Un Método De Perfusión Anterógrada Para El Aislamiento De Cardiomiocitos De Ratones

Desarrollamos un método langendorff-libre simple para aislar las células individuales del corazón del ratón por una técnica de empaquetado anterógrada. Este método permite el aislamiento de las células del corazón de ratones juveniles a ratones mayores. La perfusión retrógrada basada en Langendorff ha sido considerada como un patrón oro para aislar miocitos cardíacos en varios animales de experimentación.

Sin embargo, la canulación de la LTA es técnicamente difícil en ratones debido a su pequeño tamaño. Para la cosecha del corazón de ratón, después de confirmar la eutanasia y afeitar el abdomen, abra la cavidad torácica rápidamente para exponer el corazón y use una pipeta de transferencia de plástico con la punta cortada a aproximadamente el tamaño del corazón para succionar el corazón en la pipeta. Levante la pipeta para crear suficiente espacio para insertar tijeras curvas y use las tijeras para extirpar el corazón del lado dorsal teniendo cuidado de evitar dañar las aurículas.

Inmediatamente, coloque el corazón en un vaso de precipitados de vidrio de 30 mililitros que contenga CIB-EGTA helado durante aproximadamente un minuto. Cuando las contracciones se hayan detenido, coloque el corazón en un plato de cultivo de 35 mililitros que contenga CIB-EGTA helado, y retire el pulmón y otro tejido visible. Coloque el corazón más o menos limpio en un soporte de corazón lleno de un lado de ápice CIB-EGTA frío hacia abajo y coloque el soporte bajo un microscopio estereoscópico.

Retire la grasa y los tejidos conectivos de alrededor de la aorta. Si la longitud de la aorta cortada es demasiado larga, recorte la aorta justo debajo de la arteria braquiocefálica y oriente el corazón para que la superficie anterior esté orientada hacia adelante. Use pinzas para levantar el extremo de la aorta y use una pequeña abrazadera vascular para sujetar la aorta cerca de las aurículas mientras empuja suavemente hacia abajo sobre las aurículas.

Luego coloque el corazón sujeto en una placa de perfusión con el lado anterior hacia arriba e hidrate el corazón con unas gotas de CIB-EGTA. Para la perfusión anterógrada, cargue una jeringa de 20 mililitros que contenga CIB-EGTA precalentado conectada a un tubo de extensión flexible y una aguja de inyección marcada en la bomba de infusión y arranque la bomba a una velocidad de flujo de 0,5 mililitros por minuto. Cuando la aguja y la bomba se hayan llenado, coloque la aguja de inyección en la placa de perfusión con el lado más corto de la forma diagonal en el frente y deslice la aguja hasta que esté tocando el ápice del corazón.

Con cuidado, inserte la aguja cerca del ápice del ventrículo izquierdo en la cámara ventricular sin torcer o separar la aguja de la placa, observando la marca para estimar la profundidad de la inserción de la aguja. Cuando se completa la inserción de la aguja, la sangre debe comenzar a fluir desde la arteria coronaria. Use cinta adhesiva para fijar la aguja de inyección a la placa y aumentar la velocidad de la bomba a un mililitro por minuto.

Si el corazón se perfunde con éxito, el flujo del tampón en el capilar debe ser visible justo debajo del epicardio. Después de dos a tres mililitros de perfusión CIB-EGTA, reemplace el tampón de perfusión con una mezcla de enzimas. Después de que uno a dos mililitros han sido perfundidos, aumentar la velocidad de la bomba a 1.5 mililitros por minuto.

Use una pipeta para eliminar el perfusato acumulado que contiene sangre que fluye del corazón según sea necesario y detenga la perfusión cuando el volumen total de enzima perfundida alcance los 10 mililitros. Al final de la perfusión, transfiera 10 mililitros de mezcla de enzimas de la jeringa a un plato de cultivo de 60 milímetros en una estera calentadora y agregue 20 miligramos de BSA al plato. Gire suavemente el plato para disolver el polvo y retire la aguja de inyección y la abrazadera del corazón.

Retire los ventrículos y las aurículas del corazón y coloque los tejidos en la mezcla de enzimas suplementada con BSA. Para aislar los miocitos ventriculares, use dos pares de pinzas para agarrar el epicardio y tire suavemente de los ventrículos en trozos pequeños. Cuando se hayan generado todos los fragmentos del ventrículo, disperse las células aproximadamente 30 veces con un pipeteo suave y filtre los desechos no digido a través de un colador de celdas de malla de 100 micras en un tubo centrífuga de 15 mililitros.

Después de la centrifugación, resuspend la pelotilla del cardiomyocyte en CIB prewarmed complementado con el calcio y BSA e incuba las células por cinco minutos en 37 grados de centígrado. Al final de la incubación, centrífuga las células de nuevo y resuspend los cardiomiocitos precipitados en un volumen adecuado de solución de resuspensión celular para su mantenimiento a 37 grados centígrados hasta el análisis aguas abajo. Para aislar los miocitos auriculares, transfiera las aurículas a un recipiente de CIB precalentado complementado con calcio y BSA y rasgue las aurículas en pedazos como se ha demostrado.

Utilice una pipeta de 20 microlitros ajustada a 10 microlitros para interrumpir los tejidos mediante pipeteo y recoger las células disociadas por centrifugación. A continuación, resuspend la célula auricular en un volumen apropiado de solución de resuspensión celular. En esta imagen, los miocitos ventriculares recientemente aislados pueden ser observados.

Este procedimiento de aislamiento da lugar a una producción del 70 a 80% de miocitos ventriculares quietos en forma de barra a partir del ocho a los ratones de la semana-viejos 10 en el plazo de áspero cinco horas de aislamiento. La proporción de células viables recién aisladas es menor en ratones mayores de dos años de edad. Los potenciales de acción registrados en los miocitos ventriculares y auriculares son similares a los medidos en células obtenidas por el método basado en Langendorff.

El análisis de inmunotenstenimiento se puede utilizar para evaluar la organización de la estructura sarcomérica de los miocitos ventriculares y la transformación de los fibroblastos cardíacos en miofibroblastos después de la subcultura. El análisis de Western blot se recomienda para determinar la expresión específica de proteínas de interés en las aurículas y ventrículos después del procesamiento. Después de la perfusión con enzimas, las proteínas de las aurículas y ventrículos se pueden homogeneizar fácilmente en el tampón de lisis con fuerza ligera para la extracción de proteínas.

Es importante controlar la dirección y las profundidades de la inserción de la aguja. Al insertar la aguja en el ventrículo izquierdo, tenga cuidado de no perforar el tabique ventricular o penetrar la válvula. Puede cambiar la composición del perfusado dependiendo del propósito del experimento.

Por ejemplo, un detergente complementado con EGTA se puede usar para hacer un andamio del corazón sin células.