Name: Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a determinar los requisitos de polinización en ciruelas japonesas mediante polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular por PCR. Este método combina técnicas de campo y laboratorio.

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Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 y RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón—Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12-17R), y Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT, 471839).

1. Polinización manual en el campo
<ol><li>
Extracción de polen
	<ol>
<li>Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26. NOTA: Se necesitan más capullos florales en la ciruela japonesa que en otras especies de Prunus porque sus anteras producen menos polen.</li>
		<li>Retire las anteras con una malla de plástico (tamaño de poro de 2 mm x 2 mm) y colóquelas en papel a temperatura ambiente durante 24 h hasta la dehiscencia de la antera.</li>
		<li>Tamizar los granos de polen a través de una malla fina (0,26 mm x 0,26 mm de tamaño de poro), y conservarlos en un tubo de vidrio de 10 ml con una tapa a 4 °C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polinización de flores castradas
	<ol>
<li>Cuando entre el 10% y el 20% de las flores estén abiertas, seleccione y etiquete varias ramas. Retire las flores abiertas y los brotes jóvenes, dejando solo los capullos florales en la etapa D24,según la etapa 57 en la escala BBCH25,26.</li>
		<li>Retire los pétalos, sépalos y estambres de entre 800 y 1,000 capullos de flores por tratamiento con uñas o pinzas.</li>
		<li>Polinizar a mano los pistilos con la ayuda de un pincel fino 24 h después de la castración. Algunas ramas contienen la mitad de los pistilos con polen del mismo cultivar, y la otra mitad con polen compatible de otro cultivar como control. Tenga cuidado de no contaminar la punta de los dedos o el pincel con granos de polen de otros cultivares.</li>
		<li>Registre los recuentos semanales de flores y frutos en desarrollo para caracterizar el patrón de caída de la fruta y cuantificar el conjunto final de la fruta en cada tratamiento de polinización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polinización suplementaria en el campo
	<ol>
<li>Unos días antes de que se abran las primeras flores, encier los árboles seleccionados en una jaula de malla de 0,8 mm para evitar la llegada de insectos polinizadores.</li>
		<li>Cuando el 10%-20% de las flores están abiertas, seleccione y etiquete varias ramas por tratamiento de polinización, dejando de 1,000 a 1,500 flores por tratamiento.</li>
		<li>Al día siguiente, cuando las flores estén abiertas, polinizar cada flor con la ayuda de un pincel con el polen correspondiente (polen del mismo cultivar para la autopolinización, y de otros cultivares compatibles como control de polinización cruzada).</li>
		<li>Polinizar cada dos días hasta que todas las flores se abran.</li>
		<li>Registre los recuentos semanales de flores y frutos en desarrollo desde la antesis hasta la cosecha para caracterizar el patrón de caída de la fruta y cuantificar el cuajado final de la fruta en cada tratamiento de polinización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Polinizaciones manuales en el laboratorio
<ol><li>Recolectar de 50 a 100 flores en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escalaBBCH 25,26.</li>
	<li>En el laboratorio, castrar 30 flores por tratamiento (autopolinización y polinización cruzada). NOTA: La emasculación debe procederse con cuidado para evitar cualquier daño en los pistilos.</li>
	<li>Haga un corte fresco en la base de cada pedicelo de flores bajo el agua antes de colocarlo en un trozo de espuma de floristería húmeda (una pieza de espuma para cada tratamiento de polinización).</li>
	<li>Polinizar a mano cada pistilo 24 h más tarde utilizando un pincel fino con polen recogido previamente (ver sección 1.1). Polinizar un conjunto de pistilos con polen del mismo cultivar, y el otro conjunto con polen de un cultivar compatible como control.</li>
	<li>Dejar los pistilos polinizados 72 h después de la polinización a temperatura ambiente. La espuma floral debe estar continuamente húmeda con agua.</li>
	<li>Fije los pistilos en una solución fijadora de etanol/ácido acético (3:1) durante al menos 24 h a 4 °C. Reemplace el fijador con etanol al 75%. Las muestras se pueden conservar en esta solución a 4 °C hasta su uso27. NOTA: Asegúrese de que las muestras estén completamente sumergidas en la solución.</li>
</ol>3. Observaciones microscópicas
<ol><li>
Evaluación de la germinación del polen in vitro
	<ol>
<li>Para elaborar el medio de germinación del polen, disuelva 25 g de sacarosa sobre 250 ml de agua destilada, luego agregue 0,075 g de nitrato de calcio [Ca(NO3)2] y 0,075 g de ácido bórico (H3BO3).</li>
		<li>Añadir 2 g de agar a la solución y mezclar hasta que se disuelva completamente28.</li>
		<li>Para esterilizar el medio, autoclave a 120 °C durante 20 min. Enfríe el medio y, antes de que se solidifique, distribuya 3 ml por placa de Petri estéril (55 mm x 12 mm) en una campana de flujo laminar estéril. Después de la solidificación media, conservar las placas de Petri envueltas en papel de aluminio a 4 °C hasta su uso.</li>
		<li>Esparce el polen de cada cultivar utilizado anteriormente como donante de polen en las polinizaciones controladas en dos placas de Petri e incube a 25 °C durante 24 h. NOTA: Los medios de cultivo inoculados se pueden observar con microscopía inmediatamente después o almacenarse a -20 °C hasta su uso. Para este propósito, las placas de Petri deben cambiarse del congelador al refrigerador 24 h antes de las observaciones de microscopía.</li>
		<li>Para observar los granos de polen, prepare una solución azul de anilina al 1% (v / v) que tiñe la callosa. Primero, prepare una solución tribásica de fosfato de potasio0.1 N(K 3 PO4)disolviendo 7.97 g de K3PO4 en 1,000 mL de agua destilada. Para elaborar la solución de azul de anilina al 1% (v/v), disuelva 1 ml de azul de anilina en 100 ml de 0,1 N K3PO4.</li>
		<li>Agregue 2-3 gotas de solución azul de anilina a cada placa de Placa de Petri y observe después de 5 minutos bajo un microscopio de epifluorescencia UV utilizando el filtro excitador BP340-390 y el filtro de barrera LP425. Cuente los granos de polen viables y no viables en tres campos por placa, cada campo contiene 100-200 granos de polen, en dos placas de Petri para cada cultivar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crecimiento del tubo de polen
	<ol>
<li>Enjuague los pistilos fijos con agua destilada tres veces (1 h cada uno, 3 h en total) y transfiera al 5% (p/v) de sulfito de sodio (Na2SO3)a 4 °C durante 24 h. Para preparar esta solución, disuelva 5 g de sulfito de sodio en 100 ml de agua destilada.</li>
		<li>Autoclave los pistilos a 120 °C durante 8 min en sulfito de sodio al 5% (p/v) para ablandar los tejidos.</li>
		<li>Pistilos suavizados de calabaza en una gota de solución azul de anilina al 1% (v / v) debajo de un vidrio de cubierta en un portaobjetos para teñir la callosa.</li>
		<li>Observe el crecimiento del tubo polen a lo largo del estilo bajo un microscopio con epifluorescencia UV utilizando el filtro excitador BP340-390 y el filtro de barrera LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Determinación de las relaciones de incompatibilidad
<ol><li>Extracción de ADN de las hojas<ol>
<li>Para extraer adn, recolecte de 3 a 4 hojas jóvenes de cada cultivar en el campo, preferiblemente en primavera. NOTA: El ADN también se puede extraer de hojas maduras, pero el ADN de hojas jóvenes tiene menos compuestos fenólicos.</li>
		<li>Aísle el ADN utilizando un kit comercial y siga el kit de protocolo proporcionado (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Cuantificar la concentración de ADN y evaluar la calidad del ADN de cada muestra a 260 nm en un espectrofotómetro de microvolumen UV-Vis. Ajustar la concentración de ADN a 10 ng/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condiciones de PCR para la amplificación de fragmentos<ol>
<li>Etiquete los tubos y tapas de PCR de 0,2 ml.</li>
		<li>Preparar los reactivos de PCR según la Tabla 1 y dejar que se descongelen sobre hielo.</li>
		<li>Configure un volumen de mezcla maestra de cada par de cebadores en un microtubo de 1,5 ml de acuerdo con el número de reacciones más el 10% del exceso, considerando un volumen de 16 μL por reacción. Añadir los reactivos siguiendo el orden de la Tabla 1 y mezclar bien.</li>
		<li>Alícuota 16 μL de mezcla maestra en cada tubo pcr de 0,2 ml que contenga 4 μL de plantilla de ADN o 4 μL de agua destilada esterilizada como control negativo (C-). Utilizar ADN de cultivares con genotipo conocido como controles positivos. Mezclar suavemente, cerrar los tubos de reacción con las tapas y centrifugar a 2.000 x g durante 30 s para recoger todo el volumen en la parte inferior del tubo de reacción.</li>
		<li>Coloque los tubos de reacción en el termociclador y configure el programa de PCR utilizando el siguiente perfil de temperatura: un paso inicial de 3 min a 94 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C y 3 min a 72 °C, y un paso final de 7 min a 72 °C20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Electroforesis y estimación del tamaño del fragmento<ol>
<li>Para preparar un mini gel de agarosa al 1,7% (p/v), disuelva 0,68 g de agarosa y 40 ml de tampón 1x TBE en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Derretir la solución calentando en un microondas a 600 W a intervalos de 30 s para evitar la ebullición.</li>
		<li>Deje que la solución permanezca en el banco para enfriarse y luego agregue 3.5 μL de solución de tinción de ácido nucleico.</li>
		<li>Coloque la bandeja de gel en el soporte de fundición y coloque el peine seleccionado en el molde de gel. Asegúrese de tener suficientes pozos para cada producto de PCR y escalera de ADN.</li>
		<li>Vierta la solución de agarosa en el molde de gel y deje que se enfríe hasta la polimerización. Retire el peine del gel polimerizado. Coloque el gel en el sistema de electroforesis horizontal que contenga suficiente tampón TBE 1x para cubrir la superficie del gel.</li>
		<li>Cargue el primer y último pozo con 2 μL de la escalera de peso molecular de ADN (escalera de ADN de 1 kb). Cargar 3 μL de cada producto de la PCR en los otros pozos. Cierre la cámara, encienda la alimentación y haga funcionar el gel a 100 V durante 30 minutos.</li>
		<li>Observe el gel bajo luz UV utilizando un sistema de documentación de gel. Utilice la escalera de peso molecular del ADN para determinar el tamaño del fragmento amplificado y compararlo con los controles positivos para identificar los alelos correspondientes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Monitoreo de fechas de flores
<ol><li>Monitorear la fenología de los diferentes árboles de cada cultivar en la floración durante diferentes años. Establezca la duración del período de floración desde la primera (aproximadamente 5%) hasta las últimas flores abiertas (aproximadamente 95%). La floración completa se considera cuando al menos el 50% de las flores están en la etapa F24,de acuerdo con la etapa 65 en la escala BBCH25,26.</li>
	<li>Para comparar las fechas de floración de los cultivares intercompatibles y determinar aquellas que coinciden en la época de floración cada año, elabore un calendario de tiempos de floración con datos de varios años.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La metodología descrita en este documento para los requisitos de polinización de los cultivares de ciruela japonesa requiere determinar la auto(in)compatibilidad de cada cultivar mediante polinizaciones controladas en el campo o el laboratorio, y la posterior observación del crecimiento del tubo de polen con microscopía de fluorescencia. Las relaciones de incompatibilidad se establecen mediante la caracterización de los alelos Smediante genotipado molecular. Por último, la selección de polinizadores se realiza m...

La ciruela japonesa(Prunus salicina Lindl.) es originaria de China1. En elsiglo 19, este cultivo se introdujo desde Japón a los Estados Unidos, donde se cruzó con otras ciruelas diploides de América del Norte2. En elsiglo 20, algunos de estos híbridos se extendieron a regiones templadas de todo el mundo. Hoy en día, el término "ciruela japonesa" se refiere a una amplia gama de híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el original P. salicina con hasta otros 15 Prunus diploides spp.3,4,5.
La ciruela japonesa, al igual que otras especies de la familia Rosaceae, exhibe autoincompatibilidad gametofítica (GSI), que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos6. El locus Scontiene dos genes que codifican una ribonucleasa(S-RNasa)expresada en el pistilo, y una proteína F-box (SFB) expresada en el grano de polen7. En la reacción de autoincompatibilidad, cuando el alelo Sexpresado en el grano de polen (haploide) es el mismo que uno de los dos expresados en el pistilo (diploide), el crecimiento del tubo polínico a través del estilo se detiene debido a la degradación del ARN del tubo polen por la acción de la S-RNasa8. Dado que este proceso impide la fertilización del gametofito femenino en el óvulo, GSI promueve el cruce entre cultivares.
Aunque algunos cultivares de ciruela japonesa son autocompatibles, la mayoría de los cultivares que se cultivan actualmente son autoincompatibles y necesitan polen de donantes intercompatibles para fertilizar sus flores3. En las especies de frutas de hueso del género Prunus como la almendra9,el albaricoque10,11,12 y la cereza dulce13,los requisitos de polinización de los cultivares se pueden establecer mediante diferentes enfoques. La auto(in)compatibilidad puede determinarse mediante la autopolinización de flores en el campo y el posterior monitoreo del cuajado de la fruta, o mediante autopolinizacións semi-in vivo en condiciones controladas en un laboratorio y la observación de tubos de polen bajo el microscopio14,15,16,17,18 . Las relaciones de incompatibilidad entre cultivares pueden determinarse mediante polinizaciones cruzadas en el campo o en el laboratorio utilizando polen del cultivar polinizador potencial, y mediante la identificación de alelos Sde cada cultivar mediante análisis de PCR14,15,16,19,20,21,22 . En especies como la cereza dulce o la almendra, la auto(in)compatibilidad también se puede evaluar mediante la identificación de alelos S particulares asociados a la autocompatibilidad, como S4' en cereza dulce13 o Sf en almendra23.
Varios programas de mejoramiento de ciruelas de los principales países productores están liberando una serie de nuevos cultivares2,14,muchos de ellos con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La auto(in)compatibilidad está determinada por autopolinizaciones tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia. La selección de cultivares polinizadores combina la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Azul de anilina</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 &punto medio; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera Software Suite</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>ADN Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM cada uno</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ADN polimerasa</td><td>verde ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96&grados;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb Escalera de ADN (Patente de EE. UU. No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Tamaño: 250&micro; g; Conc: 1.0 y micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Sistema de documentación de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Contador de mano</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Software de laboratorio de imágenes</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Sistema de análisis de imágenes para gel Sistema de documentación</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio con UV eflurescencia</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Filtro excitador BP340-390, Filtro de barrera LP425</td></tr><tr><td>Microportaobjetos</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini Sistema de electroforesis</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Espectrofotómetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Deltalab 200201</td><td></td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Fosfato de Potasio Tribásico (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer forward Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverse 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Solución de tinción de ácidos nucleicos</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools kit de extracción de ADN vegetal</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Termomezclador confort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave vertical Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Los cultivares de ciruela japonesa comúnmente cultivados son híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el Prunus salicina original con otras especies de Prunus. La mayoría de los híbridos exhiben autoincompatibilidad gametofítica, que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos. La mayoría de los híbridos cultivados son autoincompatibles y necesitan polen de un donante compatible para fertilizar sus flores. El establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa es cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La autocompatibilidad se determina mediante polinizaciones manuales tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de un monitoreo del alargamiento del tubo polínico con microscopía de fluorescencia y también un monitoreo de la maduración de la fruta en el campo. La selección de cultivares polinizadores se evalúa combinando la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo. Conocer los requerimientos de polinización de los cultivares facilita la selección de cultivares para el diseño de nuevos huertos y permite la detección temprana de problemas de productividad relacionados con la deficiencia de polinización en huertos establecidos.

Cada capullo de flor de ciruelo japonés contiene una inflorescencia con 1-3 flores. Al igual que en otras especies de frutas de hueso, cada flor se compone de cuatro verticilos: carpelo, estambres, pétalos y sépalos, que se fusionan formando una copa en la base de la flor. Las estructuras florales son más pequeñas que otras frutas de hueso, con un pistilo corto y frágil rodeado por los estambres que contienen una pequeña cantidad de granos de polen. En plena floración, las flores de cada inflorescencia aparecen separadas...

Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Este protocolo se está volviendo cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares de ciruela japonesa autoincompatibles con requisitos de polinización desconocidos. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar los requisitos de polinización de los cultivares mediante la combinación de dos enfoques complementarios en condiciones de campo y laboratorio. Este enfoque también se puede aplicar para determinar los requisitos de polinización y otras especies de árboles frutales autoincompatibles como el albaricoque o el cerezo dulce.Para la extracción de polen, recoja los botones florales en la etapa de globo de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH. Retire las anteras con una malla de plástico y colóquelas sobre papel a temperatura ambiente durante 24 horas hasta la dehiscencia de la antera. Tamizar los granos de polen a través de una malla fina y conservarlos en un tubo de vidrio de 10 milímetros con una tapa a cuatro grados centígrados hasta su uso.Cuando el 10 al 20% de las flores estén abiertas, seleccione y etiquete varias ramas, dejando de 1.000 a 1.500 flores por tratamiento de polinización. Al día siguiente, cuando haya más flores abiertas, polinice cada flor con un pincel con polen del mismo cultivar para la autopolinización y polen de otros cultivares como control de polinización cruzada. Polinizar todos los días hasta que todas las flores estén abiertas.Registre los recuentos semanales de flores y frutos en desarrollo desde la antesis hasta la cosecha para caracterizar el patrón de caída de la fruta y cuantificar el cuajado final de la fruta en cada tratamiento de polinización. Recoja de 50 a 100 flores en la etapa de globo de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH. Emascular 30 flores por tratamiento en el laboratorio para autopolinización y polinización cruzada.Haz un corte fresco en la base de cada pedículo de flor bajo el agua y colócalo sobre un trozo de espuma de floristería húmeda. Utilice una pieza de espuma para cada tratamiento de polinización. Pasadas las 24 horas, polinizar a mano cada pistilo con el polen recogido previamente con un pincel fino.Polinizar un conjunto de pistilos con polen del mismo cultivar y el otro conjunto con polen de otro cultivar compatible como control. Fije estos pistilos polinizados en una solución fijadora de etanol y ácido acético durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados. Esparcir el polen de cada cultivar previamente utilizado como donante de polen en las polinizaciones en dos placas de Petri e incubarlas a 25 grados centígrados durante 24 horas.Para observar los granos de polen, agregue dos o tres gotas de solución de azul de anilina a cada placa de Petri y obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia UV después de cinco minutos. Cuente los granos de polen viables y no viables en los tres campos por placa de Petri, con cada campo conteniendo alrededor de 100 a 200 granos de polen en dos placas de Petri para cada cultivar. Para observar los tubos polínicos, aplaste los pistilos reblandecidos en una gota de solución azul de anilina al 1% debajo de un cubreobjetos en un portaobjetos.Observe el crecimiento del tubo polínico a lo largo del estilo bajo un microscopio con epifluorescencia UV utilizando el filtro excitador BP340-390 y el filtro de barrera LP425. Recoja de tres a cuatro hojas jóvenes de cada cultivar en el campo y extraiga el ADN de las hojas. Prepare una mezcla maestra para cada par de cebadores en microtubos de 1,5 mililitros.Agregue todos los reactivos y mezcle bien. Alícuota 16 microlitros de esta mezcla maestra en cada tubo de PCR de 200 microlitros que contiene cuatro microlitros de ADN molde o control. Mezclar suavemente, cerrar los tapones y centrifugar a 2.000 veces G durante 30 segundos.Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de PCR como se menciona en el manuscrito del texto. Para estimar el tamaño del fragmento mediante electroforesis en gel, cargue el primer y el último pocillo con dos microlitros de la escalera de ADN y tres microlitros del producto de PCR en los otros pocillos. Cierre la cámara y haga funcionar el gel a 100 voltios durante 30 minutos.Observe el gel bajo luz ultravioleta utilizando un sistema de imágenes de gel. Utilice la escalera de ADN para estimar el tamaño de los fragmentos amplificados y compararlo con los controles positivos y negativos. Monitorear la fenología de los diferentes árboles de cada cultivar durante diferentes años de floración.Establecer la duración del período de floración desde las primeras hasta las últimas flores abiertas. Se considera la floración completa cuando al menos el 50% de las flores se encuentran en la etapa F de acuerdo con la etapa 65 en el BBCH. El patrón de caída de frutos de las flores polinizadas a mano después de la emasculación o polinización suplementaria mostró que la mayoría de las flores cayeron dos o tres semanas después de la polinización, pero el 4% de las flores autopolinizadas permanecieron en el árbol, lo que indica que este cultivar es autocompatible.Los granos de polen viables mostraron un tubo polínico más largo que su longitud después de 24 horas en el medio de cultivo y los granos de polen no viables no germinaron. Durante la polinización, los granos de polen se transfirieron al estigma. Cada grano de polen en germinación producía un tubo polínico, que crecía a través de las estructuras del pistilo.En los cultivares autoincompatibles, el tubo polínico dejó de crecer en el tercio superior del estilo. Sin embargo, en cultivares autocompatibles, el tubo polínico podría crecer a través del estilo, llegar al ovario y fertilizar un óvulo. El análisis de PCR se llevó a cabo utilizando cebadores de las regiones conservadas de los ARNs de cereza dulce y ciruela japonesa, lo que permitió determinar el tamaño de los alelos S en cada cultivar.Se calculó la duración del período de floración para un total de cuatro años. La floración en condiciones de huerto permitió determinar qué cultivares coinciden en el momento de la floración cada año. Al intentar este protocolo, asegúrese de usar un mayor número de flores de ciruela japonesa para la polinización manual, ya que el porcentaje de cuajado es muy bajo en comparación con otras especies de Prunus.No es posible determinar la autoincompatibilidad por abordajes moleculares. Se requiere más trabajo de secuenciación de alelos S para evaluar si algunos alelos S están asociados con la autocompatibilidad. La combinación de enfoques de campo y laboratorio ha dado como resultado información valiosa para el diseño de nuevos huertos comerciales y se puede utilizar en otras especies de árboles frutales.

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Para revelar la eficacia polinizador de una especie de planta dada, se han desarrollado varios métodos de los experimentos de campo. Este estudio demuestra los métodos básicos de los experimentos de campo de ecología de la polinización utilizando el estudio de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea y el nuevo mecanismo de polinización, rompiendo capullo de la polinización.

Los experimentos de campo de Ecología de la Polinización: el caso de<em&gt; Sanguinea Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Aquí, presentamos un protocolo para forzar la floración en mandarinos en condiciones Fitotrón. Agua estrés, alta iluminación y fotoperiodo resorte simulado permitida flores viables obtener en un corto período de tiempo. Esta metodología permite a los investigadores tener varios periodos de floración en 1 año.

Floración forzada en mandarinos Phytotron condiciones

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Presentamos una metodología para establecer los requisitos de polinización de los cultivares de albaricoque (Prunus armeniaca L.) que combinan la determinación de la auto-(in)compatibilidad por microscopía de fluorescencia con la identificación del S-genotipo por análisis PCR.

Determinación de las relaciones de autoejecución e inter-(in) en albaricoque que combinan la polinización manual, la microscopía y los análisis genéticos

Este protocolo proporciona un método rápido para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen en cultivares de cítricos.

Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S

Aquí, describimos una mejora del método semi-in vitro (SIV) para observar la guía y recepción del tubo polínico en Arabidopsis thaliana, lo que aumenta la receptividad de los óvulos. El método SIV cum septum de alto rendimiento puede combinarse con líneas marcadoras de gametofitos y biosensores codificados genéticamente para monitorear el proceso dinámico de fertilización.

Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum

Aquí se describe un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana . El nuevo método ofrece una resolución más alta, no es invasivo y es altamente reproducible. El protocolo representa una nueva herramienta para una disección más fina de los procesos que regulan las primeras etapas de la polinización.

Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de grano único de alta resolución para Arabidopsis thaliana

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Para estudiar el mecanismo de utilización de lípidos en las membranas del saco vitelino durante las últimas etapas del desarrollo embrionario de las aves, establecimos un sistema primario de cultivo de células epiteliales endodérmicas embrionarias de codorniz japonesa.

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

Aprende a determinar los requisitos de polinización en ciruelas japonesas mediante polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular por PCR. Este método combina técnicas de campo y laboratorio.

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

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