Name: Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a optimizar el crecimiento de microcristales de endotiapepsina mediante difusión de vapor y técnicas de lote para cristalografía en serie. Este protocolo proporciona un marco experimental escalable para diversas proteínas.

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Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 701647. Muchas gracias por la asistencia y el apoyo de los científicos de la línea de luz suiza X10SA-PXII.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El método presentado muestra cómo optimizar la cristalización de endotiapepsina de cristales grandes (≥ dimensión más larga de 100 μm), cultivados en pantallas de 96 pocillos de matriz dispersa, a microcristales, cultivados en tubos de centrífuga (volumen de 300 μL) por lote. La idea detrás del protocolo es que los pasos tomados para optimizar la endotiapepsina también podrían usarse para otras proteínas. En última instancia, respondiendo al problema de crear grandes volúmenes (>100 μL) de microcristales (10-20 μm) para experimentos de cristalografía en serie en XFELs y sincrotrones.
El protocolo divide la tarea de microcristalización de gran volumen en tres pasos: (1) Optimización de la morfología del cristal, (2) Transición a lote y (3) Escalado. En el Paso 1, la gama de formas cristalinas que una proteína puede crear debe explorarse en placas de difusión de vapor. Las condiciones que dan lugar a cristales individuales, en forma de caja, que se difractan a la resolución requerida deben ser el objetivo. En el paso 2, las condiciones seleccionadas se pueden transformar de difusión de vapor en lote. Aquí, el criterio de optimización es el tiempo de crecimiento del cristal y encontrar condiciones que den lugar a cristales de proteínas dentro de las 24 h. También se puede trazar un morfograma dando al experimentador una idea de la ubicación de la línea de solubilidad y los límites de la zona de nucleación. Este morfograma es de gran utilidad en el Paso 3, Escala. El morfograma dará una indicación de si la nucleación sola puede aumentar Xn y reducir Xs. A medida que aumenta el volumen del experimento, Xn y Xs pueden evaluarse continuamente como los criterios clave para escalar el éxito.
En el caso de la endotiapepsina, el Paso 1 desenterró lo que potencialmente era una morfología cristalina previamente desconocida para la endotiapepsina. Esta morfología tenía el mismo grupo espacial que los reportados anteriormente, pero, lo que es importante para la cristalografía en serie, una forma más parecida a una caja. Los cristales individuales también parecían crecer a partir de puntos de nucleación individuales, a diferencia de los ventiladores creados a partir de otras condiciones (Figura 4). Para la condición seleccionada, el Paso 2 ya estaba parcialmente satisfecho ya que el crecimiento del cristal ocurrió en < 24 h. El morfograma indicó que tanto un protocolo de lote recto como de lote sembrado podría tener éxito al escalar en el paso 3. La escala inicial en lote recto, creó una condición que produjo cristales con un rango Xn y Xs de 3.6 ± 1.2 x 106 cristales·mL-1 y 42 ± 4.1 μm, respectivamente. Estos cristales, aunque aceptables para algunos experimentos de cristalografía en serie, se consideraron demasiado grandes. Por lo tanto, se realizaron optimizaciones adicionales. El protocolo final produjo cristales con un rango de concentración y tamaño de 3,1 x 106 cristales·mL-1 y 15 ± 3,9 μm, respectivamente. Esto era más que ideal para los experimentos planeados.
El método se centra en la transformación de cristales de proteínas "solubles" cultivados en placas de difusión de vapor en lotes. La razón de este enfoque es que la gran mayoría de los cristales de proteínas solubles se cultivan a través de la difusión de vapor26. Sin embargo, los conceptos presentados también podrían aplicarse a cristales de proteínas solubles cultivados utilizando otros métodos, como el microlote. Los conceptos también pueden ser aplicables a los cristales de proteína de membrana cultivados en LCP; ya que esto también es un proceso de cristalización por lotes.
Un aspecto clave del protocolo es el proceso de transformación de las condiciones de los cristales cultivados en placas de difusión de vapor de tal manera que puedan cultivarse en lotes. Para esta transformación, el método utiliza el criterio propuesto por Beale et al. (2019)26. Los cristales cultivados a través de un proceso discontinuo, incluso en placas de difusión de vapor, se formarán rápidamente (< 24 h). Este criterio es una aproximación basada en la velocidad del equilibrio de la gota de difusión de vapor, y es más cierto para condiciones precipitantes basadas en PEG. Sin embargo, las condiciones de cristalización contendrán una amplia variedad de compuestos que influirán en el tiempo de equilibrio. El equilibrio de las condiciones de cristalización a base de sal, por ejemplo, cloruro de amonio altamente concentrado, puede ocurrir en 1-2 días. Por lo tanto, el criterio de 24 h puede no ser cierto para las condiciones a base de sal. Las condiciones basadas en sal también pueden tener diagramas de fase más complejos26,30 que pueden no ajustarse al arquetipo presentado en este protocolo. Puede ser necesario reducir el criterio de tiempo para las condiciones basadas en la sal a 12 o 6 h si resulta imposible escalar a volúmenes más grandes.
Otra limitación de este método es su aparente complejidad. El protocolo que se siguió para optimizar la microcristalización de la endotiapepsina en realidad cambió relativamente poco la condición original de la pantalla de matriz dispersa. El primer impacto observado en la pantalla PACT fue 0.1 HEPES pH 7.0, 0.2 M MgCl2 y 20% (p/v) PEG 6,000. El tampón de cristalización a escala final fue 0.1 Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 y 40% (p/v) PEG 6,000. También es muy posible que el cambio en el tampón de HEPES a Tris-HCl, y la concentración de MgCl2 , contribuyeran poco al éxito del proceso. Dejando el aumento en la concentración de PEG 6,000 como la única optimización, y una que podría haberse logrado de manera bastante simple.
Esta evaluación, sin embargo, también es demasiado simplista. No solo descarta los problemas encontrados durante el escalado (es decir, el uso de semillas y el enfriamiento), sino también el hecho de que solo porque esta proteína resultó sencilla, no hay garantía de que la siguiente también lo sea. Los pasos aconsejados en el protocolo, fueron ideados porque optimizar el escalado de los volúmenes de cristalización de proteínas puede ser muy costoso en proteínas. Durante los siete ensayos de raspado de endotiapepsina que se muestran, se consumieron 100 mg de proteína. Es cierto que algunos de estos pasos se realizaron para mostrar sus consecuencias a la luz de este protocolo. Aun así, 100 mg de una proteína, más potencialmente otros 50 mg para la proteína consumida durante un experimento (Tabla 1), puede ser una inversión significativa en tiempo o dinero.
Afortunadamente, no está claro que esta masa de muestra requerida sea ubicua en todas las proteínas. La endotiapepsina era altamente soluble y, por lo tanto, requería una gran concentración de proteínas para alcanzar la sobresaturación. En otros (actualmente en optimización), la sobresaturación se puede alcanzar a 10 o incluso 5 mg / ml. Tales variables son específicas de proteínas y deben ser aceptadas cuando aparecen.
Otras limitaciones del método incluyen su dependencia de equipos complejos, como robots de manejo de líquidos para la creación de pantallas y placas, y generadores de imágenes para obtener imágenes automáticas de placas cuando sea necesario. Se han ofrecido rutinas alternativas para limitar la necesidad de algunos de estos equipos, pero el protocolo llevará más tiempo seguirlo sin ellas. El protocolo también sugiere probar la difracción de cristales optimizados. Para los cristalógrafos sin acceso regular a un sincrotrón, estas pruebas podrían resultar desafiantes. Los controles en cada paso pueden no ser necesarios, pero estas pruebas se recomiendan encarecidamente una vez que se ha identificado un golpe y antes y después del escalado. Los cristales no difractores en un XFEL no son, desafortunadamente, una ocurrencia infrecuente. Dado esto, es mejor errar por el lado de la precaución con respecto a las suposiciones sobre la difracción de cristales.
En última instancia, este protocolo y los resultados presentados aquí ofrecerán una guía, ideas y un ejemplo para aquellos que luchan con la producción de muestras para experimentos de cristalografía en serie. Con suerte, a medida que la cristalografía en serie se desarrolle aún más, las demandas de muestra de la técnica se reducirán de tal manera que se reducirá la necesidad de protocolos como este. Sin embargo, incluso en este caso, las estrategias presentadas aquí seguirán siendo útiles para aquellos que deseen explorar el espacio de cristalización de su proteína.

La cristalografía macromolecular a temperatura ambiente (RT) es popular nuevamente dentro de la comunidad de biología estructural. El desarrollo de fuentes de luz láser de electrones libres de rayos X (XFEL) ha estimulado el desarrollo de enfoques de entrega de muestras RT 1,2,3,4, y estos métodos ahora se han aplicado a sincrotrones 5,6,7,8. Los métodos RT no solo abren la posibilidad de estrategias experimentales bomba-sonda 9,10,11,12, sino que también hay una creciente evidencia de que promueven estados conformacionales alternativos dentro de las proteínas 13,14,15,16,17.
Sin embargo, la razón principal por la que los criométodos ganaron tracción sobre los enfoques RT a fines de la década de 1990 fue la desaceleración del daño por radiación por temperaturas de cristales bajo cero18. Los criométodos19 comenzaron a permitir la recopilación de un conjunto de datos completo a partir de un solo cristal de proteína. Los métodos modernos de RT en XFEL y sincrotrones resolvieron el problema del daño por radiación de un solo cristal mediante el desarrollo de estrategias rápidas de administración de cristales (&gt; 100 Hz) 1,2,3,4. Estos métodos permiten la recopilación de un conjunto de datos completo de miles de cristales expuestos individualmente. Por lo tanto, estos enfoques de administración de RT requieren la producción de grandes cantidades de soluciones que contengan microcristales homogéneos (&gt; 100 μL de &lt; cristales de 50 μm). Sin embargo, dado que los criométodos tienden a requerir solo cristales individuales, los métodos para crear tales lodos microcristalinos actualmente no son omnipresentes en los laboratorios de cristalografía de proteínas.
Hay ejemplos en la literatura de cómo hacer partes del procedimiento de optimización de microcristalización para muestras de cristalografía en serie. Aquí, se debe hacer una distinción entre proteínas de membrana y solubles. Los protocolos para optimizar el crecimiento de cristales de proteínas de micromembrana cultivadas en monooleína (o algún otro lípido), para fase cúbica lipídica (LCP), han sido bien descritos20,21,22. Sin embargo, generalmente faltan métodos para la microcristalización de proteínas solubles, incluidas las proteínas de membrana cultivadas en condiciones sin LCP. Estudios previos se han centrado en partes específicas del proceso, como el cribado de microcristales 23,24, la mejora de la nucleación24 y el escalamiento mediante difusión de interfaz libre 25, pero no es un método completo.
Sin embargo, recientemente se describió un método26 que intenta ofrecer un protocolo completo. Como muchos aspectos de la cristalografía de proteínas, no es nueva. Muchas de las ideas propuestas ya fueron descritas por Rayment (2002)27. El método tiene como objetivo mostrar a los cristalógrafos cómo realizar la conversión de un solo cristal cultivado mediante difusión de vapor, a una metodología por lotes para cultivar miles de microcristales. El método se centra en la difusión de vapor como punto de partida común, ya que el 95% de todas las deposiciones del Banco de Datos de Proteínas (PDB) provienen de cristales cultivados en placas de difusión de vapor26. Sin embargo, la difusión de vapor no es el método ideal para la microcristalización26, por lo que se describe una metodología para convertir la difusión de vapor en cristalización por lotes. Una vez que los cristales se pueden cultivar en lotes, las rutas de escala a volúmenes más grandes se vuelven más prácticas. Dados los caprichos de la cristalización de proteínas, los autores enfatizarían que este método no es a prueba de fallos. Sin embargo, el protocolo debería, al menos, proporcionar una idea del "espacio de cristalización" de una proteína.
Este método se basa en el diagrama de fase de cristalización de proteínas y en cómo la comprensión de ese diagrama puede actuar como guía durante la optimización de la microcristalización. Un diagrama de fase de proteína se representa comúnmente como un gráfico x/y con concentraciones de precipitante y proteína en los ejes x e y, respectivamente (Figura 1A). Desde el punto de agua pura (esquina inferior izquierda - Figura 1A), la concentración de proteína y precipitante aumenta hasta que se alcanza la línea de solubilidad. La línea de solubilidad marca el punto de sobresaturación (línea púrpura - Figura 1A). Cuando una proteína está sobresaturada, la solución se vuelve termodinámicamente inestable y comenzará a separarse en dos fases: "rica en proteínas" y una solución saturada estable. Esta separación puede ocurrir en cualquier lugar más allá de la línea de solubilidad y su cinética depende de las propiedades de la proteína y los componentes de la solución.
Cuando las concentraciones de proteína y precipitante son demasiado grandes, la proteína se descompondrá de manera inestable fuera de la solución y dará como resultado un precipitado amorfo (región rosada - Figura 1A). Sin embargo, la separación ordenada de fases puede ocurrir en la región de nucleación [ver García-Ruiz (2003)28 para una descripción detallada] y los nucleantes cristalinos tienen la propensión a formarse (región verde - Figura 1A). La nucleación y el crecimiento eliminan la proteína de la solución y mueven la gota a la región metaestable donde el crecimiento puede continuar hasta que se alcance la línea de solubilidad [ver McPherson y Kuznetsov (2014) 29 para una discusión detallada]. El diagrama es, para la gran mayoría de las condiciones de cristalización, una simplificación excesiva30. Sin embargo, independientemente de esto, el diagrama sigue siendo de gran utilidad para los microcristalógrafos, ya que el mapeo del diagrama permite determinar la línea de solubilidad y la cinética de nucleación.
En términos de creación de microcristales, los dos factores durante la cristalización que deben optimizarse son el número de cristales (Xn) y su dimensión media más larga (Xs). X n será proporcional al número de eventos de nucleación (n ) (Ec. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Ec. 1
X s es proporcional a la concentración de proteína libre por encima de la línea de solubilidad (Ps) dividida por Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Ec. 2
En una situación perfecta, cada evento de nucleación produciría un posible cristal y cada uno de estos cristales tendría igual acceso a la proteína disponible en solución. La figura 2 es una representación gráfica de un escenario ideal de la relación entre Xn y Xs. Prácticamente, el control principal que un cristalógrafo tiene sobre Xn y X s es influyendo en la cantidad de nucleación o mediante la adición decristales de semillas. El microcristalógrafo debe juzgar cómo aumentar Xn de tal manera que se pueda crear una concentración de cristal y un tamaño de cristal adecuados.
La mayoría de las técnicas de cristalización requieren un "período de transición" (Figura 1B). Por ejemplo, en un experimento de difusión de vapor, al mezclar la proteína y las soluciones precipitantes, las concentraciones de cada una cambiarán a medida que la gota se equilibre con la solución del pozo. Uno espera que estos cambios hagan gradualmente la transición de la gota a la zona de nucleación donde aumentará la propensión a la cristalización. A medida que los cristales comienzan a nuclearse y crecer, la cantidad de proteína en solución comenzará a disminuir, disminuyendo la probabilidad de una mayor nucleación. La cantidad final de nucleación será específica de la proteína y la condición, y también dependerá de la profundidad de penetración en la zona de nucleación. Dada la limitada penetración en la zona de nucleación de los métodos que requieren un paso de transición, el nivel de nucleación se limitará en última instancia a la velocidad de nucleación en el límite de la región de nucleación metaestable.
Debido a la importancia de poder mejorar el nivel de nucleación para un microcristalógrafo, es importante pasar a una metodología de cristalización por lotes. El lote puede aprovechar mejor toda la región de nucleación (Figura 1C). En los métodos por lotes, la idea es mezclar la proteína y el precipitante de tal manera que se cree una solución sobresaturada sin la necesidad de ningún cambio en las concentraciones de componentes. La nucleación debe ser posible inmediatamente después de la mezcla. Por lo tanto, los métodos por lotes permiten alcanzar teóricamente toda la zona de nucleación. Cualquier aumento en la cinética de nucleación más allá del límite de nucleación metaestable puede ser utilizado.
Si el nivel basal de nucleación cristalina no es suficiente para generar ungran X n, se pueden usar métodos de microsiembra. En la microsiembra, los cristales precultivados se rompen para crear una suspensión de fragmentos cristalinos que pueden actuar como un andamio para el crecimiento de cristales frescos31,32. La microsiembra se ha utilizado ampliamente en la preparación de muestras cristalográficas en serie como una forma de aumentar Xn sin la necesidad de aumentar la nucleación cristalina (Figura 1C).
La transición de la difusión de vapor a la dispersión por lotes se puede visualizar en un diagrama de fase como mover el punto de partida experimental de las regiones no sobresaturadas o metaestables a la zona de nucleación. Esto se puede hacer aumentando las concentraciones de proteínas y/o precipitantes, y/o la proporción de las dos dentro de la gota (Figura 1D), y observando en qué condiciones producen cristales que aparecen rápidamente (&lt; 24 h)26. El equilibrio completo de la gota de difusión de vapor puede tardar días o semanas33. Por lo tanto, al buscar condiciones que muestren cristales que aparecen rápidamente, se pueden encontrar condiciones de lote sin tener que pasar a formatos alternativos de cribado de cristalización como el microlote34,35,36,37.
Una vez que se ha encontrado la zona de nucleación, se ha encontrado una condición de lote y se puede crear un morfograma, aquí, un diagrama de fase aproximado. El morfograma es de gran utilidad cuando se contempla si se debe usar un protocolo de lote sembrado o de lote recto. Al trazar elX n en función de la proteína y la concentración de precipitante, se puede hacer una evaluación de la cinética de nucleación26. Si X n permanece bajo en toda la región de nucleación, se puede requerir un lote sembrado para hacer Xn lo suficientemente grande como para limitar el crecimiento de cristales. Esta evaluación es el primer paso en el proceso de escalado a volúmenes mayores (&gt; 100 μL).
Este método fue diseñado de tal manera que podría llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios de cristalización mediante el uso de equipos estándar de cristalización por difusión de vapor. También se han realizado muchos estudios que describen técnicas para facilitar muchas partes de este proceso, en caso de que el equipo esté disponible. Estos incluyen, pero no se limitan a, dispersión dinámica de luz (DLS)25,27, imágenes no lineales 20,24,25, difracción de polvo 20,24,27 y microscopía electrónica 26 [ver Cheng et al. (2020) 40 para una buena revisión].
El objetivo de este trabajo es proporcionar una demostración visual del método para la transición de la cristalización por difusión de vapor de pequeño volumen (&lt; 500 nL) a la cristalización por lotes de gran volumen (&gt; 100 μL). La endotiapepsina de Cryphonectria parasitica se ha utilizado como un sistema de ejemplo para demostrar esta traducción. El tipo de experimento y el método de entrega de muestras para el que se requieren los microcristales influirán en la salida idealde X s 26. Para experimentos de mezcla que requieren una resolución de milisegundos41 o boquillas virtuales con dinámica de gas42, puede ser deseable una Xs final de &lt; 5 μm. En este caso, el objetivo era producir cristales de proteínas que difractaran a aproximadamente 1,5 Å, para un experimento de bomba-sonda activada por fotones, y utilizando un enfoque de entrega de objetivo fijo.
Para dar una ilustración de los requisitos de muestra de tal experimento de cristalografía en serie utilizando endotiapepsina, la Tabla 1 muestra los parámetros experimentales de un experimento hipotético. La información de la muestra se basó en el protocolo que se describe a continuación. Dadas algunas estimaciones conservadoras sobre las tasas de aciertos y los requisitos de recopilación de datos, 50 mg es la estimación del consumo total de la muestra para todo el experimento.
La Figura 3 muestra un diagrama de flujo del proceso de optimización completo desde la cristalización inicial por difusión de vapor de pequeño volumen hasta el lote a gran escala. Para la mayoría de los proyectos de cristalografía en serie, este protocolo comenzará en el Paso 2: 'transición a lote', ya que la proteína diana ya habrá sido cristalizada. Sin embargo, el Paso 1 se ha incluido para completar y recordar a los lectores su importancia. Encontrar una condición que dé lugar a un cristal grande, único y difractor es el mejor punto de partida para la optimización de microcristales. En el Paso 2, esta condición se puede optimizar de la difusión de vapor al lote, y se puede trazar un morfograma de la nucleación y las regiones metaestables. Una vez hecho esto, se puede escalar la condición del lote a volúmenes más grandes en el paso 3. Al final del diagrama de flujo, un cristalógrafo habrá creado un protocolo de microcristalización repetible (&gt; 100 μL), de microcristalización, por lotes para la endotiapepsina. Este método se puede aplicar a su proteína particular de interés.

<table><tbody><tr><td>Swissci de 96 pocillos Placas de 2 gotas</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD11-002</td><td>Placa de cristalización de 96 pocillos y 2 gotas</td></tr><tr><td>Swissci de 96 pocillos Placas de 3 gotas</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD11-003</td><td>Placa de cristalización de 3 gotas de 96 pocillos</td></tr><tr><td>mosquito LCP robot de manipulación de líquidos</td><td>sptlabtech</td><td>mosquito LCP</td><td></td></tr><tr><td>Láminas ClearVue</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD6-015</td><td>Sellos de placa de cristalización de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Safe-Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>Scaple</td><td>Swan and Morton</td><td>No. 3 bisturí y mango No. 3</td><td>Bisturí para cortar sellos de placa abierta</td></tr><tr><td>MS 3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>Vortex para mezclar solución y hacer existencias de semillas</td></tr><tr><td>Placa XRL de 24 pocillos</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD3-11</td><td>Placas colgantes de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Revólver/rotador de tubo</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>88881001 Revólver de tubo para mezclar la solución durante el raspado</td></tr><tr><td>Pipetas Eppendorf Research plus</td><td>Gama Eppendorf</td><td></td><td>de pipetas manuales, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 y micro; L</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Gama de tamaños de punta para pipetas manuales</td></tr><tr><td>Suparen 600</td><td>Prochem AG</td><td>Suparen 600</td><td>Solución de endotiapepsina</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>Acetato de sodio</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>8382T014</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>Cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>PEG 6.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255-1kg</td><td>PEG 6.000</td></tr><tr><td>Ethelyene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-1L</td><td>Etelenglicol para la ciroprotección de los cristales Criba</td></tr><tr><td>PACT Premier HT</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>MD1-36</td><td>PACT Premier Criba de cristal de 96 pocillos</td></tr><tr><td>DOW CORNING Grasa de alto vacío</td><td>Dimensiones moleculares</td><td>Grasa MD6-02</td><td> para el sellado de placas de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Correderas de cubierta de vidrio Hirschmann de 22 x 22 mm Correderas</td> de cubierta <td>8000104</td><td>Hirschmann</td><td>para sellar placas de caída de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Clavijas de cristal</td><td>PSI</td><td>Fabricación propia</td><td>Soportes de película fina para microcristales.</td></tr><tr><td>1-1,3 mm SiLibeads Tipo S</td><td>Fausto</td><td>6239547</td><td>Cuentas de vidrio para hacer caldos de semillas de mico</td></tr><tr><td>Macbook Pro</td><td>Apple</td><td>Macbook Pro</td><td>Ordenador para realizar análisis de datos</td></tr><tr><td>Paquete de software CCP4</td><td>CCP4</td><td></td><td>Software de procesamiento de datos de patrones de difracción</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td><td>Herramienta de trazado para diagrama</td></tr> <tr><td>de fasesCámara de recuento Hausser Scientific Bright-Line</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>02-671-51B</td><td>Herramienta para calcular la concentración de cristales</td></tr><tr><td>PACT Premier</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29-ECO</td><td>Criba de cristalización de matriz dispersa</td></tr><tr><td>Rock Imager</td><td>Formulatrix</td><td>Rock Imager Almacenamiento</td><td>y generador de imágenes de placas de cristal con control de temperatura</td></tr><tr><td>Rock MakerWeb</td><td>Formulatrix</td><td>Rock MakerWeb</td><td>Creación de placas de cristal y almacenamiento de imágenes stoftware</td></tr><tr><td>Formulator</td><td>Formulatrix</td><td>Formulator</td><td>Creación de pantallas de cristal de 96 pocillos robot de manipulación de líquidos</td></tr><tr><td>Microscopio Leica MZ16 Microscopio</td><td>óptico Leica</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>LAS V4.6</td><td>Leica</td><td>LAS V4.6</td><td>Software para microscopios Leica</td></tr><tr><td>Spectra/Por Tubo de diálisis de 3,5 kDa</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Membrana de diálisis Membrana</td> de <td>diálisis Membrana de diálisis de 3,5 kDa</td></tr><tr><td>Cierres de tubos de diálisis</td><td>Spectrumlabs Spectra</td><td>/Por 3 Duniversal Clips</td><td>para sellar los extremos de los tubos de diálisis</td></tr><tr><td>Concentrador centrífugo Amicon 10 kDa</td><td>Merck-Millipore</td><td>Concentrador centrífugo Amicon Ultra-15 10 kDa</td><td>Filtro centrífugo de 10 kDa</td></tr><tr><td>5810 R centrífuga</td><td></td><td></td> <td>de cubo oscilante Eppendorf 5810 RCentrífuga de cuchara oscilante</td></tr></tbody></table>

optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Aquí, se presenta un protocolo para facilitar la creación de grandes volúmenes (> 100 μL) de lodos microcristalinos adecuados para experimentos de cristalografía en serie tanto en sincrotrones como en XFEL. El método se basa en una comprensión del diagrama de fase del cristal de proteína y cómo se puede utilizar ese conocimiento. El método se divide en tres etapas: (1) optimización de la morfología del cristal, (2) transición a lote y (3) escalado. La etapa 1 implica encontrar cristales individuales bien difractantes, con suerte pero no necesariamente, que se presenten en una morfología similar a un cubo. En la Etapa 2, la condición de la Etapa 1 se optimiza por el tiempo de crecimiento del cristal. Esta estrategia puede transformar cristales cultivados por difusión de vapor en lotes. Una vez que el crecimiento del cristal puede ocurrir dentro de aproximadamente 24 h, se puede trazar un morfograma de la mezcla de proteínas y precipitantes y usarlo como base para una estrategia de escalamiento (Etapa 3). Cuando los cristales se pueden cultivar en lote, se puede intentar escalar y optimizar el tamaño y la concentración del cristal a medida que aumenta el volumen. La endotiapepsina se ha utilizado como proteína de demostración para este protocolo. Algunas de las decisiones presentadas son específicas para la endotiapepsina. Sin embargo, se espera que la forma en que se han aplicado inspire una forma de pensar sobre este procedimiento que otros puedan adaptar a sus propios proyectos.

El objetivo de este artículo es dar al espectador una sólida comprensión de cómo transformar su protocolo de difusión de vapor de pequeño volumen, para cultivar cristales grandes de una sola proteína, en un método de microcristalización por lotes de gran volumen para cristalografía en serie.

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Los experimentos de cristalografía en serie pueden ser un desafío. Un obstáculo clave en su práctica es la creación de muestras microcristalinas. Este protocolo muestra cómo se pueden crear dichas muestras de manera confiable.Este método utiliza endotiapepsina para proporcionar un marco para optimizar cristales grandes cultivados en placas de difusión de vapor de pequeño volumen en lodos microcristalinos de gran volumen. No podemos afirmar que este protocolo será universalmente exitoso. Sin embargo, esperamos que las ideas y métodos propuestos aquí den a otros un marco experimental para emplear en otras proteínas.Para comenzar, prepare una placa de pocillos de 96 gotas de dos gotas con el tampón de cristalización utilizando el robot Formulatrix. Usando una mezcla de robot de manejo de líquidos, mezcle 150 nanolitros de endotiapepsina recién descongelada con 150 nanolitros del tampón de cristalización en cada pozo. Selle la placa y deje que los cristales crezcan durante 24 horas dentro del Hotel Formulatrix.Después de 24 horas, rompa y retire los cristales de cinco pocillos de la placa de cristalización de 96 pocillos. Colóquelos en 250 microlitros del tampón de cristalización en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros colocado en un cubo de hielo. Agregue de 10 a 15 perlas de vidrio de un milímetro de tamaño en el tubo de centrífuga.Vortex los cristales y cuentas a 1000 RPM durante 30 segundos, y reemplácelos en hielo durante 30 segundos. Las semillas se pueden usar de inmediato o almacenar a menos 20 grados centígrados. Para realizar un experimento de morfograma, agregue concentraciones de cinco a 40% de PEG 6000 con un molar de Tris-HCl a pH siete y cloruro de magnesio molar de 0.15 a lo largo de las columnas de la placa de una pantalla de rejilla de 96 pocillos de dos gotas Reparar una dilución secuencial de endotiapepsina en acetato de sodio molar 0.1 de 100 a 12.5 miligramos por mililitro en ocho pasos.Luego pipetear ocho microlitros de cada dilución seguidos de dos microlitros de material de semillas en la placa del robot de manejo de líquidos. Usando un robot de manejo de líquidos, dispensar 150 nanolitros de cada dilución de endotiapepsina en subpocillos uno y dos de la pantalla. Multi-aspirar 50 nanolitros de semilla descongelada y 100 nanolitros de la solución de pozo del sub-pozo dos y dispensar ambos en la solución de proteína.Mezclar las soluciones tres veces después de la adición del tampón de cristalización o tampón de cristalización y la mezcla de semillas. Ahora selle la placa y la imagen a cero, tres, seis, 12, 18 y 24 horas del primer día todos los días durante la primera semana y cada semana durante las próximas cuatro semanas a 20 grados centígrados. Después de 24 horas, mire la placa bajo un microscopio, estime el número de cristales dentro de cada pocillo y mida una muestra de los cristales.Registre estas estimaciones en la hoja de trabajo del generador de morfogramas proporcionada. Introduzca las concentraciones iniciales de endotiapepsina y PEG 6000 en las cajas apropiadas. La hoja de trabajo trazará automáticamente los resultados en el formato tradicional de diagrama de fases con las concentraciones de precipitante y proteína en los ejes X e Y, respectivamente.Las condiciones de pozo que solo dan lugar a cristales en sus gotas sembradas indican la región MetaEstable del diagrama, mientras que las condiciones con cristales tanto en las gotas sembradas como en las no sembradas indican la zona de nucleación. A partir del análisis del morfograma, seleccione la condición más prometedora para escalar en placas de 24 pocillos. Luego comience con 100 miligramos por mililitro de endotiapepsina y 35% PEG 6000.Prepare cinco mililitros de tampón de cristalización con 35% PEG 6000, 0.1 molar Tris-HCl con pH siete y 0.15 molar cloruro de magnesio. Ahora coloque 0,5 mililitros del tampón de cristalización en tres pocillos de una placa de gota colgante engrasada de 24 pocillos. Mezcle 15 microlitros de endotiapepsina con 15 microlitros de solución de cristalización en un cubreobjetos de vidrio.Coloque la solución sobre los pocillos y deje la placa durante 24 horas. Después de 24 horas, mire la placa bajo un microscopio, estime el número de cristales en la gota y mida su tamaño. Si los cristales son incorrectos, repita este paso, pero cambie la concentración de proteína o agregue semillas si la nucleación del cristal no es lo suficientemente alta.Repita el experimento de escalado de 24 pocillos agregando semillas a una concentración más alta de PEG 6000. Coloque 0,5 mililitros del nuevo tampón de cristalización en tres pocillos de una placa de gota colgante engrasada de 24 pocillos. Coloque 15 microlitros de endotiapepsina en un cubreobjetos de vidrio y mezcle cinco microlitros de semilla y 10 microlitros de solución de cristalización con la solución de endotiapepsina.Invierta los cubiertos, colóquelos sobre los pozos y déjelos durante 24 horas. Vuelva a revisar las gotas para ver si los cristales son más pequeños y tienen una concentración más alta. Estime el número de cristales en la gota y mida su tamaño nuevamente para ver si ahora tienen el tamaño correcto.Para realizar un protocolo de lote sembrado, prepare el tampón de cristalización de 40% PEG 6000, 0.1 molar Tris-HCl con un pH de siete y 0.15 molar cloruro de magnesio. Premezcle 50 microlitros de material de semilla y 100 microlitros de solución de cristalización, y mezcle con una solución de proteína en el tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Vortex el tubo durante 10 segundos y colóquelo en un balancín o agitador a 20 grados centígrados.Tomar una alícuota de 2,5 microlitros de la solución discontinua cada 20 minutos. Controle el tamaño y el número de cristales con un hemocitómetro. Cuente el número de cristales y mida su tamaño bajo el microscopio.Cuando los cristales hayan alcanzado aproximadamente 15 micras de dimensión, apague la reacción con 150 microlitros de acetato de sodio molar 0.5 suplementado con 0.5 molar Tris-HCl, cloruro de magnesio molar 0.075 y 20% PEG 6000. Vuelva a comprobar el tamaño y la concentración del cristal con el hemocitómetro. Guarde los cristales a 20 grados centígrados.El análisis del morfograma de endotiapepsina sugirió que la nucleación estaba influenciada tanto por las concentraciones de proteínas como de precipitantes. Las regiones MetaStable, nucleación y precipitación del diagrama se pueden distinguir muy bien. La adición de semillas aumentó significativamente el número de cristales en comparación con las gotas sin semillas.El análisis de la microcristalización de endotiapepsina en volúmenes de 200 a 300 microlitros reveló los cambios en la nucleación cristalina y la dimensión más larga a lo largo del tiempo. El aumento de la concentración de PEG al 35% mejoró notablemente la cristalización, con una concentración final de cristal de alrededor de 3,6 veces 10 a seis por mililitro, y la dimensión cristalina más larga de 42 micrómetros. Para reducir el tamaño de los cristales finales, se aplicó un enfoque de reducción de la concentración de proteínas, que desafortunadamente redujo significativamente la concentración de cristales y, en última instancia, produjo cristales aún más grandes.Sin embargo, el enfoque de aumentar la concentración de PEG al 40% produjo cristales alrededor de 3.1 veces 10 a seis por mililitro y un tamaño de aproximadamente 39 micrómetros. Además, la adición de semillas condujo a un aumento significativo en la concentración de cristales, alrededor de 1.1 veces 10 a ocho por mililitro y dimensiones más pequeñas de aproximadamente 4.2 micrómetros. El efecto de enfriamiento intentado en la reacción de cristalización dio una concentración final de cristal de alrededor de 2,6 veces 10 a seis por mililitro y un tamaño de aproximadamente 15 micrómetros.La mitad CC trazada contra la resolución de los datos de rayos X mostró una ligera disminución en la resolución de cristal de los volúmenes de 10 microlitros a 200 a 300 microlitros. Sin embargo, el cristal todavía difractaba a 1.5 angstrum, que se consideró suficiente. La endotiapepsina es una proteína indulgente con la que trabajar.Esperamos que probar este protocolo de endotiapepsina genere ideas y métodos útiles para otras proteínas. Particularmente con la cristalografía, es beneficioso ver cómo se ven y se sienten las cosas en lugar de tratar de seguir solo un protocolo escrito. Esperamos que este video te dé algo de esa sensación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Los protocolos describen los pasos esenciales para la obtención de cristales de difracción de la calidad de una proteína de membrana a partir de la reconstitución de la proteína en una fase lipídica cúbicos (LCP), la búsqueda de las condiciones iniciales con LCP-FRAP antes de la cristalización de los ensayos, el establecimiento de ensayos LCP cristalización y los cristales de la cosecha .

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Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa.

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Describimos procedimientos para la preparación y administración de microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía en serie en láseres de electrones libres de rayos X y fuentes de sincrotrón. Estos protocolos también se pueden aplicar para la incorporación y administración de microcristales de proteínas solubles, lo que reduce sustancialmente el consumo de muestras en comparación con la inyección líquida.

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.

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Aquí presentamos un protocolo para la producción controlada de microcristales de proteína. El proceso utiliza un dispositivo automatizado que permita manipulación controlada de varios parámetros de cristalización. La cristalización de proteínas es realizados por adición controlada y automatizada de soluciones de la cristalización mientras que vigilar e investigar la distribución de radio de las partículas en la gota de cristalización.

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El éxito de un experimento de Cristalografía de femtosegundo serial tiempo resuelto es dependiente en la entrega de la muestra eficiente. Aquí, describimos protocolos para optimizar la extrusión de bacteriorhodopsin microcristales de un inyector micro-extrusión de alta viscosidad. La metodología se basa en la homogeneización de la muestra con un nuevo acoplador de tres vías y la visualización con una cámara de alta velocidad.

Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

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Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar la transición dimer-dodecamer de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa, a nivel estructural. Es una tubería sencilla que va desde la purificación de proteínas hasta el procesamiento de datos de rayos X. La cristalgénesis, la indexación de conjuntos de datos y el reemplazo molecular se han enfatizado a través de un caso de estudio, la variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.

Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

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Aprende a optimizar el crecimiento de microcristales de endotiapepsina mediante difusión de vapor y técnicas de lote para cristalografía en serie. Este protocolo proporciona un marco experimental escalable para diversas proteínas.

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