Name: Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a fabricar matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos derivados de iPSC humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Este método permite generar casi 1000 esferoides cardíacos contráctiles en placas de 12 pocillos para modelado de enfermedades y desarrollo de fármacos.

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Agradecemos a la Dra. Amanda Chase por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. El apoyo financiero fue proporcionado por el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP) de la Universidad de California, T29FT0380 (D.T.) y 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) y 17MERIT33610009 (J.C.W.); y National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 y NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

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J.C.W. es cofundador de Khloris Biosciences, pero no tiene intereses contrapuestos, ya que el trabajo presentado aquí es completamente independiente. Los otros autores no reportan conflictos.

Para generar microtejidos cardíacos a partir de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CC prediferenciados, es esencial obtener un cultivo altamente puro para un mejor control del número de células después de la compactación celular inhibida por contacto dentro de los microtejidos cardíacos. Recientemente, Giacomelli et. al.18 han demostrado la fabricación de microtejidos cardíacos utilizando iPSC-CMs, iPSC-ECs y iPSC-CFs. Los microtejidos cardíacos generados utilizando el método descrito consisten en ~ 5,000 cé...

El descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades en el campo de la investigación cardiovascular se enfrentan a varios desafíos debido a la falta de muestras clínicamente relevantes y a herramientas traslacionales inadecuadas1. Los modelos preclínicos altamente complejos o los modelos unicelulares in vitro demasiado simplificados no presentan condiciones fisiopatológicas de manera reproducible. Por lo tanto, varias plataformas miniaturizadas de ingeniería tisular han evolucionado para ayudar a cerrar la brecha, con el objetivo de lograr un equilibrio entre la facilidad de aplicación de una manera de alto rendimiento y la recapitulación fiel de la función tisular2,3. Con el advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las herramientas de ingeniería de tejidos se pueden aplicar a células específicas del paciente con o sin estado de enfermedad cardiovascular subyacente para responder a las preguntas de investigación4,5,6. Tales modelos de ingeniería tisular con composición celular similar al tejido cardíaco podrían utilizarse en los esfuerzos de desarrollo de fármacos para probar la cardiotoxicidad y la disfunción inducidas por cambios patológicos en el comportamiento de uno o varios tipos de células.
Los microtejidos u organoides autoensamblados derivados de iPSCs humanas son estructuras tridimensionales (3D) que son ensamblajes en miniatura similares a tejidos que exhiben similitudes funcionales con sus contrapartes in vivo . Existen varios enfoques diferentes que permiten la formación de organoides in situ a través de la diferenciación dirigida de iPSCs o a través de la formación de cuerpos embrionarios4. Los organoides resultantes son una herramienta indispensable para estudiar los procesos morfogenéticos que impulsan la organogénesis. Sin embargo, la presencia de una variedad de poblaciones celulares y las diferencias en la autoorganización pueden conducir a la variabilidad en los resultados entre diferentes organoides5. Alternativamente, las células prediferenciadas que se autoensamblan en microtisajes con tipos de células específicas de tejidos para estudiar las interacciones célula-célula locales son excelentes modelos, donde es factible aislar los componentes autoensamblados. Particularmente en la investigación cardíaca humana, el desarrollo de microtejidos cardíacos 3D con componentes multicelulares ha demostrado ser un desafío cuando las células se derivan de diferentes líneas de pacientes o fuentes comerciales.
Para mejorar nuestra comprensión mecanicista de los comportamientos celulares en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, personalizado, idealmente todos los tipos de células componentes deben derivarse de la misma línea de pacientes. En el contexto de un corazón humano, un modelo cardíaco in vitro verdaderamente representativo capturaría la diafonía entre los tipos de células predominantes, a saber, cardiomiocitos (CM), células endoteliales (CE) y fibroblastos cardíacos (CEF)6,7. La recapitulación fiel de un miocardio no solo requiere estiramiento biofísico y estimulación electrofisiológica, sino también señalización célula-célula que surge del soporte de tipos celulares como las CE y las CEF8. Los CF están involucrados en la síntesis de la matriz extracelular y el mantenimiento de la estructura del tejido; y en estado patológico, los CF pueden inducir fibrosis y alterar la conducción eléctrica en los CM9. Del mismo modo, las CE pueden regular las propiedades contráctiles de los CM a través de la señalización paracrina y el suministro de demandas metabólicas vitales10. Por lo tanto, existe la necesidad de microtejidos cardíacos humanos compuestos por los tres tipos principales de células para permitir que se realicen experimentos de alto rendimiento fisiológicamente relevantes.
Aquí, describimos un enfoque de abajo hacia arriba en la fabricación de microtejidos cardíacos mediante la derivación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (iPSC-CM), células endoteliales derivadas de iPSC (iPSC-EC) y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC (iPSC-CFs) y su cultivo 3D en matrices de microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de generar microtejidos cardíacos que laten espontáneamente se puede utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas rápidas de medicamentos para la comprensión funcional y mecanicista de la fisiología del corazón. Además, tales plataformas de microtejidos cardíacos multicelulares podrían explotarse con técnicas de edición del genoma para emular la progresión de la enfermedad cardíaca a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo crónicas o agudas.

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Micromoldes 3D Microtejidos</td><td></td> Formato <td></td><td>12-81</td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solución de enjuague AutoMACS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9104697</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento menos Insulina</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento más insulina</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel, matriz calificada para hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac Troponina T Anticuerpo</td><td>Miltenyi</td><td>130-120-403</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-857</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD31</td><td>Miltenyi</td><td>130-110-670</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Microperlas</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>DDR2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-81707</td><td></td></tr><tr><td>Kit de apoptosis de células muertas con anexina V FITC y PI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V13242</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa I</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa (4,5 g/L) sin medio de glutamina</td><td></td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>medio basal DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovino suero</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>FibroLife Fibroblasto sin suero Kit LifeFactors</td><td>LifeLIne Cell Technology</td><td>LS-1010</td><td></td></tr><tr><td>Medio RPMI sin glucosa</td><td>Life Technologies</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano-básico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF-165</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Selleckchem</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas de clasificación</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solución madre</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MACS Tampón de enjuague</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medio</td><td>Life Technologies</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO 3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37170</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 10X</td><td>Thermo Fisher Rojo</td><td></td><td></td>científico</tr><tr><td>Vimentina Alexa Fluor&reg; 488-anticuerpo conjugado</td><td>R& D Sistemas IC2105G</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3d utilizando cardiomiocitos humanos derivados de ipsc, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

La generación de cardiomiocitos humanos (CM), fibroblastos cardíacos (CF) y células endoteliales (CE) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha brindado una oportunidad única para estudiar la compleja interacción entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsa el desarrollo de tejidos y la enfermedad. En el área de los modelos de tejido cardíaco, varios enfoques tridimensionales sofisticados (3D) utilizan cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) para imitar la relevancia fisiológica y el entorno del tejido nativo con una combinación de matrices extracelulares y reticulantes. Sin embargo, estos sistemas son complejos de fabricar sin experiencia en microfabricación y requieren varias semanas para autoensamblarse. Lo más importante es que muchos de estos sistemas carecen de células vasculares y fibroblastos cardíacos que constituyen más del 60% de los no miocitos en el corazón humano. Aquí describimos la derivación de los tres tipos de células cardíacas a partir de iPSC para fabricar microtejidos cardíacos. Esta técnica de moldeo de réplica fácil permite el cultivo de microtinue cardíaco en placas de cultivo celular estándar de múltiples pocillos durante varias semanas. La plataforma permite el control definido por el usuario sobre los tamaños de microtejidos en función de la densidad de siembra inicial y requiere menos de 3 días para que el autoensamblaje logre contracciones observables de microtejidos cardíacos. Además, los microtejidos cardíacos se pueden digerir fácilmente mientras se mantiene una alta viabilidad celular para el interrogatorio de una sola célula con el uso de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Prevemos que este modelo in vitro de microtejidos cardíacos ayudará a acelerar los estudios de validación en el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades.

Caracterización de inmunotinción y citometría de flujo de CM, CE y CG derivados de iPSC Para generar microtejidos cardíacos compuestos de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CEF, los tres tipos de células se diferencian y caracterizan individualmente. La diferenciación in vitro de iPSCs a iPSC-CMs ha mejorado en los últimos años. Sin embargo, el rendimiento y la pureza de los iPSC-CM difieren de una línea a otra. El protocolo actual produce más del 75% de iPSC-CM puros que espontáneamente comienzan a lat...

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

El protocolo combina el poder de generar tipos de células cardiovasculares humanas utilizando células madre pluripotentes inducidas y una técnica versátil para generar esferoides cardíacos en menos de 72 horas. Estos esferoides cardíacos se pueden utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas de drogas. Una de las principales ventajas de esta técnica fácil es que se podrían generar casi 1000 esferoides cardíacos en una placa estándar de 12 pocillos.Y lo más importante, todos y cada uno de los esferoides cardíacos se pueden ensayar por su función contráctil utilizando una técnica basada en imágenes. Después de derretir la agarosa en el microondas, colóquela en el gabinete de bioseguridad y deje que se enfríe durante tres minutos. Pipetee 700 microlitros de la agarosa fundida y agréguela al micromoldo de silicona de una matriz de nueve por nueve, teniendo cuidado de evitar generar burbujas.Coloque cuidadosamente el molde en el bloque de hielo prefrío para acelerar la duración de la agarosa. Una vez que la agarosa se vuelve translúcida, doble cuidadosamente los bordes del micromoldo para perder la réplica de agarosa y pelar suavemente la réplica de todos los lados para separarla

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Este protocolo describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda a fabricar matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos derivados de iPSC humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Este método permite generar casi 1000 esferoides cardíacos contráctiles en placas de 12 pocillos para modelado de enfermedades y desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales (Video) | JoVE Journal

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

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