Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Todas las proteínas de membrana son objetivos importantes en el descubrimiento de fármacos. La producción a mayor escala de proteínas de membrana sigue siendo un cuello de botella para la realización de estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de proteínas de membrana. Este método se puede utilizar para sintetizar de manera eficiente proteínas de membrana in vitro y para preparar proteoliposomas purificados en poco tiempo con una alta tasa de éxito.

Después de agregar los reactivos apropiados, incluido el plásmido de expresión libre de células para generar una mezcla de reacción de transcripción, mezcle el contenido del tubo mediante una inversión suave o golpeteo y realice un giro rápido en una microcentrífuga. Después del centrifugado, incube la mezcla de reacción de transcripción durante seis horas a 37 grados centígrados, seguido de una mezcla y un paso de centrifugado. Para preparar el tampón de traducción, diluya la solución madre con agua dulce ultrapura.

Para la traducción a pequeña escala, use tazas de diálisis de 100 microlitros lavadas con agua ultrapura para eliminar el glicerol de la membrana de diálisis. Agregue un mililitro de agua ultrapura a un nuevo tubo de 1.5 mililitros e inserte una taza de diálisis a pequeña escala en el tubo. Luego agregue 500 microlitros de agua ultrapura a la taza para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.

Para preparar liposomas, transfiera una solución lipídica que contenga 50 miligramos de lípidos a un matraz de evaporación. Coloque el matraz en un evaporador rotativo para evaporar el solvente. Cuando se haya generado una capa delgada y uniformemente distribuida de lípidos en la superficie del fondo del matraz, transfiera el matraz a un desecador de vacío bajo presión negativa durante la noche para eliminar el solvente por completo.

A la mañana siguiente, retire los matraces del desecador y revise la fina película de lípidos. Añada un mililitro de tampón de traslación al matraz y gírelo para esparcir el tampón sobre la fina película lipídica. Después de cinco minutos, sonique el matraz cambiando el ángulo de vez en cuando para permitir que la solución entre en contacto con toda la superficie de la película lipídica.

Se detiene la sonicación cuando el lípido se ha eliminado por completo del matraz y la suspensión de liposomas se vuelve uniforme. A continuación, transfiera la suspensión de liposomas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Antes de realizar una traducción de proteínas in vitro, haga flotar un tubo de extracto de germen de trigo desde un almacenamiento de menos 80 grados en agua a temperatura ambiente durante unos minutos para descongelar rápidamente el material.

Al descongelar el extracto, mezcle inmediatamente el contenido del tubo mediante una inversión suave. Luego gire hacia abajo y coloque el tubo sobre hielo. Agregue el extracto de germen de trigo, el ARNm y los liposomas para generar una mezcla de reacción de traducción.

Mezcle el contenido del tubo mediante una inversión suave o golpeteo y realice un giro rápido en una microcentrífuga. Para llevar a cabo una traducción de proteínas in vitro a pequeña escala, extraiga el agua de la taza y el tubo de diálisis a pequeña escala y agregue un mililitro de tampón de traducción al tubo y 300 microlitros a la taza. Tome 60 microlitros de mezcla de reacción de traslación.

Inserte la punta de la pipeta en el tampón de traslación de la copa de diálisis. A continuación, inyecte la mezcla lenta y suavemente. La mezcla de reacción con mayor densidad se hunde espontáneamente hasta el fondo de la taza y forma una capa.

Cubra la taza con una tapa para evitar la evaporación. Para realizar una traslación a gran escala, agregue 22 mililitros de tampón de traslación a un tubo de 25 mililitros y coloque una taza de diálisis de dos mililitros en el tubo. Agregue dos mililitros de tampón de traducción a la copa de diálisis.

Tome 500 microlitros de la mezcla de reacción de traducción, inyecte lenta y suavemente la mezcla en el tampón de traducción en la taza. Incubar las reacciones durante 24 horas a 15 grados centígrados. Al día siguiente, mezcle bien la reacción en la copa de diálisis mediante pipeteo y transfiera las suspensiones brutas de proteoliposomas a nuevos tubos.

Para purificar los proteoliposomas, sedimente el proteoliposoma en las suspensiones crudas por centrificación. A continuación, lave el proteoliposoma resuspendiéndolo en el volumen adecuado de tampón PBS helado tres veces. Después del lavado, vuelva a suspender completamente los gránulos de proteoliposomas en un pequeño volumen de PBS y mida el volumen de la suspensión con una micropipeta.

Luego agregue PBS para ajustar el volumen de la suspensión. Transfiera cada suspensión a un nuevo microtubo. Para configurar un análisis de página SDS, agregue 70 microlitros de agua y 40 microlitros de tampón de muestra de página SDS concentrado en tres tiempos a 10 microlitros de cada suspensión de proteoliposomas.

Coloque un gel de página SDS con un gradiente de cinco a 20% en una cámara de electroforesis. Cargue el gel con dos microlitros del marcador de tamaño de proteína, tres, seis y 12 microlitros de cada muestra de proteoliposoma y 10 microlitros de patrones de albúmina sérica bovina. Después de cargar las muestras, ejecute la electroforesis seguida de una tinción del gel con el tinte Coomassie Brilliant Blue.

Finalmente, decolora el gel en agua caliente agitando suavemente y escanea la imagen del gel. Usando este protocolo, como se ha demostrado, una variedad de proteínas de membrana con tres o más hélices transmembrana se pueden producir fácilmente como proteoliposomas en poco tiempo. En este método de diálisis bicapa, se puede llevar a cabo de manera eficiente un suministro continuo de sustratos y la eliminación del subproducto tanto en la parte superior como en la inferior de la mezcla de reacción durante un largo período de tiempo, lo que conduce a una excelente eficacia de traducción.

El método de diálisis bicapa da como resultado un aumento de cuatro a 10 veces en la productividad en comparación con el uso de los métodos de bicapa o diálisis solos. La recolección de los proteoliposomas sintetizados por centrificación y su purificación parcial con un tampón de lavado acorta en gran medida el proceso de purificación de las proteínas de membrana. Este sistema sin células es fácil de manipular y altamente escalable.

También se puede utilizar para producir proteínas de memoria que son difíciles de expresar con otros métodos. Este método es extremadamente útil para investigaciones y experimentos que utilizan o se dirigen a proteínas de membrana como la proteína antimembrana, la producción de anticuerpos, SPR, Elisa y AlphaScreen.