Name: Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a medir potenciales de acción ópticos en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante fotometría modular de alta velocidad. Este método simplifica la electrofisiología celular de alto rendimiento para cribado de toxicidad.

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Los autores desean agradecer a Cairn Research Ltd. por su amable contribución financiera que cubrió los costos de producción de esta publicación. Además, agradecemos a la Sra. Ines Mueller y a la Sra. Stefanie Kestel por su excelente apoyo técnico.
La investigación de los autores está respaldada por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2067/1- 390729940) y la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Preparaciones celulares
NOTA: Las iPSC humanas utilizadas en este protocolo se derivaron de donantes sanos y se diferenciaron en monocapas utilizando la modulación de moléculas pequeñas completamente definida de la señalización WNT y las técnicas de purificación de lactato como se describió anteriormente12,13,14. Los iPSC-CMs se mantuvieron cada 2-3 días con un medio de cultivo que se describe a continuación.
<ol><li>Preparar un medio de cultivo de medio basal (RPMI 1640) y suplemento al 2% (B27). Conservar a 4 °C. Uso a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparar un medio de recubrimiento de medio basal (RPMI 1640), suplemento al 2% (B27) e inhibidor de ROCK 1:2000. Conservar a 4 °C. Uso en RT.</li>
	<li>Cubra las cubiertas de vidrio redondo de 10 mm esterilizadas de 10 mm #0 con 150 μL de matriz de membrana basal libre de factor 1:60 e incube a 4 °C durante 4 h. NOTA: La optimización del volumen de la cubierta es necesaria para garantizar que todo el vidrio esté cubierto mientras se mantiene una tensión superficial adecuada para evitar derrames. Se recomienda 150 μL para fundas redondas de 10 mm. El tamaño del lote, el tipo de cubierta, el volumen de la cubierta y el tipo de placa de cultivo pueden adaptarse a las necesidades de los experimentadores.</li>
	<li>Comience la disociación de iPSC-CM con un reactivo de disociación celular basado en EDTA. Asegúrese de que la monocapa esté completamente separada enjuagando suavemente con una pipeta de 1.000 μL.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y agregue un medio de revestimiento de doble volumen. Centrífuga durante 10 min a 100 x g.</li>
	<li>Resuspend el pellet con un volumen deseado (volumen de resuspensión) de medio de recubrimiento. Contar las celdas de forma manual o electrónica.</li>
	<li>Seleccione la densidad óptima por deslizamiento (15,000) que permitirá el análisis celular aislado más adelante.</li>
	<li>Calcule el volumen de suspensión celular "activa" (A) necesaria para cubrir todos los cubrecubres a esta densidad deseada. Aplique la siguiente fórmula y retírela en un tubo separado: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Calcule el volumen de medio de chapado adicional (B) necesario para acomodar cada cubierta al volumen deseado. Aplique la siguiente fórmula y agregue el volumen resultante al tubo de suspensión activa: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Retire la matriz de los coverslips y aplique el 'volumen de coverslip' de la suspensión celular (A + B) a cada coverslip. Resuspenda regularmente en el tubo para asegurar una distribución celular uniforme.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 1 h. Llene suavemente el pozo con un medio de chapado.</li>
	<li>Después de 24 h, intercambie medios con medio de cultivo normal y manténgalo cada 2-3 días.</li>
</ol>2. Configuración experimental
<ol><li>Equipe un microscopio de epifluorescencia invertida con un aumento de 40x, lente de alta apertura numérica (N.A: &gt; 0.75) para realizar experimentos.</li>
	<li>Acopla un LED blanco cálido de conmutación rápida al puerto de iluminación transmitido del microscopio. Inserte un filtro rojo simple de 660 nm en la ruta de luz transmitida. NOTA: Esta luz se puede activar a través de experimentos de fotometría para observar la muestra sin contaminar la señal fluorescente verde.</li>
	<li>Monte un cabezal LED de conmutación rápida de 470 nm para la grabación de fotometría. Inserte un filtro de excitación 470/40 en el puerto epifluorescente del microscopio para limpiar la luz generada por el LED. NOTA: Para una cuantificación óptima de la señal, se recomienda un sistema de iluminación con control de retroalimentación de alta velocidad de salida óptica.</li>
	<li>Inserte un cubo de microscopio que contenga un divisor de haz de paso largo de 495 nm en el carrusel de la unidad de espejo dentro del microscopio.</li>
	<li>Ajuste un brazo de detección que contenga un diafragma de campo ajustable al puerto de montaje C del microscopio para permitir la selección de la región de interés.</li>
	<li>Acopla por separado un detector fotomultiplicador (PMT) y una cámara USB al microscopio. Esto constituirá la base del sistema de detección de emisiones.</li>
	<li>Inserte un cubo de filtro que contenga un divisor de haz de paso largo de 565 nm y un filtro de emisión 535/50 en el puerto PMT. Esto divide la luz de emisión entre los dos detectores. NOTA: Una cámara conectada al puerto transmitido del sistema de detección de emisiones puede detectar la luz transmitida bajo campo brillante a lo largo de todos los experimentos.</li>
	<li>Acopla el PMT a una fuente de alimentación y un amplificador PMT. Conecte la salida del amplificador PMT a un pin de entrada analógico de un sistema de adquisición de datos.</li>
	<li>Filtre los datos analógicos del PMT a 1 kHz o superior.</li>
	<li>Digitalice los datos a una frecuencia que sea al menos el doble que la frecuencia más alta presente en la señal analógica (2 kHz o superior) para cumplir con los criterios de Nyquist y evitar el aliasing.</li>
</ol>3. Carga celular con VF2.1Cl
NOTA: Todos los pasos que involucran este tinte deben llevarse a cabo en condiciones de poca luz.
<ol><li>Preparar una solución de baño de Tyrode de (en mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucosa, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,pH = 7.35 y caliente a 37 °C.</li>
	<li>Preparar una alícuota de solución de carga en un tubo de microcentrífuga mezclando 5 μL de 1.000x VF2.1Cl y 50 μL de solución de poloxámero solubilizante al 20%.</li>
	<li>Aplique 5 μL de la solución de carga a 5 ml de solución de Tyrode calentada (concentración total de colorante 0,1x) en una placa de Petri de 20 mm. NOTA: La concentración final de colorante es de 0.1x. Esto es 1/10de lo sugerido por el fabricante. Esto conserva los recursos, asegura una citotoxicidad insignificante y, lo que es más importante, aún conserva señales ópticas claras de las células cargadas con altas proporciones de señal a ruido.</li>
	<li>Añadir un solo resbalón de la cubierta iPSC-CM al plato e incubar a 37 °C durante 20 min.</li>
	<li>Ensamble una cámara de imágenes de células vivas calentada. Monte en la etapa del microscopio y llene con 500 μL de solución fresca de Tyrode.</li>
	<li>Lave el cubrecubres con la solución fresca de Tyrode a 37 °C.</li>
	<li>Aplique con cuidado la funda iPSC-CM en la cámara de baño precalenqueada con bórceps de punta fina. NOTA: Asegúrese de que la cámara y su contenido se calienten siempre a temperaturas fisiológicas. Si lo desea, comience con la perfusión continua de la solución de Tyrode calentada.</li>
</ol>4. Estimulación del campo eléctrico
NOTA: La activación externa de iPSC-CM es opcional pero útil para la estandarización de la dinámica celular y los parámetros experimentales. Aumenta la facilidad de análisis y permite la investigación de efectos dependientes de la frecuencia.
<ol><li>Coloque un inserto de estimulación con dos electrodos de platino espaciados 5 mm de distancia en la cámara de grabación.</li>
	<li>Conecte un estimulador externo al inserto de estimulación. Establecido en pulsos de campo bipolar de 5 ms a 0,5 Hz.</li>
	<li>Determine el voltaje de estimulación óptimo aumentando el estímulo de 1 V hacia arriba. El estímulo umbral se define como el voltaje más bajo al que las células comienzan a contraerse. Aplique voltajes aproximadamente un 25% por encima de este umbral. El rango normal está entre 1 V y 30 V.</li>
	<li>Fije la frecuencia de estimulación con el estimulador externo o activé la activa con un software de adquisición.</li>
</ol>5. Adquisición de potencial de acción óptica
NOTA: Este protocolo utiliza un software comercial para la adquisición y el análisis.
<ol><li>Visualice los miocitos en la vista de campo brillante utilizando la ruta de luz transmitida y la cámara USB.</li>
	<li>Seleccione una celda aislada y recorte herméticamente su trayectoria óptica con el diafragma de campo, asegurando que solo se monitoree la luz de la celda de interés.</li>
	<li>Active el amplificador PMT y configure la fuente PMT a 750 V.</li>
	<li>Ejecute el protocolo de estimulación (consulte el paso 4) junto con el software de adquisición y active simultáneamente la luz de excitación de 470 nm. Esto último se puede hacer a través de un panel remoto o automatizado a una intensidad fija (señal TTL).</li>
	<li>Ajuste la ganancia y el desplazamiento del amplificador PMT para asegurarse de que la señal no se sature y esté optimizada para el rango de detección del sistema de grabación.</li>
	<li>Registre 10 barridos asegurando que se detecten potenciales de acción estables.</li>
	<li>Continúe grabando e inmediatamente mueva la etapa del microscopio para adquirir brevemente la señal de fondo de una región desprovista de células. Apaga la luz de excitación. NOTA: Este valor de fondo(desplazamiento F) se utilizará para tener en cuenta cualquier fluorescencia de fondo.</li>
	<li>Si lo desea, perfunda localmente fármacos de referencia como 1 μM de nifedipino para identificar las respuestas celulares a la manipulación farmacológica.</li>
	<li>De forma secuencial, repita los pasos 5.2–5.7, cada vez que seleccione una nueva celda. Intercambie los cubrecos si lo desea para garantizar una alta rotación experimental en una sola sesión. NOTA: Los protocolos de carga y adquisición de imágenes se describen en la Figura 2.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Abra una grabación guardada con el software de análisis y promedie 10 barridos que contengan potenciales de acción estimulados de una sola célula.</li>
	<li>Tome una media de la señal de referencia que represente eldesplazamiento F y reste esto de la traza promediada.</li>
	<li>Calcule ∆F/F0 con la siguiente fórmula (donde F se mide la fluorescencia y F0 es la fluorescencia diastólica): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identificar el rastro basal (diastólico) y el área de interés (PA) y medir los parámetros potenciales de acción cardíaca deseados. Esto incluye, entre otros, el tiempo de descomposición para la repolarización del50%(APD 50) y del 90% (APD90).</li>
	<li>Exporte los datos de esta celda única a un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Repita los pasos 6.1 – 6.5 para todas las grabaciones. Evalúe los resultados con pruebas apropiadas no emparejadas o análisis de varianza.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figura 2: Protocolos de carga y adquisición de imágenes. (A) Diagrama de flujo del protocolo de carga VF2.1Cl completo para iPSC-CMs y cardiomiocitos nativos. (B) Un esquema simplificado de las configuraciones de divisor de haz (BS) y filtro utilizadas en este protocolo para la excitación y detección de la emisión de VF2.1Cl en respuesta a cambios en el voltaje transmembrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

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Aquí describimos un protocolo básico para adquirir fácilmente perfiles AP detallados a partir de iPSC-CMs aislados adecuados para el modelado electrofisiológico y la detección de fármacos cardíacos. Detectamos AP regulares y robustos de nuestros iPSC-CMs escasamente sembrados, lo que sugiere tanto la funcionalidad del indicador como la fidelidad metodológica.
Debido al amplio espectro de metodologías comerciales para la reprogramación de iPSC y la falta de estandarización para los protocolos d...

El modelado electrofisiológico de cardiomiocitos y la construcción de plataformas eficientes para el cribado de fármacos cardíacos es esencial para el desarrollo de estrategias terapéuticas para una variedad de trastornos arrítmicos. La rápida expansión de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha producido avances prometedores en el modelado de enfermedades humanas y la investigación farmacológica utilizando cardiomiocitos aislados derivados de pacientes (iPSC-CM). Las técnicas "estándar de oro" para la caracterización electrofisiológica de estas células a través de patch-clamp (current-clamp) pueden cuantificar la morfología y la duración del potencial de acción (AP), sin embargo, este método es increíblemente complejo y lento, y no es adecuado para la adquisición de datos de alto rendimiento1. Se informa regularmente que los iPSC-CMs tienen un mayor potencial de membrana diastólica y una mayor corriente de fuga en comparación con los cardiomiocitos nativos adultos2. Se sugiere que el tamaño celular más pequeño y la capacitancia de membrana reducida observada en iPSC-CMs pueden producir algún error sistemático al usar la técnica de pinza de corriente, tal vez explicando estas desviaciones3. Con el fin de maximizar la utilidad de una plataforma iPSC-CM, un método adicional es valioso para aumentar el rendimiento y garantizar la precisión de los datos al caracterizar los cambios de voltaje transmembrana a nivel de una sola celda en iPSC-CM.
Los colorantes sensibles al voltaje (VSD) han sido durante mucho tiempo un método propuesto para proporcionar un análisis más rápido, no invasivo y equivalente de la cinética cardíaca de AP comparativa con las de las técnicas tradicionales4. Un estudio reciente ha demostrado la idoneidad de la fotometría de sonda sensible al voltaje ratiométrico para cuantificar con precisión el APcardíaco 5. Además, la capacidad de ampliar fácilmente los enfoques de fotometría óptica presta esta técnica a pruebas de cardiotoxicidad a gran escala críticas en el desarrollo de fármacos terapéuticos (por ejemplo, CiPA). El desarrollo de protocolos estandarizados de cardiotoxicidad en un estudio cegado de múltiples sitios utilizando matriz de microelectrodos y técnicas ópticas de detección de voltaje ha demostrado el valor clave de este enfoque6.
Muchos colorantes potenciométricos están disponibles comercialmente, y el desarrollo sintético en curso de nuevas sondas muestra un potencial emocionante para racionalizar su efectividad en una variedad de construcciones cardíacas y neuronales. El VSD ideal tendrá una cinética y sensibilidad aumentadas, al tiempo que mostrará una menor carga capacitiva, fotobleaching y citotoxicidad. El recientemente sintetizado VF2.1Cl (FluoVolt) expresa muchas de estas propiedades beneficiosas en gran parte debido a su novedosa estructura molecular basada en cables, compartida por otros miembros de la nueva familia VoltageFluor (VF)7. A diferencia de los VSD electrocrómicos comunes en los que sondas simples se conjugan molecular y eléctricamente con la membrana plasmática, este tinte consiste en un alambre sintético insertado pasivamente que abarca la membrana que empareja un donante rico en electrones con un fluorescéforo de fluoresceína modificado (FITC). Los detalles mecanicistas se proporcionan en la Figura 1. Este tinte demuestra una excelente sensibilidad a las fluctuaciones de voltaje de la membrana, mostrando un cambio del 27% en la intensidad de emisión por 100 mV en comparación con ~ 10% visto en otras sondas comunes a velocidades comparables7. Además, los sistemas PeT basados en cables no interactúan directamente con el campo eléctrico celular, lo que produce una interferencia eléctrica mínima y cambios insignificantes en la carga capacitiva celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figura 1: Parámetros químicos, espectrales y mecanicistas del colorante VF2.1Cl. (A) Estructura química de VF2.1Cl. Las características moleculares a tener en cuenta incluyen múltiples grupos alquilo dentro del alambre molecular de fenileno vinileno que facilitan la inserción en la membrana plasmática. Un grupo de ácido sulfónico cargado negativamente conjugado a la sonda FITC asegura la estabilización del fluoróforo en la superficie extracelular y ayuda a la inserción casi perpendicular en relación con el campo eléctrico de la bicapa lipídica. (B) Un esquema simplificado de la incrustación perpendicular vf2.1Cl en la membrana plasmática de una célula diana. (C) Espectros de absorción y emisión del colorante VF2.1Cl. Spectra es idéntico al de las sondas ESTÁNDAR FITC y GFP. (D) Representación del modo de acción mecanicista de VF2.1Cl. En condiciones de reposo (hiperpolarizadas), los voltajes intracelulares negativos impulsan los electrones libres hacia el fluoróforo rostral. La abundancia de electrones asegura que la transferencia de electrones fotoinducida (PeT) se favorezca como una vía para salir del estado excitado después de la excitación óptica, apagando efectivamente la fluorescencia. Por el contrario, un potencial de membrana despolarizada influye en el movimiento de electrones hacia abajo favoreciendo la fluorescencia sobre la excitación óptica. La respuesta fluorescente resultante está linealmente relacionada con el voltaje de la membrana y se puede utilizar con precisión para recopilar información temporal detallada sobre la cinética electrofisiológica celular. (E) Imágenes representativas de campo brillante (superior) y fluorescencia a 470 nm (inferior) de cardiomiocitos de leporina cargados con VF2.1Cl. (F) Z stack de un solo cardiomiocito cargado. Las flechas indican áreas de clara localización de VF2.1Cl a la membrana celular. Las imágenes se adquirieron con un sistema confocal de disco giratorio que consiste en una cabeza confocal de disco giratorio X-lightv3 con un patrón estenopeico de 50 μm; Iluminador LDI-7; Cámara Prime95B y un objetivo PlanApo Lambda 100x. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La sonda FITC conjugada a VF2.1Cl garantiza que se pueda utilizar de manera efectiva en configuraciones de filtro estándar y GFP, y solo requiere un sistema de adquisición de un solo canal, que son características comunes de las plataformas de imágenes fluorescentes. El análisis de monocapas iPSC-CM humanas densas con este tinte se ha reportado recientemente8,9,10,11. Nuestro protocolo difiere de estos estudios debido a nuestra investigación de iPSC-CMs únicos y aislados, imperturbables por las influencias eléctricas y paracrinas de las monocapas sincitiales densas, y nuestro uso de un sistema de fotometría asequible y personalizable en lugar de complejos arreglos de imágenes confocales o de campo amplio.
Aquí, describimos nuestro protocolo para la rápida adquisición y análisis de AP ópticos robustos a partir de cardiomiocitos humanos aislados derivados de iPSC y cardiomiocitos nativos (ver Archivo Complementario). Utilizamos VF2.1Cl junto con una plataforma personalizable de última generación para mediciones de fotometría de una sola célula. Estos protocolos experimentales han sido aprobados por el comité de ética del Centro Médico Universitario de Gotinga (Nº 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes> </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Suplemento B27&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa anhidra&nbsp; BioChemica</td><td>ITW Reactivos</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de potencial de membrana FluoVolt&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipino &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibidor Y27632</td><td>Stemolecule</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dichroic Beamsplitter&nbsp;</td>Amplificador Axopatch 200B de <td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Cubreobjetos</td> circulares para dispositivos <td></td><td></td>moleculares</tr><tr><td>, espesor 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td> Fuente de alimentación Dual OptoLED para <td>dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>moleculares&nbsp;</td><td>Investigación de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación ET470/40x&nbsp;</td><td>Tecnología</td><td></td><td></td>Chroma</tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Tecnología Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grabado Neubauer Hemacitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubos de Filtro&nbsp;</td><td>Investigación de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Microscopio invertido&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Investigación de</td><td>mojones MonoLED&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores multipuerto&nbsp;</td><td>Investigación de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de células Myopacer&nbsp;</td><td>Obturador IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask&nbsp;</td><td>Investigación de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador de sistema Optoscan</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-1 Plataforma de Temperatura Controlada&nbsp; &nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector de fotomultiplicadores&nbsp;</td><td>Investigación de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto de amplificador PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto de suministro PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Cámara de baño abierta&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de etapa SA-OLY/2AL&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Divisor de haz dicroico&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Controlador de temperatura de doble canal&nbsp;</td><td>npi Electrónico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Objetivo</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara a color USB 3.0&nbsp;</td><td>Fuente</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de imagenSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Dispositivos moleculares&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Captura IC 2.4&nbsp;</td><td>Fuente de imágenes&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma 8</td><td>Gráfico</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Las técnicas convencionales de microelectrodos intracelulares para cuantificar la electrofisiología de cardiomiocitos son extremadamente complejas, requieren mucha mano de obra y, por lo general, se llevan a cabo con bajo rendimiento. La expansión rápida y continua de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) presenta un nuevo estándar en la investigación cardiovascular y ahora se necesita métodos alternativos para aumentar el rendimiento de los datos electrofisiológicos a nivel de una sola célula. VF2.1Cl es un tinte sensible al voltaje recientemente derivado que proporciona una respuesta rápida de un solo canal y de alta magnitud a las fluctuaciones en el potencial de membrana. Posee una cinética superior a las de otros indicadores de tensión existentes y pone a disposición datos funcionales equivalentes a los de las técnicas tradicionales de microelectrodos. Aquí, demostramos una caracterización simplificada y no invasiva del potencial de acción en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC de ritmo externo utilizando un sistema de fotometría modular y altamente asequible.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figura 3: Perfiles de potencial de acción óptica (AP) de cardiomiocitos nativos aislados y cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM). (A) AP óptico representativo de un solo cardiomiocito murino (centro) con media ± SEM de APD50 y APD90 (n = 7, derecha). (B) AP óptico representativo de un...

Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Este protocolo puede proporcionar mediciones de alto rendimiento de la electrofisiología celular de una manera que se adapta a la tecnología en rápido desarrollo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas. La principal ventaja de esta técnica es que es menos compleja y menos laboriosa que la técnica tradicional de pinza de parche, pero es capaz de producir resultados equivalentes. Por lo tanto, este protocolo puede ampliarse para programas de cribado de toxicidad a gran escala utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.Por ejemplo, el ensayo integral de proarritmia in vitro. Para preparar cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas para el experimento, primero se recubren cubrebocas individuales de vidrio redondo de 10 milímetros con 150 microlitros de matriz de membrana basal 1:60 dentro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos, e incubar los cubreobjetos a cuatro grados Celsius durante cuatro horas. Al final de la incubación, retire el exceso de matriz de los cubreobjetos y aplique el volumen adecuado de células a cada cubreobjetos.Después de una hora a 37 grados centígrados, llene cuidadosamente cada pocillo con medio de siembra y devuelva la placa a la incubadora. Para prepararse para la obtención de imágenes de colorante sensibles al voltaje, equipe un microscopio de epifluorescencia invertida con una lente de alta apertura numérica con aumento de 40x y acople un LED blanco cálido de conmutación rápida al puerto de iluminación transmitido. Inserte un simple filtro rojo de 660 nanómetros en la ruta de luz transmitida y monte un cabezal LED de 470 nanómetros de conmutación rápida para el registro de fotometría.Inserte un filtro de excitación 470/40 en el puerto de epifluorescencia para limpiar la luz generada por el LED e inserte un cubo de microscopio que contenga un divisor de haz de paso de 495 nanómetros de largo en el carrusel de la unidad de espejo dentro del microscopio. Coloque un brazo de detección que contenga un diafragma de campo ajustable en el puerto de montaje C para permitir la selección de la región de interés, y acople un detector PMT y una cámara USB al microscopio. Inserte un cubo de filtro que contenga un divisor de haz de paso de 565 nanómetros de largo y un filtro de emisión 535/50 en el puerto PMT para dividir la luz de emisión entre los dos detectores.Acople el PMT a una fuente de alimentación y a un amplificador PMT, y conecte la salida del amplificador PMT a un pin de entrada analógica de un sistema de adquisición de datos. Para cumplir con los criterios de Nyquist y evitar el solapamiento, filtre los datos analógicos del PMT a un kilohercio o más, y digitalice los datos a una frecuencia que sea al menos el doble de la frecuencia más alta presente en la señal analógica. Para cargar las celdas con tinte sensible al voltaje, mezcle cinco microlitros de FluoVolt 1000x y 50 microlitros de solución de carga de energía, y agregue tres microlitros de la solución de carga resultante a tres mililitros de solución Tyrode calentada en una placa de Petri.Agregue un solo cubreobjetos recubierto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a la placa y colóquela a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Monte una cámara de imágenes de células vivas calentada en la platina del microscopio y llene la cámara con 500 microlitros de solución fresca de Tyrode. A continuación, lave el cubreobjetos con una solución fresca de Tyrode a 37 grados centígrados y utilice pinzas de punta fina para transferir con cuidado el cubreobjetos a la cámara de baño precalentada.Para estandarizar la dinámica celular y los parámetros experimentales, inserte dos electrodos de platino en la cámara, espaciados cinco milímetros, y conecte los electrodos a un estimulador externo. Ajuste el estimulador a pulsos de campo bipolar de cinco milisegundos a 0,5 hercios y aumente el estímulo de un voltio hasta que las células comiencen a contraerse. A continuación, ajuste el voltaje a aproximadamente un 25% por encima de este umbral.Para la adquisición del potencial de acción óptica, utilice la trayectoria de la luz transmitida y la cámara USB para visualizar los miocitos en condiciones de campo claro. Seleccione una celda aislada y use el diafragma de campo para recortar firmemente su trayectoria óptica, asegurándose de que solo se monitoree la luz de la celda de interés. Active el amplificador PMT y ajuste el suministro PMT a 750 voltios.Ejecute el protocolo de estimulación junto con el software de adquisición mientras activa simultáneamente la luz de excitación de 470 nanómetros. Registre 10 barridos, asegurándose de que se detecten potenciales de acción estables. Después del último barrido, mueva inmediatamente la platina del microscopio mientras sigue grabando para adquirir brevemente la señal de fondo de una región desprovista de células y apague la luz de excitación.Para analizar los datos de potencial de acción, abra una grabación guardada en el software de análisis adecuado y promedie 10 barridos que contengan potenciales de acción estimulados de una sola célula. Reste la media de la señal de línea base que representa el desplazamiento de fluorescencia de la traza promedio, luego use la fórmula para calcular el cambio en la fluorescencia usando fluorescencia diastólica como F0. Identifique las áreas de interés diastólica y de potencial de acción y mida los parámetros deseados del potencial de acción cardíaca, incluidos, entre otros, la duración de la repolarización al 50% y al 90%. A continuación, exporte los datos de esta celda única a un programa de hoja de cálculo.Este método permite una cuantificación rápida y precisa de la mecánica de repolarización, lo que puede proporcionar información valiosa sobre las anomalías iónicas celulares. Se pueden observar características pronunciadas de la fase uno en las señales ópticas de los cardiomiocitos murinos, que son morfológicamente distintas de las de los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Además, los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas responden a la manipulación farmacológica con nifedipino, un conocido antagonista de los canales de calcio de tipo L.Durante la aplicación continua de fármacos, se observó una disminución del 41,5% en la duración del potencial de acción con una repolarización del 90%, lo que sugiere la funcionalidad de las imágenes basadas en indicadores de voltaje fluorescente como plataforma para estudios prospectivos de cribado de fármacos cardíacos de alto rendimiento. Es importante tener en cuenta que, aunque el colorante sensible al voltaje utilizado en este estudio es menos citotóxico que otros, la luz de excitación debe usarse con moderación para conservar la viabilidad celular. El equipo de fotometría moduladora utilizado en este protocolo es increíblemente versátil.Por ejemplo, se puede utilizar para mediciones simultáneas de otros parámetros electrofisiológicos, como el calcio intracelular.

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

Aquí presentamos un método de imagen ópticamente potenciales de la acción, específicamente en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas como ventricular. El método se basa en la expresión de una proteína fluorescente sensible al voltaje impulsado por el promotor.

Potencial de acción óptica específica de subtipo grabaciones en humanos inducida por cardiomiocitos ventriculares derivadas de células madre pluripotentes

Este artículo contiene un conjunto de protocolos para el desarrollo de redes de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC-CM) cultivadas en placas MEA multipocillos para electroportar la membrana celular de forma reversible para mediciones potenciales de acción. Las grabaciones de alto rendimiento se obtienen de los mismos sitios de celda repetidamente durante días.

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

La combinación de poración láser y matrices de microelectrodos (MEA) permite registros similares al potencial de acción de cardiomiocitos primarios y derivados de células madre cultivados. La forma de onda proporciona una visión superior del modo de acción de los compuestos de prueba que las grabaciones estándar. Vincula patch-clamp y lectura MEA para optimizar aún más la investigación de seguridad cardiovascular en el futuro.

Mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aquí, demostramos un método no invasivo de evaluación de contractilidad de dispositivos médicos cardíacos utilizando monocapas 2D de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM), chapadas en un sustrato flexible, junto con microscopía basada en video. Esta herramienta será útil para la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles de los dispositivos de electrofisiología cardíaca.

Evaluación de la terapia de modulación de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos derivados de células madre humanas 2D

Aquí, se describe un método establecido para realizar mediciones de contractilidad y calcio en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando una plataforma basada en óptica. Esta plataforma permite a los investigadores estudiar el efecto de las mutaciones y la respuesta a diversos estímulos de forma rápida y reproducible.

Mediciones en tiempo real de parámetros de calcio y contractilidad en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

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Aprende a medir potenciales de acción ópticos en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante fotometría modular de alta velocidad. Este método simplifica la electrofisiología celular de alto rendimiento para cribado de toxicidad.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (Video) | JoVE Journal

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

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