). Añadir 150 μL del vial 3 (DNase) más 30 μL de APV.</li>
		<li>Preparar 20 ml de medio Neurobasal-B27 (NB-B27) según lo dispuesto en el Cuadro 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrificar una rata por asfixia con CO2.</li>
	<li>Retire la cabeza por decapitación con guillotina; colocarlo en una placa Petri de 100 mm y rociar la cabeza con etanol al 70% antes de colocarla en una campana de flujo laminar.</li>
	<li>Corta los bigotes de la rata con tijeras para que no interfieran con la manipulación ocular.</li>
	<li>Sujete el nervio óptico con fórceps para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión a través del ojo con un bisturí.</li>
	<li>Retire la lente y el humor vítreo y extraiga la retina (tejido anaranjado), mientras que las capas restantes del ojo permanecen dentro (incluida la capa epitelial pigmentaria).</li>
	<li>Coloque la retina en el plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.1.</li>
	<li>Transfiera la retina al plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.2 y córtalo con el bisturí en trozos pequeños de un tamaño aproximado < 1 mm.</li>
	<li>Transferir a un tubo de plástico de 15 ml.</li>
	<li>Incubar el tejido durante 30 min, en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% CO2,con agitación cada 10 min.</li>
	<li>Disociar los grupos celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta pasteur de vidrio.</li>
	<li>Centrífuga la suspensión celular a 200 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante e inactive la papaína, resuspend el pellet celular en la solución preparada en el paso 3.1.3. (1,5 ml para 2 ojos).</li>
	<li>Entuba cuidadosamente esta suspensión celular en 5 ml de vial reconstituido 4.</li>
	<li>Centrífuga a 200 x g durante 5 min.</li>
	<li>Mientras centrifuga, retire completamente el medio ME-10 de la placa de células de pozo OEG 24 (previamente preparado en el paso 2) y reemplácelo por 500 μL de medio NB-B27 por pozo.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 2 ml de medio NB-B27.</li>
	<li>Placa 100 μL de suspensión de células retinianas, por pozo de la placa m24, sobre monocapas-coverslips PLL o OEG.</li>
	<li>Mantenga los cultivos a 37 °C con un 5% de CO2 para 96 h en el medio NB-B27.</li>
</ol>4. Inmunodetención
<ol><li>Después de 96 h, fije las células durante 10 minutos añadiendo el mismo volumen de 4% paraformaldehído (PFA) en 1x PBS al medio de cultivo (600 μL) (concentración final de PFA 2%).</li>
	<li>Retire el soporte y el PFA de la placa de 24 multipopos y agregue una vez más 500 μL de paraformaldehído (PFA) del 4% en 1x PBS. Incubar durante 10 minutos.</li>
	<li>Deseche el fijador y lave 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Bloquee con 0.1% Tritón X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) durante 30-40 min.</li>
	<li>Prepare los anticuerpos primarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: SMI31 (contra proteínas MAP1B y NF-H) anticuerpo monoclonal (1:500). 514 (reconoce las proteínas MAP2A y B) antísero policlonal del conejo (1:400).</li>
	<li>Agregue anticuerpos primarios a las coculturas e incuba durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, deseche los anticuerpos y lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 min.</li>
	<li>Prepare los anticuerpos secundarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: Para SMI-31, Alexa Fluor 488 anti-ratón (1:500). Para 514, alexa-594 anti-conejo (1:500).</li>
	<li>Incubar células con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes durante 1 h, en RT, en la oscuridad.</li>
	<li>Lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 minutos, en la oscuridad.</li>
	<li>Por último, monte las cubiertas con medio de montaje(Tabla de materiales)y manténgalas a 4 °C. NOTA: Siempre que sea necesario, se pueden realizar manchas de núcleos fluorescentes con DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Antes de montar, incubar las células durante 10 minutos en la oscuridad con DAPI (10 μg/mL en 1x PBS). Lave las cubiertas 3 veces con 1x PBS y, finalmente, monte las tapas con el medio de montaje.</li>
</ol>5. Cuantificación de la regeneración axonal
NOTA: Las muestras se cuantifican bajo el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia. Un mínimo de 30 imágenes deben tomarse en campos aleatorios, con al menos 200 neuronas, que se cuantificarán para cada tratamiento. Cada experimento debe repetirse un mínimo de tres veces.
<ol><li>Cuantificar el porcentaje de neuronas con axón (neurite positivo SMI31) en relación con la población total de RGNs (identificado con MAP2A/B 514 inmunodetención positiva del cuerpo neuronal y dendritas).</li>
	<li>Cuantificar el índice de regeneración axonal o la longitud axonal media (μm/neurona). Este parámetro se define como la suma de las longitudes (en μm) de todos los axones identificados, divididos por el número total de neuronas contadas, presenten o no un axón. La longitud axonal se determina utilizando el plugin NeuronJ del software de imagen ImageJ (NIH-USA).</li>
	<li>Calcule la media, la desviación estándar y la significación estadística utilizando el software adecuado.</li>
</ol>

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<li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms%3A+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li>
<li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity%3A+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El trasplante de OEG en los sitios de lesiones del SNC se considera una terapia prometedora para la lesión del SNC debido a sus propiedades pro-neurorregenerativas constitutivas7,8,9. Sin embargo, dependiendo de la fuente de tejido —mucosa olfativa (OM-OEG) frente a bulbo olfativo (OB-OEG)— o la edad del donante, existe una variación considerable en dicha capacidad26,31,...

Las neuronas del sistema nervioso central adulto (SNC) tienen una capacidad regenerativa limitada después de una lesión o enfermedad. Una estrategia común para promover la regeneración del SNC es el trasplante, en el sitio de lesiones, de tipos celulares que inducen el crecimiento axonal como células madre, células Schwann, astrocitos o células olfativas de glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva de la cresta neural6 y se encuentra en la mucosa olfativa y en la bombilla olfativa. En el adulto, las neuronas sensoriales olfativas mueren regularmente como resultado de la exposición ambiental y son reemplazadas por neuronas recientemente diferenciadas. OEG rodea y guía estos nuevos axones olfativos para entrar en la bombilla olfativa y establecer nuevas sinapsis con sus objetivos en el CNS7. Debido a estos atributos fisiológicos, OEG se ha utilizado en modelos de lesión del SNC como lesión de la médula espinal o del nervio óptico y sus propiedades neurorregenerativas y neuroprotectoras se convierten en probadas8,9,10,11. Varios factores han sido identificados como responsables de las características pro-regenerativas de estas células, incluyendo la producción de proteasas de matriz extracelular o la secreción de factores de crecimiento neurotróficos y axoales12,13,14.
Dadas las limitaciones técnicas para ampliar las células OEG primarias, previamente establecimos y caracterizamos líneas clonales OEG humanas inmortalizadas reversibles (ihOEG), que proporcionan un suministro ilimitado de OEG homogéneo. Estas células ihOEG derivan de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias. Fueron inmortalizados por la transducción de la subunidad catalítica de telomerasa (TERT) y el oncogeno Bmi-1 y modificados con el antígeno T grande del virus SV4015,16,17,18. Dos de estas líneas celulares ihOEG son Ts14, que mantiene la capacidad regenerativa de las culturas originales y Ts12, una línea regenerativa baja que se utiliza como un control de baja regeneración en estos experimentos18.
Para evaluar la capacidad de OEG para fomentar la regeneración axonal después de una lesión neuronal, se han implementado varios modelos in vitro. En estos modelos, la OEG se aplica a cultivos de diferente origen neuronal y se afirma la formación y elongación de neuritas, en respuesta a la cocultura glial. Ejemplos de tales fuentes neuronales son las neuronas corticales de rata neonatal19,heridas de arañazos realizadas en neuronas embrionarias de rata del tejido cortical20,explantas retinianas de rata21,neuronas posnatales hipotalales o hipocampales de rata22,23, post Rata dorsal raíz dorsal neuronas24,corticospoinal ratón postnatal neuronas del tracto corticospinal25,neuronas NT2 humanas26,o neuronas corticales cerebrales postnatal en cultivos reactivos similares a cicatrices de astrocitos27.
En estos modelos, sin embargo, el ensayo de regeneración se basa en neuronas embrionarias o postnatales, que tienen una plasticidad intrínsefica que está ausente en las neuronas adultas lesionadas. Para superar este inconveniente, presentamos un modelo de regeneración axonal adulta en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinales adultas (RGNs), basada en la desarrollada originalmente por Wigley et al.28,29,30,31 y modificada y utilizada por nuestro grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Brevemente, el tejido retiniano se extrae de ratas adultas y se digiere con papaína. A continuación, la suspensión de células retinianas se coloca en los cubrecochetas tratados con poli lisina o en las monocapas Ts14 y Ts12. Los cultivos se mantienen durante 96 h antes de que se arreglen y luego se realiza inmunofluorescencia para las proteínas axonal (MAP1B y NF-H)34 y somatodendritica (MAP2A y B)35 marcadores. La regeneración axonal se cuantifica como un porcentaje de neuronas con axón, con respecto a la población total de RGNs y el índice de regeneración axonal se calcula como la longitud axonal media por neurona. Este protocolo no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, sino que se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.

<table><tbody><tr><td>anticuerpo 514</td><td>Referencia 34</td><td></td><td>Antisuero policlonal de conejo, que reconoce MAP2A y B.</td></tr><tr><td>anticuerpo SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Anticuerpo monoclonal contra las proteínas MAP1B y NF-H</td></tr><tr><td>anti-ratón Anticuerpo Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo Alexa Anticuerpo Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ácido D,L-2-amino-5-fosfonovalérico</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>Inhibidor del receptor NMDA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Núcleos tinción fluorescente</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 11573397</td><td></td><td>Suero fetal bovino</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone Fisher</td> Scientific <td>16291082</td><td>Suero fetal bovino</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH-USA)</td><td></td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Medio de cultivo de células neuronales</td></tr><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Para uso en el aislamiento de células neuronales</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Bacteriostático y bactericida</td></tr><tr><td>Extracto de hipófisis</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Bovino Extracto de hipófisis</td></tr><tr><td>Poli -L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Las células olfativas ensheathing glia (OEG) se localizan desde la mucosa olfativa hasta la capa nerviosa olfativa (ONL) de la bombilla olfativa. A lo largo de la vida adulta, son clave para el cultivo axonal de neuronas olfativas recién generadas, desde la lamina propria hasta la ONL. Debido a sus propiedades pro-regenerativas, estas células se han utilizado para fomentar la regeneración axonal en modelos de lesión de la médula espinal o del nervio óptico.
Presentamos un modelo in vitro para adormecer y medir la capacidad neurorregenerativa de OEG después de una lesión neuronal. En este modelo, el OEG humano increíblemente inmortalizado (ihOEG) se cultiva como una monocapa, las retinas se extraen de ratas adultas y las neuronas ganglionas retinianas (RGN) se coculan en la monocapa OEG. Después de las 96 h, los marcadores axonal y somatodendritico en RGNs son analizados por inmunofluorescencia y se cuantifica el número de RGNs con axón y la longitud/neurona axonal media.
Este protocolo tiene la ventaja sobre otros ensayos in vitro que se basan en neuronas embrionarias o postnatal, que evalúa las propiedades neurorregenerativas OEG en el tejido adulto. Además, no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, pero se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.

En este protocolo, presentamos un modelo in vitro para augur la capacidad neurorregenerativa OEG después de una lesión neuronal. Como se muestra en la Figura 1,la fuente OEG es una línea celular clonal OEG humana inmortalizada reversible -Ts14 y Ts12-, que deriva de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias15,17,18. El tejido retiniano se extrae de ratas a...

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Nuestro protocolo es un modelo sencillo y reproducible para evaluar la capacidad de envoltura olfativa para favorecer la regeneración axonal adulta. Se trata de una técnica cuantitativa que permite evaluar la capacidad regenerativa de la glía envolvente olfativa que también puede extenderse a otros tipos de células gliales. Esta técnica es el primer paso para estudiar la glía envolvente olfativa como candidata a terapia celular en lesiones del sistema nervioso antes de su traslación a estudios in vivo o clínicos. La demostración del procedimiento estará a cargo de María Portela, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio.Para comenzar, prepare todos los medios requeridos como se describe en el manuscrito de texto. Después de sacrificar la rata, coloque su cabeza en una placa de Petri de 100 mililitros y rocíela con etanol al 70% antes de colocarla en una campana de flujo laminar. Corta los bigotes de la rata con unas tijeras para que no interfieran con la manipulación del ojo.Agarre el nervio óptico con pinzas para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión en el ojo con un bisturí. Retire el cristalino y el humor vítreo y extraiga la retina, mante

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

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Investigación

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Neurociencia

En este protocolo, que describe un nuevo método para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales en el crecimiento del axón con...

Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Este video muestra el procedimiento para aislar neuronas ganglionares de la retina (RGNs) de la retina de una rata y cocultivarlas con células de glía de envoltura olfativa (OEG). Este método permite estudiar el potencial neuro-regenerativo de los OEG después de una lesión neuronal.

Coculturación de neuronas ganglionares de la retina con glía de envoltura olfativa

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Fuente: Cheah, M., et al. Inyección de ganglios de la raíz dorsal y lesión por aplastamiento de la raíz dorsal como modelo para la regeneración sensorial de axones. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un procedimiento paso a paso para inyectar una suspensión viral en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) e inducir una lesión axonal controlada a través de un aplastamiento de la raíz dorsal en una rata anestesiada. El protocolo implica exponer los DRG, administrar un vector viral promotor del...

Modelado de la regeneración sensorial de axones en una rata mediante la inyección de ganglios de la raíz dorsal y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones...

Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Este protocolo presenta el uso de una inyección de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión concurrente por aplastamiento de la raíz dorsal en una rata adulta como modelo para estudiar la regeneración sensorial de los axones. Este modelo es adecuado para investigar el uso de la terapia génica para promover la regeneración sensorial de los axones.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Aprende a establecer una cocultura de neuronas ganglionares retinales axotomizadas con glía envolvente olfativa para evaluar la regeneración axonal en adultos. Este modelo cuantitativo permite estudiar la capacidad neuroregenerativa de la GEO como terapia celular.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta (Video) | JoVE Journal

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

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