Name: Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende microinyección de óvulos y mantenimiento de colonias para edición genómica en Thermobia domestica. Este protocolo permite generar mutantes y estudiar la evolución de insectos basales.

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To y TD fueron apoyados por los números de subvención JSPS KAKENHI 19H02970 y 20H02999, respectivamente.

1. Mantenimiento de colonias de laboratorio
<ol><li>Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y establezca la humedad relativa (RH) dentro de cada recipiente en 60%-80%. NOTA: Debido a que T. domestica absorbe vapor de agua de la atmósfera11,no se necesita un suministro directo de agua. El RH adecuado se mantiene debido a la presencia de vapor de agua de vasos de plástico que contienen un orificio de ventilación en la parte superior o de tazas sin tapa dentro de cada recipiente. No hay necesidad de humidificar dentro de toda una incubadora que contiene cultivos. La duración aproximada de cada etapa de desarrollo bajo la condición descrita en este protocolo se muestra en la Figura 1. La velocidad de desarrollo podría ajustarse cambiando la temperatura y/o rh12.</li>
	<li>Agregue los alimentos periódicamente. Agregue agua antes de que se seque.</li>
	<li>Transfiera las poblaciones a un nuevo recipiente limpio al menos cada 3 meses, dado que los adultos dejan de poner huevos en un ambiente sucio y/o población densa (ver Discusión).</li>
</ol>2. Recolección de huevos y microinjección
<ol><li>Diseñar un ARN guía (gRNA)<ol>
<li>Diseñe una secuencia de gRNA para cada objetivo necesario y BLAST las secuencias de gRNA en el ensamblaje del genoma para comprobar posibles sitios de reconocimiento fuera de destino.</li>
		<li>Sintetizar y purificar los gRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante8. NOTA: Como ejemplo, en el caso de dirigirse al gen blanco transportador de casete de unión a ATP, se diseñó una secuencia objetivo de 20 bp y se ordenaron dos oligonucleótidos de ADN sintetizados 5'-TAATACACTCACTATAGTAAGTGTTGGTGGGAC-3' y 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCCCCAACACTTA-3'. La plantilla de ADN se preparó recocido estos dos oligonucleótidos seguidos de amplificación de PCR y el gRNA se transcribe in vitro de la plantilla con una polimerasa de ARN T7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparan colonias de recolección de huevo<ol>
<li>Transfiera alrededor de 20 adultos machos y 20 hembras a un recipiente de tamaño mediano (200 mm x 150 mm x 90 mm) con alimentos, suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos(Figura 2B).</li>
		<li>Establecer varias colonias para obtener un gran número de embriones escenificados en un corto período de tiempo para ser utilizados para la edición del genoma. NOTA: Se espera que se recojan entre 20 y 40 huevos de una colonia después de 8 h a 37 °C. Por lo general, los adultos transferidos tardan unos días en empezar a poner huevos, posiblemente debido a la adaptación a un nuevo entorno.</li>
	</ol></li>
	<li>El día de la inyección, reemplace el algodón dentro de los recipientes por otros nuevos.</li>
	<li>Coloque una cinta de doble cara de 76 mm x 5 mm en una tobogán de vidrio normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Ocho horas más tarde, recoge los huevos del algodón en capas separando las capas usando fórceps.</li>
	<li>Alinee los huevos en la cinta de doble cara con un pincel húmedo y mantenga una distancia de 2 mm entre los huevos. Todos los huevos deben estar orientados para que el eje longitudinal de un huevo se enfrente al lado de la inyección(Figura 3A). Presione suavemente los huevos con un pincel para sujetar firmemente durante la inyección. NOTA: En este protocolo, el hongo crece rápidamente en huevos inyectados dañados en condiciones húmedas y cálidas. Es importante mantener la distancia entre los huevos para evitar la contaminación cruzada y la expansión del hongo.</li>
	<li>Mezcle la proteína gRNA y Cas9 a una concentración final de 100 ng/μL y 500 ng/μL, respectivamente. Utilice agua destilada para diluirla. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para promover la formación compleja ribonucleoprotein y luego mantener la mezcla en hielo. NOTA: Rojo neutro a una concentración final del 1% podría añadirse a la solución de inyección para controlar la cantidad inyectada.</li>
	<li>Cargue 2 μL de la solución gRNA/Cas9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, toque la aguja para extraer las burbujas. NOTA: En este experimento, se utiliza una aguja prefabricada para obtener una punta de aguja fina (Figura 3B). En su lugar, se podría utilizar una aguja casera con una forma similar.</li>
	<li>Fijar el capilar de inyección de vidrio, previamente cargado con la solución gRNA/Cas9, a un soporte equipado con un manipulador y conectar el soporte a un microinyector electrónico.</li>
	<li>Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndolo ligeramente con fórceps para evitar obstrucciones y obteniendo una mejor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones (se muestra un ejemplo de una aguja adecuada en la Figura 3C). NOTA: Se recomienda cambiar una aguja cuando está obstruida. Es posible seguir inyectando con la misma aguja si se rompe de nuevo con fórceps, pero una punta más ancha conduce a más daño del huevo y reduce su tasa de supervivencia. Como los huevos T. domestica son blandos y frágiles, mantener una punta fina de aguja es clave para tener una alta tasa de supervivencia después de la inyección.</li>
	<li>Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una ligera cantidad de la solución (consulte la Figura 3D-H como referencia sobre la cantidad de inyección). Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, dependiendo de la forma de la punta de la aguja. NOTA: Se recomienda aplicar una presión constante durante la inyección, de lo contrario el contenido pegajoso del huevo puede fluir fácilmente en la aguja de vidrio y puede obstruirla. La solución puede ser inyectar un pulso de presión corto o con una presión constante, dependiendo de la cantidad de líquido inyectado. Tenga en cuenta que cuando una punta de aguja tiene una abertura amplia, se inyecta demasiada solución en un óvulo, lo que causa letalidad(Figura 3F-H). En ese caso, mantenga un flujo de líquido constante por presión constante, luego inserte la aguja en un huevo y extraiga inmediatamente. Si causa demasiado desbordamiento o el huevo estalla, cambie la aguja.</li>
	<li>Mantenga los huevos inyectados en un recipiente con el tamaño adecuado para el número de huevos inyectados (<20 huevos: plato pequeño; >20 huevos: recipiente de tamaño mediano) con 60%-80% RH y 37 °C.</li>
</ol>3. Apareamiento
<ol><li>Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados con fórceps para evitar el crecimiento fúngico(Figura 3I,J). En caso de que haya demasiado hongo creciendo en un huevo, limpie la superficie del huevo con un 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclosionar (aproximadamente 10 días a 37 °C después de la puesta de huevos), sumerja el vaso con los huevos inyectados en polvo de talco para cubrir la superficie de la cinta de doble cara. Esto evitará el apilamiento de ninfas eclosionadas. Transfiera los toboganes de vidrio recubiertos de polvo a un recipiente de tamaño mediano con alimentos, agua y un papel doblado para ocultar los insectos.</li>
	<li>Retire las diapositivas de vidrio después de que las ninfas hayan eclosionado. Suministran alimentos periódicamente hasta que lleguen a la edad adulta. NOTA: Se tarda aproximadamente 2.0–2.5 meses para que las personas lleguen a la edad adulta después de eclosionar(Figura 1A). La etapa adulta se juzga sobre la base de un ovipositor bien desarrollado en las hembras(Figura 1B).</li>
	<li>Para aparear a los individuos, transfiera tantos como sea necesario a adultos hembras de wildtype de una colonia de laboratorio al contenedor mediano e incubarlos durante al menos 14 días a 37 °C para asegurarse de que son vírgenes. NOTA: No es necesario recoger hembras vírgenes de una colonia de laboratorio porque las T. domestica adultas tienen un ciclo repetido de fundido y apareamiento llamado "ciclo reproductivo y ardiente", durante el cual las hembras tiran espermatozoides con cada muda y se aparean de nuevo en el siguiente ciclo de fertilización13.</li>
	<li>Transfiera un adulto G0 macho o hembra que se desarrolló de un huevo inyectado y un(los) adulto(s) de wildtype a un pequeño plato de plástico (Ø 100 mm x 40 mm) con alimentos, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón para poner huevos G1(Figura 2C';plato de apareamiento). Mantenga los platos de apareamiento en un recipiente más grande con 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Múltiples adultos de wildtype pueden ser incluidos en un plato para aumentar la probabilidad de apareamiento exitoso, aunque se han logrado altas tasas de éxito con emparejamiento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipado
<ol><li>Diseñe pares de imprimación PCR para cada gRNA para amplificar un producto de 100-200 bp que incluye el sitio dirigido por el gRNA. BLAST cada primera secuencia contra el ensamblaje del genoma para comprobar su especificidad (se muestra un ejemplo para la focalización del gen blanco en la Figura 4A).</li>
	<li>Compruebe la transformación germinina de los adultos G0.<ol>
<li>Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos. NOTA: Se recomienda genotipo de al menos 12 ninfas G1 de cada par de acoplamiento para evaluar el éxito de la transmisión de la línea germinográfica (ver Resultados representativos).</li>
		<li>Añadir 15 μL de una solución Proteinasa K de 0,25 mg/ml (disuelta en tampón Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneizar brevemente muestras con palillos de dientes e incubar a 55 °C durante 3 a 16 h.</li>
		<li>Inactive la Proteinasa K colocando las muestras a 95 °C durante 10 min.</li>
		<li>Añadir 90 μL de agua destilada a cada tubo y mezclar bien. Utilice 2 μL de sobrenadante en una mezcla de reacción PCR de 10 μL que contenga las imprimaciones diseñadas en el paso 4.1. NOTA: Se recomienda el uso de una polimerasa de ADN optimizada para plantillas crudas para alcanzar suficiente amplificación de PCR.</li>
		<li>Para analizar los productos PCR, realice un ensayo de movilidad heteroduplex (HMA) con un sistema de electroforesis de microchip(Figura 3B;ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: Las mutaciones podrían evaluarse con dos métodos alternativos: (1) HMA con polímeros de gel estándar, como 8% poliacrilamida14; (2) digestión de productos DEP con endonuclease T7 seguido de electroforesis de gel de agarose15.</li>
		<li>Mantenga sólo las ninfas G1 resultantes de los adultos G0 que contienen mutaciones en su línea germino y deseche las otras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipado individual de ninfas/adultos G1<ol>
<li>Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D'). NOTA: Aunque este paso se puede realizar en cualquier punto de las etapas de ninfas y adultos, se recomienda realizarlo después de llegar a la edad adulta y justo antes del emparejamiento (>2.5 meses después de la inyección; Figura 1B) porque es más fácil mantener los ignífugos en un recipiente grande. Se requiere una cría individual para rastrear el genotipo de cada ninfa G1 en los siguientes pasos. Las ninfas G1 del mismo adulto G0 pueden tener mutaciones diferentes.</li>
		<li>Pellizque y tire de cerci y el filamento caudal de una ninfa/adulto usando fórceps y recogerlos en un tubo de 0,2 ml que contenga 50 μL EtOH (almacene las muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). NOTA: Las muestras de tejido se recogen en etoh porque evita la pérdida de estas pequeñas muestras debido a la electricidad estática. Si uno necesita detener el movimiento de los insectos, anestesia ninfa/adulto en hielo al tomar muestras de tejido. Debido a que T. domestica no puede sobrevivir después del enfriamiento a largo plazo en el hielo, no los anestesia durante más de un minuto e inmediatamente los mueva de vuelta a temperatura ambiente. La ablación del cerci y el filamento caudal no causa un aumento de la mortalidad.</li>
		<li>Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 °C para evaporar el EtOH.</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.2–4.2.5 para genotipado.</li>
		<li>Envíe los productos PCR en los que se observa un patrón de banda mutante a un servicio de secuenciación Sanger estándar.</li>
		<li>Mantenga las ninfas/adultos G1 con las mutaciones deseadas y deseche las demás (consulte la Figura 4C para obtener un resultado representativo de secuenciación).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruza a los adultos que contienen las mutaciones deseadas en un plato de apareamiento y obtiene las próximas generaciones para establecer una cepa mutante homocigólica.</li>
</ol>

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<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta1...

Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos2,3,4.
La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el ordenlepidópteros 7. La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica8. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasa V3, 100 y micro; g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador antiestático</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>para eliminar la electricidad estática de una placa de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Caja de barrera 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Contenedor grande</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Microinyector electrónico</td></tr><tr><td>Femtotip II, capilar de inyección</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Inyección de vidrio capilar</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Incubadora de contenedor de tamaño mediano</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>para 37 &deg; C incubación. No es necesario humidificar dentro de la incubadora.</td></tr><tr><td>Enzima PCR KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>para genotipado. Optimizado para una amplificación a partir de plantillas rudimentarias.</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>para sujetar el micromanipulador</td></tr><tr><td>Microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>para microinyección. Más de 35 aumentos son suficientes para la microinyección</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Sistema de electroforesis con microchip</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Cinta adhesiva de doble cara para colocar huevos en un portaobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Pincel (crin de caballo)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de plantas</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Plato de acoplamiento y suministros de agua para recipientes grandes y medianos</td></tr><tr><td>Proteinasa K, recombinante, Liofilizado de grado PCR de Pichia pastoris</td><td></td><td></td> Microscopio Roche 3115836001 <td></td></tr><tr><td>SZX 12</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td> Más <td>de 35 aumentos son suficientes para la microinyección</td></tr><tr><td>Polvos de talco</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Espectro de crecimiento de oro</td><td>Marcas</td><td></td><td>Alimento artificial para peces regulares</td></tr></tbody></table>

microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.

En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo, cuand...

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Debido a que Thermobia domestica es un insecto basal, los estudios genéticos de esta especie iluminarán los mecanismos subyacentes a la evolución de innovaciones clave en insectos, como el vuelo motorizado y las metamorfosis. Este protocolo cubre técnicas básicas desde el mantenimiento del cultivo hasta la microinyección de huevos para implementar Thermobia como especie modelo de laboratorio. Este método también se puede utilizar para la aplicación de otras herramientas genéticas, como la eliminación de genes mediada por RNI y la transgénesis en termobios.Mantenga las poblaciones de tipo salvaje y mutantes en un recipiente de plástico grande con comida artificial regular para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y capas de algodón para poner huevos. Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras a 37 grados centígrados y ajuste la humedad relativa dentro de cada recipiente a 60 a 80%Para preparar las colonias de recolección de huevos, transfiera unos 20 machos y 20 hembras adultas a un recipiente de tamaño mediano con comida, un suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos. Establezca varias colonias para obtener una gran cantidad de embriones en etapas en un corto período de tiempo.El día de la inyección, sustituya el algodón del interior de los envases por algodón nuevo. Ocho horas más tarde, recoja los huevos del algodón en capas separando las capas con pinzas. Alinee los huevos en la cinta adhesiva de doble cara con un pincel húmedo manteniendo una distancia de dos milímetros entre los huevos.Todos los huevos deben estar orientados de manera que el eje longitudinal de un huevo mire hacia el lado de la inyección. Presione suavemente los huevos con un pincel para que los sujeten firmemente durante la inyección. Cargue dos microlitros de la solución de ARNg CAS9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador.Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, golpee la aguja para eliminar las burbujas. Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndola ligeramente con pinzas para evitar obstrucciones y obtener una mayor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones.Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una pequeña cantidad de la solución. Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, en función de la forma de la punta de la aguja. Mantenga los huevos inyectados en un recipiente de tamaño adecuado con una humedad relativa del 60 al 80% a 37 grados centígrados.Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados para evitar el crecimiento de hongos. Si crecen demasiados hongos en un huevo, limpie la superficie del huevo con etanol al 70%. Antes de eclosionar, sumerja el portaobjetos de vidrio con los huevos inyectados en polvos de talco para cubrir la superficie de la cinta adhesiva de doble cara.Esto evitará la acumulación de ninfas eclosionadas. Transfiera los portaobjetos de vidrio con recubrimiento en polvo a un recipiente mediano con comida, agua y papel doblado. Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pocillos con un aspirador o un pincel.Mantener el suministro de alimento regular artificial para peces. Coloque las placas de 24 pocillos en un recipiente más grande con un suministro de agua para una humedad del 60 al 80%Pellizque y extraiga un cercus de una ninfa o adulto con pinzas y recójalas en un tubo de 0,2 mililitros que contenga 50 microlitros de etanol. Almacene las muestras recolectadas a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 grados centígrados para evaporar el etanol. La inyección del complejo de ribonucleoproteínas CAS9 de ARNg en embriones dentro de las primeras ocho horas después de la puesta de huevos da como resultado indels en el sitio objetivo del ARNg. Esto provoca mutaciones bialélicas en algunas células de la generación inyectada y se suelen obtener fenotipos de mosaico mutantes.Cuando se utilizó este protocolo para inyectar un ARNg diseñado para dirigirse al gen blanco, el 32,6% de las ninfas G0 mostraron una pérdida parcial de pigmentación en sus ojos compuestos y regiones dorsales. La evaluación de la transformación de la línea germinal de los adultos G0 y los individuos G1 mutados se realizó mediante PCR genómica seguida de un ensayo de movilidad heterodúplex. En las muestras G1, los patrones de banda diferenciales entre las muestras de tipo salvaje y las mutadas son claramente distinguibles.La edición del genoma en Thermobia proporciona un enfoque sólido para analizar los mecanismos genéticos que subyacen a los rasgos prematuros de los insectos. Ayuda a explorar los secretos detrás de su extraordinario éxito y el nuestro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video describe la microinyección, un método común para crear cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos el uso de la microinyección para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes con bases CRISPR.

Microinyección de gónadas: un método de administración de compuestos directamente en la línea germinal de C. elegans

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Aprende microinyección de óvulos y mantenimiento de colonias para edición genómica en Thermobia domestica. Este protocolo permite generar mutantes y estudiar la evolución de insectos basales.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

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