Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Debido a que Thermobia domestica es un insecto basal, los estudios genéticos de esta especie iluminarán los mecanismos subyacentes a la evolución de innovaciones clave en insectos, como el vuelo motorizado y las metamorfosis. Este protocolo cubre técnicas básicas desde el mantenimiento del cultivo hasta la microinyección de huevos para implementar Thermobia como especie modelo de laboratorio. Este método también se puede utilizar para la aplicación de otras herramientas genéticas, como la eliminación de genes mediada por RNI y la transgénesis en termobios.

Mantenga las poblaciones de tipo salvaje y mutantes en un recipiente de plástico grande con comida artificial regular para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y capas de algodón para poner huevos. Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras a 37 grados centígrados y ajuste la humedad relativa dentro de cada recipiente a 60 a 80%Para preparar las colonias de recolección de huevos, transfiera unos 20 machos y 20 hembras adultas a un recipiente de tamaño mediano con comida, un suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos. Establezca varias colonias para obtener una gran cantidad de embriones en etapas en un corto período de tiempo.

El día de la inyección, sustituya el algodón del interior de los envases por algodón nuevo. Ocho horas más tarde, recoja los huevos del algodón en capas separando las capas con pinzas. Alinee los huevos en la cinta adhesiva de doble cara con un pincel húmedo manteniendo una distancia de dos milímetros entre los huevos.

Todos los huevos deben estar orientados de manera que el eje longitudinal de un huevo mire hacia el lado de la inyección. Presione suavemente los huevos con un pincel para que los sujeten firmemente durante la inyección. Cargue dos microlitros de la solución de ARNg CAS9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, golpee la aguja para eliminar las burbujas. Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndola ligeramente con pinzas para evitar obstrucciones y obtener una mayor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones.

Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una pequeña cantidad de la solución. Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, en función de la forma de la punta de la aguja. Mantenga los huevos inyectados en un recipiente de tamaño adecuado con una humedad relativa del 60 al 80% a 37 grados centígrados.

Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados para evitar el crecimiento de hongos. Si crecen demasiados hongos en un huevo, limpie la superficie del huevo con etanol al 70%. Antes de eclosionar, sumerja el portaobjetos de vidrio con los huevos inyectados en polvos de talco para cubrir la superficie de la cinta adhesiva de doble cara.

Esto evitará la acumulación de ninfas eclosionadas. Transfiera los portaobjetos de vidrio con recubrimiento en polvo a un recipiente mediano con comida, agua y papel doblado. Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pocillos con un aspirador o un pincel.

Mantener el suministro de alimento regular artificial para peces. Coloque las placas de 24 pocillos en un recipiente más grande con un suministro de agua para una humedad del 60 al 80%Pellizque y extraiga un cercus de una ninfa o adulto con pinzas y recójalas en un tubo de 0,2 mililitros que contenga 50 microlitros de etanol. Almacene las muestras recolectadas a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.

Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 grados centígrados para evaporar el etanol. La inyección del complejo de ribonucleoproteínas CAS9 de ARNg en embriones dentro de las primeras ocho horas después de la puesta de huevos da como resultado indels en el sitio objetivo del ARNg. Esto provoca mutaciones bialélicas en algunas células de la generación inyectada y se suelen obtener fenotipos de mosaico mutantes.

Cuando se utilizó este protocolo para inyectar un ARNg diseñado para dirigirse al gen blanco, el 32,6% de las ninfas G0 mostraron una pérdida parcial de pigmentación en sus ojos compuestos y regiones dorsales. La evaluación de la transformación de la línea germinal de los adultos G0 y los individuos G1 mutados se realizó mediante PCR genómica seguida de un ensayo de movilidad heterodúplex. En las muestras G1, los patrones de banda diferenciales entre las muestras de tipo salvaje y las mutadas son claramente distinguibles.

La edición del genoma en Thermobia proporciona un enfoque sólido para analizar los mecanismos genéticos que subyacen a los rasgos prematuros de los insectos. Ayuda a explorar los secretos detrás de su extraordinario éxito y el nuestro.