Caracterización y predicción funcional de bacterias en tejidos ováricos
23 de octubre de 2021
Se realizó la tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del gen arn ribosómico 16S (gen 16S rRNA) con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias composicionales y funcionales de las bacterias se predijeron mediante el uso de BugBase y Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unbserved States (PICRUSt).
Este protocolo está diseñado para descubrir bacterias en los tejidos ováricos y predecir sus funciones. La tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del ARNr 16S, se utilizaron con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias compensatorias y funcionales de las bacterias se predicen mediante el uso de BoPs y la investigación genético-celular de las comunidades mediante la reconstrucción de días no servidos.
Nuestro protocolo tiene como objetivo extraer bacterias de los tejidos ováricos in situ. También se puede utilizar para descubrir bacterias en tumores de cualquier tipo. Las principales ventajas de nuestro protocolo son que es fácil y conveniente, que se puede realizar en casi todos los laboratorios.
También es rápido obtener los resultados. Durante la práctica en el protocolo, es importante excluir cualquier bacteria fuera del sitio de los tejidos tumorales. Por lo tanto, todos los procedimientos en este protocolo deben ser estériles.
Durante la cirugía, separe los ovarios resecados en muestras de tejido de aproximadamente un centímetro de grosor con un par de pinzas estériles nuevas. Evite tocar cualquier otra cosa durante todo el procedimiento. Después de la separación, retire la muestra en un tubo estéril y colóquela en nitrógeno líquido para su transmisión.
Conservar las muestras en menos 80 grados centígrados. Fije los tejidos con formalina y luego incorpóselos con parafina. Este protocolo se puede pausar aquí.
Los tejidos se pueden mantener a temperatura ambiente para una conservación más larga. Para operar pasos adicionales, corte las muestras en secciones seriales de cinco micrómetros. Luego, seque las muestras.
Hacer desparafina y rehidratación a las muestras. Para recuperar el antígeno, se necesita un tratamiento de microondas de 10 minutos en tampón EDTA. Sumerja las muestras en PBS que contiene 0.3% de hidrógeno.
Peroxidar durante 20 minutos para detener la actividad endógena de la peroxidasa. Realizar el anticuerpo EMA en el núcleo LPS, a una concentración de 1 sobre 300. Y mantenerlo durante una noche a cuatro grados centígrados.
Para descubrir la bacteria, emplee un kit de sustrato DAP para detectar la existencia de HRP. Basándose en las instrucciones del fabricante, use polímero HRP, anticuerpo anti-conejo. Use el concentrador de mesa para dejar que los anticuerpos se combinen completamente.
Use PBS para eliminar anticuerpos no peinados. Haga su tinción química de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego enjuague las muestras bajo el agua. Hacer deshidratación a las muestras.
Muestras de trajes mediante firma. E ingrese como muestra utilizando la biblioteca Imaging Pro Plus Prepare según el protocolo del fabricante. Practique el patrón de imprimación, que consiste en las secuencias específicas del gen y las secuencias de nucleótidos salientes del adaptador illumina.
Para amplificar las tasas de natalidad de la región V4 de bacterias 16s en secuencias de genes de ARNr, amplifique la plantilla a partir de la entrada de muestra de ADN mediante el uso de PCR de amplicón. Utilice perlas magnéticas Mag-Bind RxNPure Plus para eliminar la mezcla de reacción del producto de PCR. Realizar amplificación por PCR indexada por segunda vez.
Utilice Agilent 2200 TapeStation para comprobar la biblioteca. Utilice el sistema QuantiFluor dsDNA para cuantificar la biblioteca. Con un ciclo de 600, la celda de flujo estándar v3 produce aproximadamente 100, 000 extremos emparejados.
2 veces 300 base 3. Las bibliotecas se desnormalizan, agrupan y secuencian. Las tasas brutas de cada muestra se filtran sobre la base de la calidad de secuenciación por Trimmomatic.
Las secuencias de imprimación y adaptador deben eliminarse. Las lecturas de secuencia con par y cualidades inferiores a 25 deben acortarse. Analizar el ARNr de 16s mediante el paquete de software QIIME.
Reúna secuencias para formar OTU con un límite de similitud del 97% Para las OTU, la abundancia relativa debe calcularse en cada muestra. Emplee un clasificador bayesiano, que se encuentra en el conjunto de entrenamiento RDP para ordenar todas las secuencias. Con la OTU dada, se asigna a las OTU una clasificación que tiene la mayor coherencia de las secuencias.
Las OTU están alineadas con la base de datos Silva, basándose en una información de grupo de muestra. Realizar la diversidad alfa y el análisis de coordenadas principales basado en UniFrac. Para predecir la presentación relacionada de las características de la bacteria utilice BugBase.
Predecir la composición funcional de un metagenoma en PICRUSt. Con el uso de datos de monitoreo y una base de datos que contiene genomas de referencia, analice las diferentes funciones entre cada grupo con la ayuda del software STAMP. Utilice un software estadístico para calcular el resultado.
La indicación de significación estadística debe establecerse como p menor que 0,05. Calcule los factores de confusión, que incluyen la edad y la paridad, mediante la prueba t de Student. Calcular el estado menopáusica, los antecedentes de hipertensión y diabetes mediante la prueba de Chi cuadrado.
Calcule el número de taxones de bacterias ováricos mediante la prueba U de Mann-Whitney. 16 pacientes se inscribieron en este estudio. BugBase se utilizó para practicar el análisis de metagnomos predichos.
La potencialmente patogenicidad e inmunohistoquímica de los ovarios utilizando anticuerpos antibacterianos LPS. Esta figura muestra la riqueza bacteriana y la diversidad en los grupos de cáncer y control. Revelado por secuenciación de ARNr 16S.
Las cifras son el índice de especies observadas. Índice Chao1, índice ACE, índice shannon, índice Evenness, índice Simpson, respectivamente. La abundancia relativa de phyla y las 12 especies bacterianas más abundantes en las muestras ováricas se muestra en esta figura.
Figura A, B, C y D.Significa la abundancia relativa del panel en los ovarios de las pacientes del grupo control y del grupo de cáncer de ovario. Las abundancias relativas de las doce especies de bacterias más abundantes en los ovarios de las pacientes de control y del grupo de cáncer de ovario. Esto es más común, agrupado usando PCoA y la abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata.
La Figura A muestra los más comunes, que se agruparon utilizando PCoA. PC1 y PC2 se trazan en x y el eje y. El bloque rojo es igual a la muestra en el grupo de cáncer de ovario.
El círculo azul es igual a una muestra en el grupo de control. Las muestras del grupo de cáncer de ovario se pueden separar de otras muestras del grupo de control. La Figura B muestra los más comunes que se agruparon utilizando PCoA.
PC1 y PC2 se trazan en los ejes x e y. El bloque rojo es igual a una muestra en el grupo de cáncer de ovario. El círculo sólido azul es igual a una muestra de la paciente con mioma uterino.
Y el círculo hueco azul es igual a una muestra de una paciente con adenomiosis uterina. La Figura C muestra la abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum. La figura D es Methanosarcina vacuolata.
Esta figura es el análisis de BugBase de la metagenómica predicha. El fenotipo potencialmente patogénico y de tolerancia al estrés oxidativo de los ovarios en el grupo de cáncer fue más fuerte que el del grupo de control. Esta cifra es significativamente diferente del espacio de la ruta KEGG entre los grupos de cáncer y control según el análisis PICRUSt.
Cuando obtenemos nuestras muestras, se necesita un par de pinzas estériles nuevas. Preste atención a la posible contaminación de las muestras. Que las bacterias fuera del sitio de los tejidos tumorales pueden afectar la resolución en gran medida.
Se prefiere establecer el grupo de control en cada paso. Con el fin de reducir el efecto de la contaminación potencial.
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Descripción general
Este protocolo está diseñado para descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Se utiliza tinción de inmunohistoquímica y secuenciación del ARNr 16S para predecir las diferencias composicionales y funcionales de las bacterias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Oncología
- Inmunología
Antecedentes
- Comprender la composición bacteriana en tejidos ováricos puede proporcionar información sobre la biología del cáncer.
- La tinción por inmunohistoquímica permite la visualización de bacterias en muestras de tejido.
- La secuenciación del ARNr 16S es una herramienta potente para identificar especies bacterianas.
- Herramientas predictivas como BugBase y PICRUSt pueden inferir funciones bacterianas basándose en su información genética.
Objetivo del estudio
- Extraer e identificar bacterias de tejidos ováricos.
- Comparar las poblaciones bacterianas en tejidos cancerosos versus no cancerosos.
- Predecir los roles funcionales de las bacterias identificadas.
Métodos Utilizados
- Tinción de inmunohistoquímica para la visualización de tejidos.
- Secuenciación del gen 16S rRNA para la identificación bacteriana.
- BugBase para predecir la composición bacteriana.
- PICRUSt para predecir diferencias funcionales entre bacterias.
Resultados Principales
- Identificación de poblaciones bacterianas distintas en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos.
- Las predicciones funcionales indican diferencias en las capacidades metabólicas entre los dos tipos de tejido.
- El protocolo es adaptable para su uso con diversos tipos de tumores.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un marco para comprender el papel de las bacterias en el cáncer de ovario.
- Los métodos son accesibles y pueden implementarse en la mayoría de los laboratorios.
- Investigaciones futuras podrían explorar las implicaciones de estas comunidades bacterianas en la progresión del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la presencia microbiana en tejidos ováricos responde a una necesidad creciente de reducir riesgos en hipótesis sobre dianas contra el cáncer, al revelar factores del microambiente que podrían influir en la biología tumoral. Este protocolo permite a la I+D de biofármacos evaluar las contribuciones bacterianas a las vías oncogénicas, favoreciendo una comprensión mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. Al proporcionar un método estandarizado para detectar y predecir funcionalmente los microorganismos asociados al tejido, ayuda a priorizar dianas con mayor confianza traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis sobre el microambiente tumoral mediante la identificación de bacterias con abundancia diferencial en tejidos ováricos cancerosos frente a no cancerosos.
- Valor operativo: Utiliza inmunohistoquímica y secuenciación del ARNr 16S para resolver espacialmente y cuantificar la presencia bacteriana in situ.
- Valor predictivo: Emplea BugBase y PICRUSt para inferir fenotipos funcionales, como patogenicidad y tolerancia al estrés oxidativo, asociados a fenotipos cancerosos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera salidas estandarizadas y cuantificables de secuenciación del ARNr 16S adecuadas para el perfilado microbiano comparativo entre grupos de muestras.
- Reproducibilidad: Incorpora controles de contaminación y manipulación estéril de tejidos para garantizar la detección fiable de señales verdaderamente asociadas al tejido.
- Escalabilidad: Compatible con secuenciación de alto rendimiento y tuberías bioinformáticas para una aplicación más amplia en diferentes tipos de tumores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Detecta firmas microbianas en tejidos humanos de cáncer de ovario, lo que respalda su relevancia para la fisiopatología humana.
- Continuidad traslacional: Permite el seguimiento longitudinal de los cambios microbianos desde estados normales hasta estados malignos, aportando información para el descubrimiento de biomarcadores.
- Reducción del riesgo mecanicista: Predice las contribuciones funcionales de los microorganismos (por ejemplo, vías metabólicas) que podrían modular la progresión tumoral o la respuesta terapéutica.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la generación de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, especialmente en programas centrados en inmuno-oncología y en el microentorno.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al revelar si bacterias específicas están enriquecidas en tejidos tumorales y asociadas a fenotipos del cáncer.
- Detección: Proporciona datos cuantitativos reproductibles de perfiles microbianos que pueden integrarse con conjuntos de datos multi-ómicos para la priorización de objetivos.
- Análisis: Ofrece predicciones funcionales mediante BugBase y PICRUSt, permitiendo la comparación de potenciales metabólicos y fenotípicos entre grupos.
- Investigación Traducional: Conecta la detección microbiana con la biología del cáncer mediante inferencia funcional y diferencias en abundancia en tejidos derivados de pacientes.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otros tumores sólidos, lo que permite estudios transversales del microbioma en diferentes tipos de cáncer utilizando un flujo de trabajo estandarizado.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la presencia microbiana con fenotipos funcionales en vías relevantes para el cáncer.
- Valor operativo: Emplea técnicas accesibles (IHQ, secuenciación de 16S, bioinformática) factibles en la mayoría de los laboratorios de investigación.
- Valor estratégico: Informa decisiones de continuar o descartar al identificar factores de confusión microbianos o moduladores de la biología tumoral en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en el portafolio: Permite la selección de dianas ajustada al riesgo al considerar variables del microentorno que podrían afectar la eficacia del fármaco.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, biología molecular y bioinformática para la secuenciación y la predicción funcional.
- Necesita manipulación estéril de tejidos, equipos de PCR, plataformas de secuenciación y herramientas como QIIME, Trimmomatic y STAMP.
- Exige protocolos estandarizados entre sitios para minimizar la contaminación y garantizar la comparabilidad de los datos microbianos.
- Debe tener en cuenta la variabilidad del tejido hospedador y los desafíos derivados de la baja biomasa al aplicarse a otros sistemas orgánicos.
- Limitado por la sensibilidad de detección en comunidades de baja abundancia y la dependencia de bases de datos de referencia para la inferencia funcional.
