Un ensayo mejorado y herramientas para medir la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila

Este protocolo es importante porque permite al usuario construir una herramienta que se puede utilizar para medir con precisión las respuestas mecánicas de nocicepción en larvas de Drosophila genéticamente tratables. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza materiales simples para construir herramientas personalizadas que se pueden usar para medir la nocicepción mecánica desde el subumbral hasta el rango de respuesta completa. Estas herramientas y métodos se pueden utilizar para medir la nocicepción mecánica basal y la sensibilización nociceptiva después de una lesión o enfermedad.

El sondeo de larvas con filamentos personalizados requiere práctica. Los usuarios deben ser capaces de generar curvas de dosis-respuesta con larvas de control antes de intentar un experimento. Para construir una sonda mecánica, use un pequeño cortador de alambre para cortar cada filamento de nitinol a la longitud especificada perpendicular a su eje largo.

Los filamentos vienen en tres diámetros preestablecidos diferentes. Examine la punta de los filamentos bajo un microscopio estereoscópico para asegurarse de que no queden bordes afilados o irregulares que puedan causar daño tisular a la piel de la larva e interferir con la calibración. A continuación, utilice una piedra de afilar para alisar manualmente los bordes de la sonda hasta que no persistan irregularidades afiladas.

A continuación, use una aguja hipodérmica para hacer un agujero cerca del extremo de un palito de paleta de madera. Aplique pegamento para madera a un solo filamento de Nitinol e inserte el filamento recubierto de pegamento en la ranura de la aguja. Cuando el pegamento se haya secado, presione la sonda contra la escala hasta que la sonda se doble para determinar la fuerza máxima que se puede registrar en gramos.

Utilice la fórmula para convertir la masa registrada en fuerza en milinewtons. A continuación, divida la fuerza medida por la superficie de la punta del filamento para convertir la fuerza calculada en kilopascales de presión. La preparación de múltiples sondas utilizando filamentos de diferentes diámetros y longitudes generará un conjunto completo, que abarca el rango de respuesta para las larvas de Drosophila.

Para preparar las larvas de Drosophila para un experimento, cría la progenie larvaria con alimento estándar en una incubadora a 25 grados centígrados durante aproximadamente 96 horas. Cuando las larvas alcancen la etapa del tercer estadio, prepare un tapón de alimento para moscas en una pequeña placa de Petri para que las larvas sean analizadas y use pinzas para separar suavemente las larvas de tamaño mediano del segundo y tercer estadio más pequeño y del tercer estadio más pequeño y de las larvas más grandes del tercer estadio tardío o errante. Luego use las pinzas para transferir de 20 a 30 larvas de estadio medio a una pequeña placa de Petri que contiene un pequeño tapón de comida para moscas humedecida con agua a temperatura ambiente.

Para realizar un ensayo de nocicepción mecánica, use pinzas para colocar una larva de estadio medio del tercio en una almohadilla de vinilo delgada y oscura debajo de un microscopio estereoscópico de campo claro y coloque las luces de fibra óptica entre las lentes del objetivo del microscopio y la almohadilla. Use una toalla de papel para limpiar el exceso de agua que rodea a la larva y mueva la almohadilla para orientar la cabeza y la boca de la larva hacia la mano no dominante del investigador. Seleccione una sonda mecánica y aplique la sonda en el lado dorsal posterior de la larva aproximadamente en el segmento abdominal A8 durante uno o dos segundos, comprimiendo cuidadosamente la larva en la almohadilla subyacente en el punto de contacto de la sonda hasta que la sonda se doble y provoque la cantidad de presión medida anteriormente.

Una respuesta nociceptiva positiva está indicada si la larva muestra un giro completo en sacacorchos de 360 grados a lo largo del eje de su cuerpo en tres segundos. Registre la respuesta conductual de cada larva. A continuación, deseche la larva analizada y prepare la siguiente larva para el ensayo.

Estas sondas mecánicas personalizadas con filamentos de nitinol se pueden utilizar para provocar comportamientos evocados mecánicamente y para generar una curva de dosis-respuesta de comportamiento completa utilizando sondas mecánicas inocuas y nocivas de intensidad variable. Como demuestran los resultados de estos ensayos de comportamiento, las sondas que ejercen una presión de 200 kilopascales o menos no provocan una respuesta de balanceo aversiva en las larvas de Drosophila. Como era de esperar, estas sondas mecánicas subumbral o no nocivas no provocan daños visibles en el tejido neuronal.

Por el contrario, las sondas de superumbral o nocivas provocan una respuesta conductual aumentada, así como daños en los tejidos de las propias neuronas sensoriales periféricas de forma dependiente de la dosis. Estas sondas también se pueden utilizar para medir la hipersensibilidad mecánica después de una lesión. Aproximadamente el 20% de las larvas responden con balanceo aversivo tan pronto como dos horas después del tratamiento con UV, mientras que el 50% respondió cuatro horas en comparación con los animales irradiados con UV simulados.

Debido a que la sonda utilizada para este análisis era normalmente subumbral de 200 kilopascales, esta respuesta se consideró como alodinia mecánica. En puntos de tiempo posteriores, la respuesta conductual de las larvas tratadas con UV aumenta ligeramente, pero no difiere estadísticamente de la del grupo de control irradiado simulado. Las larvas sondeadas con una sonda de 462 kilopascales a las cuatro, ocho y 16 horas después del tratamiento UV muestran un aumento significativo en la respuesta de balanceo aversivo, siendo cuatro horas el pico de la hipersensibilidad conductual, ya que el estímulo fue inicialmente nocivo.

Se consideró que la respuesta era hiperalgesia mecánica. La preparación de la sonda y la selección y compresión de larvas son fundamentales para el éxito del proceso. Con el uso de estas sondas se puede medir la nocicepción basal y la hipersensibilidad nociceptiva mecánica después de una lesión.

Utilizando estas herramientas y ensayos, las bases moleculares y genéticas de la nocicepción mecánica y la hipersensibilidad nociceptiva se pueden medir en el modelo genéticamente tratable de Drosophila.