Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este protocolo puede proporcionar mediciones de alto rendimiento de la electrofisiología celular de una manera que se adapta a la tecnología en rápido desarrollo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas. La principal ventaja de esta técnica es que es menos compleja y menos laboriosa que la técnica tradicional de pinza de parche, pero es capaz de producir resultados equivalentes. Por lo tanto, este protocolo puede ampliarse para programas de cribado de toxicidad a gran escala utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Por ejemplo, el ensayo integral de proarritmia in vitro. Para preparar cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas para el experimento, primero se recubren cubrebocas individuales de vidrio redondo de 10 milímetros con 150 microlitros de matriz de membrana basal 1:60 dentro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos, e incubar los cubreobjetos a cuatro grados Celsius durante cuatro horas. Al final de la incubación, retire el exceso de matriz de los cubreobjetos y aplique el volumen adecuado de células a cada cubreobjetos.

Después de una hora a 37 grados centígrados, llene cuidadosamente cada pocillo con medio de siembra y devuelva la placa a la incubadora. Para prepararse para la obtención de imágenes de colorante sensibles al voltaje, equipe un microscopio de epifluorescencia invertida con una lente de alta apertura numérica con aumento de 40x y acople un LED blanco cálido de conmutación rápida al puerto de iluminación transmitido. Inserte un simple filtro rojo de 660 nanómetros en la ruta de luz transmitida y monte un cabezal LED de 470 nanómetros de conmutación rápida para el registro de fotometría.

Inserte un filtro de excitación 470/40 en el puerto de epifluorescencia para limpiar la luz generada por el LED e inserte un cubo de microscopio que contenga un divisor de haz de paso de 495 nanómetros de largo en el carrusel de la unidad de espejo dentro del microscopio. Coloque un brazo de detección que contenga un diafragma de campo ajustable en el puerto de montaje C para permitir la selección de la región de interés, y acople un detector PMT y una cámara USB al microscopio. Inserte un cubo de filtro que contenga un divisor de haz de paso de 565 nanómetros de largo y un filtro de emisión 535/50 en el puerto PMT para dividir la luz de emisión entre los dos detectores.

Acople el PMT a una fuente de alimentación y a un amplificador PMT, y conecte la salida del amplificador PMT a un pin de entrada analógica de un sistema de adquisición de datos. Para cumplir con los criterios de Nyquist y evitar el solapamiento, filtre los datos analógicos del PMT a un kilohercio o más, y digitalice los datos a una frecuencia que sea al menos el doble de la frecuencia más alta presente en la señal analógica. Para cargar las celdas con tinte sensible al voltaje, mezcle cinco microlitros de FluoVolt 1000x y 50 microlitros de solución de carga de energía, y agregue tres microlitros de la solución de carga resultante a tres mililitros de solución Tyrode calentada en una placa de Petri.

Agregue un solo cubreobjetos recubierto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a la placa y colóquela a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Monte una cámara de imágenes de células vivas calentada en la platina del microscopio y llene la cámara con 500 microlitros de solución fresca de Tyrode. A continuación, lave el cubreobjetos con una solución fresca de Tyrode a 37 grados centígrados y utilice pinzas de punta fina para transferir con cuidado el cubreobjetos a la cámara de baño precalentada.

Para estandarizar la dinámica celular y los parámetros experimentales, inserte dos electrodos de platino en la cámara, espaciados cinco milímetros, y conecte los electrodos a un estimulador externo. Ajuste el estimulador a pulsos de campo bipolar de cinco milisegundos a 0,5 hercios y aumente el estímulo de un voltio hasta que las células comiencen a contraerse. A continuación, ajuste el voltaje a aproximadamente un 25% por encima de este umbral.

Para la adquisición del potencial de acción óptica, utilice la trayectoria de la luz transmitida y la cámara USB para visualizar los miocitos en condiciones de campo claro. Seleccione una celda aislada y use el diafragma de campo para recortar firmemente su trayectoria óptica, asegurándose de que solo se monitoree la luz de la celda de interés. Active el amplificador PMT y ajuste el suministro PMT a 750 voltios.

Ejecute el protocolo de estimulación junto con el software de adquisición mientras activa simultáneamente la luz de excitación de 470 nanómetros. Registre 10 barridos, asegurándose de que se detecten potenciales de acción estables. Después del último barrido, mueva inmediatamente la platina del microscopio mientras sigue grabando para adquirir brevemente la señal de fondo de una región desprovista de células y apague la luz de excitación.

Para analizar los datos de potencial de acción, abra una grabación guardada en el software de análisis adecuado y promedie 10 barridos que contengan potenciales de acción estimulados de una sola célula. Reste la media de la señal de línea base que representa el desplazamiento de fluorescencia de la traza promedio, luego use la fórmula para calcular el cambio en la fluorescencia usando fluorescencia diastólica como F0. Identifique las áreas de interés diastólica y de potencial de acción y mida los parámetros deseados del potencial de acción cardíaca, incluidos, entre otros, la duración de la repolarización al 50% y al 90%. A continuación, exporte los datos de esta celda única a un programa de hoja de cálculo.

Este método permite una cuantificación rápida y precisa de la mecánica de repolarización, lo que puede proporcionar información valiosa sobre las anomalías iónicas celulares. Se pueden observar características pronunciadas de la fase uno en las señales ópticas de los cardiomiocitos murinos, que son morfológicamente distintas de las de los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Además, los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas responden a la manipulación farmacológica con nifedipino, un conocido antagonista de los canales de calcio de tipo L.

Durante la aplicación continua de fármacos, se observó una disminución del 41,5% en la duración del potencial de acción con una repolarización del 90%, lo que sugiere la funcionalidad de las imágenes basadas en indicadores de voltaje fluorescente como plataforma para estudios prospectivos de cribado de fármacos cardíacos de alto rendimiento. Es importante tener en cuenta que, aunque el colorante sensible al voltaje utilizado en este estudio es menos citotóxico que otros, la luz de excitación debe usarse con moderación para conservar la viabilidad celular. El equipo de fotometría moduladora utilizado en este protocolo es increíblemente versátil.

Por ejemplo, se puede utilizar para mediciones simultáneas de otros parámetros electrofisiológicos, como el calcio intracelular.