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Artículo de método

Elaboración de perfiles del repertorio de receptores-ligandos de células asesinas naturales humanas

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DOI:

10.3791/61912

⸱

19 de noviembre de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Program in Immunology, Stanford University School of Medicine, 3Chan-Zuckerberg BioHub

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí diseñamos dos paneles complementarios de citometría de masas (CyTOF) y optimizamos un protocolo de tinción de CyTOF con el objetivo de perfilar el receptor de células asesinas naturales y el repertorio de ligandos en el contexto de infecciones virales.

Resumen

Las células asesinas naturales (NK) se encuentran entre las primeras en responder a las infecciones virales. La capacidad de las células NK para reconocer y matar rápidamente las células infectadas por el virus está regulada por su expresión de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal. La participación de estos receptores por parte de sus ligandos afines en las células diana determina si la interacción intercelular dará lugar a la muerte de las células NK. Este protocolo detalla el diseño y optimización de dos paneles complementarios de citometría de masas (CyTOF). Se diseñó un panel para fenotipar las células NK en función de la expresión del receptor. El otro panel fue diseñado para interrogar la expresión de ligandos conocidos para los receptores de células NK en varios subconjuntos de células inmunitarias. Juntos, estos dos paneles permiten el perfil del repertorio de receptores-ligandos de células NK humanas. Además, este protocolo también detalla el proceso mediante el cual tiñimos muestras para CyTOF. Este proceso se ha optimizado para mejorar la reproducibilidad y la estandarización. Una ventaja de CyTOF es su capacidad para medir más de 40 marcadores en cada panel, con una superposición mínima de señales, lo que permite a los investigadores capturar la amplitud del repertorio de receptores y ligandos de células NK. El código de barras de paladio también reduce la variación entre muestras, así como el consumo de reactivos, lo que facilita la tinción de muestras con cada panel en paralelo. Las limitaciones de este protocolo incluyen el rendimiento relativamente bajo de CyTOF y la incapacidad de recuperar células después del análisis. Estos paneles fueron diseñados para el análisis de muestras clínicas de pacientes que padecen infecciones virales agudas y crónicas, incluyendo el virus del dengue, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la influenza. Sin embargo, se pueden utilizar en cualquier entorno para investigar el repertorio de ligandos receptores de células NK humanas. Es importante destacar que estos métodos se pueden aplicar ampliamente al diseño y la ejecución de futuros paneles CyTOF.

Introducción

Las células asesinas naturales (NK) son células inmunitarias innatas cuya función principal es atacar y matar las células malignas, infectadas o estresadas. A través de su secreción de citocinas como IFNγ y TNFα, así como su actividad citotóxica, las células NK también pueden dar forma a la respuesta inmunitaria adaptativa a patógenos y neoplasias malignas. La respuesta NK está mediada en parte por la señalización combinatoria de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal, que se unen a una miríada de ligandos expresados en las células diana potenciales. Varios receptores de células NK tienen más de un liga....

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Protocolo

Las PBMC anónimas de adultos sanos se obtuvieron de cámaras del sistema de leucorreducción compradas al Centro de Sangre de Stanford. Los PBMC de donantes pediátricos sanos no identificados y pacientes pediátricos con dengue agudo se obtuvieron del Instituto Conmemorativo de Estudios en Salud Gorgas en la Ciudad de Panamá, Panamá y hospitales pertenecientes al Ministerio de Salud, el Sistema de Seguro Social en la Ciudad de Panamá y áreas suburbanas. El protocolo del estudio del dengue fue aprobado por el IRB del Hospital del Niño (CBIHN-M-0634), luego aprobado por los comités del ICGES, CSS, Hospital Santo Tomás y Universidad de Stan....

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Resultados

Los anticuerpos se conjugaron con isótopos metálicos utilizando kits de etiquetado disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones de anticuerpos se validaron mediante citometría de flujo y citometría de masas antes de su uso en este panel. Se seleccionó una lista inicial de clones basada en la revisión de la literatura y la disponibilidad de anticuerpos. Los niveles de expresión de algunos ligandos para los receptores de células NK son bajos o indet.......

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Discusión

Aquí describimos el diseño y la aplicación de dos paneles CyTOF complementarios destinados a perfilar el repertorio de receptores-ligandos de células NK. Este protocolo incluye varios pasos que son críticos para obtener datos de calidad. CyTOF utiliza iones de metales pesados, en lugar de fluorocromos, como sondas de marcaje para anticuerpos19. Por lo tanto, esta tecnología está sujeta a posibles señales contaminantes de los metales ambientales20.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a todos los miembros actuales y anteriores del Laboratorio Blish que contribuyeron a este panel. Gracias al Grupo de Ensayos Clínicos sobre el SIDA y al equipo de ACTG A5321, así como a la Dra. Sandra López-Vergès y Davis Beltrán del Gorgas Memorial Institute for Health Studies por la selección de muestras. Finalmente, gracias a Michael Leipold, Holden Maecker y el Centro de Monitoreo Inmunológico Humano de Stanford por el uso de sus máquinas Helios. Este trabajo fue apoyado por NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 y Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
89YSigma-Aldrich204919
102-Nitrato de paladioespecialinternacional de Trace Sciences
104-Nitrato de paladioespecialinternacional de Trace Sciences
106-Nitrato de paladioespecialinternacional de Trace Sciences
108-Nitratode paladioTrace SciencesInternational Special Order
115InTrace Sciences InternationalOrder
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144NdFluidigm201144A
145NdFluidigm201145A
146NdFluidigm201146A
147SmFluidigm201147A
148NdFluidigm201148A
149SmFluidigm201149A
150NdFluidigm201150A
151EuFluidigm201151A
152SmFluidigm201152A
153EuFluidigm201153A
154SmFluidigm201154A
155GdFluidigm201155A
156GdFluidigm201156A
157GdTrace Sciences InternationalN/A
158GdFluidigm201158A
159TbFluidigm201159A
160GdFluidigm201160A
161DyFluidigm201161A
162DyFluidigm201162A
163DyFluidigm201163A
164DyFluidigm201164A
165HoFluidigm201165A
166erFluidigm201166A
167ErFluidigm201167A
168ErFluidigm201168A
169TmFluidigm201169A
170ErFluidigm201170A
171YbFluidigm201171A
172YbFluidigm201172A
173YbFluidigm201173A
174YbFluidigm201174A
175LuFluidigm201175A
176YbFluidigm201176A
209Bi anti-CD16Fluidigm3209002BClon 3G8. Se utiliza en una dilución de 1:50.
697 celdasCreative BioarrayCSC-C0217
Amicon Unidades de Filtro Ultra Centrífugo 0.5 con Membrana Ultracel-30, 30 kDaMilliporeUFC503096
AcetonitriloAnhidro Fisher ScientificBP1165-50
anti-2B4Biolegend329502 Clon C1.7.
anti-B7-H6R& D SystemsMAB7144clonar 875001.
357202de Biolegendanti-CCR2K036C2.
Biolegend300202RPA-2.10anti-CD2
anti-CD3Biolegend300402Clon UCHT1.
Biolegend317402OKT4anti-CD4
clon anti-CD4Biolegend344602SK3.
Biolegend343102anti-CD7 CD7-6B7.
anti-CD8Biolegend344702Clon SK1.
clon anti-CD11bBiolegend301302ICRF44.
301802de Biolegendanti-CD14M5E2.
anti-CD19Biolegend302202Clon HIB19.
anti-CD33Biolegend303402Clon WM53.
anti-CD38Biolegend303502 ClonHIT2.
anti-CD48Biolegend336702Clon BJ40.
anti-CD56BD Pharmingen559043clon NCAM16.2.
anti-CD57Biolegend322302Clon HCD57.
anti-CD62LBiolegend304802Clon DREG-56.
anti-CD69Biolegend310902Clon FN50.
anti-CD94Biolegend305502Clon DX22.
anti-CD95Biolegend305602Clon DX2.
anti-CD155Biolegend337602clon SKII.4.
anti-CXCR6Biolegend356002Clon K041E5.
anti-DNAM-1BD Biosciences559787Clon DX11.
anti-DR4Biolegend307202clon DJR1.
anti-DR5Biolegend307302Clon DJR2-2.
NOK-1Biolegend306402anti-FAS-L
anti-FcRgMillipore06-727Anticuerpo policlonal.
anti-HLA-C,EMilliporeMABF233Clon DT9.
anti-HLA-Bw4Miltenyi BiotecClon de pedido especialREA274.
anti-HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530Clon REA143.
Biolegend307602L243anti-HLA-DR
Biolegend3426023D12anti-HLA-E
anti-ICAM-1Biolegend353102Clon HA58.
anti-Ki-67Biolegend350502clon Ki-67.
anti-KIR2DL1/KIR2DS5R& D SistemasMAB1844clonar 143211.
anti-KIR2DL3R& D SystemsMAB2014clonar 180701.
anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Clon UP-R1.
anti-KIR2DS4R& D SystemsMAB1847clonar 179315.
anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Clon DX-9.
clon anti-LFA-3Biolegend330902TS2/9.
anti-LILRB1R& D Systems292319clonar MAB20172.
anti-LLT-1R& D SystemsAF3480Clon 402659.
anti-MICAR& D SystemsMAB1300-100clonar 159227.
anti-MICBR& D SystemsMAB1599-100Clon 236511.
anti-Nectina-1Biolegend340402Clon R1.302.
anti-Nectina-2Biolegend337402Clon TX31.
anti-NKG2AR& D SystemsMAB1059clonar 131411.
anti-NKG2CR& D SystemsMAB1381clonar 134522.
anti-NKG2DBiolegend320802Clon 1D11.
anti-NKp30Biolegend325202Clon P30-15.
anti-NKp44Biolegend325102Clon P44-8.
anti-NKp46Biolegend331902Clon 9E2.
Biolegend317202anti-NTB-A.
anti-Pan HLA clase IBiolegend311402Clon W6/32.
clon anti-PD1Biolegend329902EH12.2H7.
anti-PerforinaAbcamab47225Clon B-D48.
anti-Siglec-7Biolegend347702Clon S7.7.
Biolegend644302anti-Syk4D10.2.
clon antitáctilde Biolegend338402NK92.39.
anti-TIGITR& D SystemsMAB7898clonar 741182.
anti-ULBP-1R& D SystemsMAB1380-100Clon 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6R& D SystemsMAB1298-100clon 165903.
Estabilizador de anticuerposCandor Bioscience131 050
Benzonasa nucleasaMillipore70664
Solución TCEP para romper enlacesThermo Fisher Scientific77720
Solución de albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9576
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Dicloruro de cis-platino(II)diamina (cisplatino)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250Se preparó una solución madre de 100 mM en DMSO y se dividió en 25 µ L alícuotas. Utilizado en un 25 µ Dilución M para tinción viva/muerta. La señal aparece en los canales 194Pt y 195Pt.
DMSOSigma-AldrichD2650
tampón de permeabilización eBioscienceThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0,5 M)HoeferGR123-100Se elaboró un tampón HEPES de doble concentración con EDTA según la siguiente receta: 1,3 g de NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg de CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl22PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 mL de 1M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mL de 0,5M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, EE. UU.) y 100 mL H2O. El pH de este tampón HEPES de doble concentración se ajustó a un pH de 7,3 utilizando 1M de HCl y 1M de NaOH.
EQ Cuentas de calibración de cuatro elementosFluidigm201078
Suero fetal bovinoThermo Fisher ScientificN/A
Citómetro de masa HeliosFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Solución antibiótica/antimicótica (pluma/estreptococo/fungiezona) soluciónFisher Scientific
Iridium - Intercalador 191Ir/193IrDVS Sciences (Fluidigm)201192BUtilizado en una dilución 1:10000.
Isotiocianobencil-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Diluido a 1,25 mg/mL en acetonitrilo anhidro.
Células K562Colección de cultivos tipo americano (ATCC)ATCC CCL-243
L-glutamina (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Kits de etiquetado de anticuerposFluidigmN/ASin número de catálogo, ya que los kits vienen con metales. 
Unidad de filtro de jeringa Millex-VV, 0.1 y micro; mMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Sistema de purificación de aguaMilliporeZ00Q0V0WW
MS ColumnasMiltenyi Biotec
NALM6 CélulasAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Dispositivos centrífugos con membrana Omega 3KPall CorporationOD003C35
Kit de aislamiento de células NK, humanoMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldehído (16%)Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo Fisher ScientificQ10179Clon SJ25-C1. Se utiliza en una dilución de 1:50. La señal aparece en los canales 112Cd-114Cd.
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Clon Tü36. Se utiliza en una dilución de 1:200.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Se utiliza para fabricar CyPBS (10X Rockland PBS diluido a 1X en agua Milli-Q) y tampones CyFACS (10X Rockland PBS diluido a 1X en agua Milli-Q con 0,1% de BSA y 0,05% de azida de sodio). Los tampones se filtraron estérilmente a través de un 0,22 µ Filtro M y sotred a 4 & grados; C en botellas de Stericup.
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
Azida de sodio (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP Sistema de filtración al vacío estérilMillipore SigmaS2GPU10RE
Solución de ajusteFluidigm201072
Solución de lavado Fluidigm201070
Orden Orden Orden Special clon clon de .clon de .clon de clon clon de .clon de .clon de .clon NT-7 de clon de SV3007901

Referencias

  1. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (3), 200-218 (2020).
  2. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  3. Eller, M. A., Currie....

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