Name: Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a construir un sistema de iluminación versátil para experimentos optogenéticos con LEDs programables. Este protocolo detallado permite controlar la expresión génica con luz roja e infrarroja de forma económica.

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Nos gustaría agradecer a Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang y Molly Allen por probar diferentes versiones del sistema LED a medida que se desarrollaba. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Kavli para el Cerebro y la Mente en UC San Diego y el Instituto Salk, Fundación Nacional de Ciencias a través del Centro NSF para la Ciencia de la Información bajo la subvención CCF-0939370, la subvención NS060847 de los NIH y la subvención R21DC018237 de los NIH.

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<li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li>
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<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li>
<li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptochrome%2C+phytochrome%2C+and+anthocyanin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li>
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<li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737(2020).</li>
<li>Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363(2016).</li>
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<li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256(2015).</li>
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<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li>
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<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El sistema LED descrito aquí se ha utilizado en nuestro laboratorio para optimizar, caracterizar y trabajar con varias herramientas optogenéticas. En Kyriakakis et al.4, probamos muchas combinaciones de interruptores genéticos PhyB-PIF en paralelo. Luego utilizamos este sistema para probar pulsos de luz a diferentes frecuencias para medir la cinética del cambio genético y la intensidad efectiva de la luz. Este sistema también fue utilizado para optimizar y caracterizar dos sistemas optogenéticos que utilizan luz azul para la estimulación 5,6. Dado que solo un LED necesitaba ser lo suficientemente brillante como para activar la mayoría de las herramientas optogenéticas, no siempre es necesario comprar un sistema con un gran número de LED sobre cada pozo. Esta configuración es económica, confiable, fácil de reconfigurar y no requiere experiencia eléctrica previa para seguir el protocolo de ensamblaje.
En las figuras suplementarias 31-38, describimos cómo incorporar hasta cuatro LED en el sistema. Si bien esto puede limitar algunos experimentos que requieren una gran cantidad de condiciones paralelas, se pueden agregar más LED reemplazando la fuente de alimentación de 9 voltios utilizada en este protocolo por una de mayor potencia. Del mismo modo, se pueden conectar varios LED de menor potencia en paralelo a cada circuito. En esta última disposición, algunos LED no se controlarán individualmente, pero esto puede ser útil cuando se requieren muchos LED para cubrir un área más grande. Una vez familiarizado con la electrónica de este sistema, hay muchas maneras de personalizarlo. Las estrategias adicionales para personalizar el sistema incluyen colocar el LED más lejos o más cerca de la muestra e iluminar a través de filtros / difusores para condiciones de iluminación homogéneas o para evitar el calentamiento como en (Figura complementaria 23) y Allen et al.5. Otra característica notable de nuestro diseño LED es que está encapsulado en epoxi y tiene un cierre táctil en la parte posterior; esto permite que el LED se coloque de forma segura y fácil prácticamente en cualquier lugar: en incubadoras, peceras, jaulas de animales, paredes, etc.
Muchos experimentos que utilizan la optogenética para controlar genes, vías de señalización y otras actividades celulares a menudo requieren pulsaciones, abarcan grandes escalas de tiempo o deben realizarse en una incubadora, por lo tanto, requieren automatización o manipulación remota sin un microscopio. Este sistema LED ha sido probado continuamente durante varios meses dentro de una incubadora humidificada deCO2 sin ningún problema. Además, con sistemas reversibles como los sistemas optogenéticos PhyB, el experimentador puede necesitar programar programas específicos de iluminación pulsante. En nuestro trabajo anterior4, utilizamos programas pulsantes para probar la dinámica de reversibilidad de un interruptor PhyB-PIF3 en células de mamíferos a través de la interfaz de usuario. Utilizando la metodología descrita en este manuscrito, programar un protocolo pulsante es fácil, proporcionando la flexibilidad y autonomía necesarias para muchos tipos de experimentos optogenéticos de una manera fácil de usar.
Los pasos más críticos en la construcción de este sistema incluyen armar el circuito eléctrico en la placa PCB y conectar los componentes, que se detallan en la sección 1 y la sección 2. Es esencial seguir cuidadosamente cada paso en estas secciones y verificar los números de estenopeicos línea por línea antes de soldar cada componente. La Sección 2 explica cómo configurar los componentes que se conectarán al circuito. Para que los componentes se conecten en la orientación correcta, es particularmente importante asegurarse de que los colores de los cables negros y rojos en los conectores de cable a cable coincidan. Es muy probable que pequeños descuidos en estas dos secciones afecten la funcionalidad del sistema. De hecho, el primer paso para solucionar este método será verificar que el circuito se construyó correctamente y que todas las conexiones están en su lugar. En segundo lugar, es de particular importancia verificar la calidad de la soldadura para conexiones sueltas y los cables para quemar los cables que pueden estar cortocircuitando el circuito. Un tercer paso sería asegurarse de que los LED funcionan correctamente, lo que se puede hacer utilizando una fuente de alimentación o una batería de 1,5 V recortando los dos terminales del LED con pinzas de cocodrilo. Otra consideración potencialmente crítica es evitar el calentamiento (cuando se usan los LED a alta potencia) o difundir la luz para una iluminación más amplia. Para abordar estas consideraciones, los LED se pueden montar fuera de una caja negra con "película de privacidad" en el interior, como se describe en la Figura complementaria 23 y Allen et al.5. Debido a la simplicidad de este sistema, desmontarlo para verificar, modificar, actualizar o reparar componentes modulares no es difícil.
Otro factor crítico para los sistemas de genes inducibles es considerar cuánta activación se requiere o cuánta fuga es aceptable para el sistema biológico que se está controlando. Como se muestra en la Figura 6, estos pueden variar con la cantidad de ADN del reportero. Además, la eficiencia de transfección y, por lo tanto, el número de copias de las construcciones del reportero en cada celda variarán. Puede ser ventajoso para algunos experimentos hacer una línea celular con una cantidad fija de componentes de interruptor de gen reportero o PhyB y detectar clones con el rango deseado de expresión inducida, como se hace comúnmente con los sistemas inducibles por fármacos. Debido al tamaño y la inestabilidad del plásmido lentiviral pPK-2304, también hicimos versiones plásmidas no lentivirales del interruptor PhyB en la columna vertebral pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) y pPK-352 (Addgene #157922).
Al construir este sistema de iluminación LED siguiendo este protocolo, los usuarios tienen todos los componentes necesarios para realizar una amplia gama de experimentos optogenéticos in vitro e in vivo. Combinado con las instrucciones para usar PhyB-PIF3 en células de mamíferos, este protocolo permitirá a los no ingenieros y biólogos, de manera flexible y efectiva, utilizar la optogenética basada en PhyB en una variedad de contextos.

Las herramientas optogenéticas se están volviendo omnipresentes y constantemente se desarrollan nuevas tecnologías para controlar ópticamente los procesos biológicos, como la expresión génica, la señalización celular y muchos más 1,2,3. La capacidad de controlar los procesos celulares con luz permite una cinética rápida, un control espacial estricto y una regulación dependiente de la dosis que puede controlarse mediante la intensidad de la luz y el tiempo de exposición. Para utilizar estas herramientas, es necesario un dispositivo para controlar estos parámetros. Recientemente hemos desarrollado un interruptor genético de mamíferos PhyB-PIF3 codificado genéticamente que activa y desactiva genes de forma reversible utilizando luz roja / roja lejana, respectivamente4. Este sistema se probó en varias líneas celulares de mamíferos y permitió la inducción sin precedentes de la expresión génica incluso con cantidades muy pequeñas de luz, incluidos pulsos de luz. Los investigadores que desean utilizar el interruptor PhyB y herramientas similares 5,6 solicitan con frecuencia información sobre métodos para controlar la intensidad y la duración de la iluminación. Por lo tanto, desarrollamos este protocolo con instrucciones paso a paso para permitir una adopción más amplia de estas herramientas para la optogenética.
Antes del uso generalizado de LED, se utilizaban fuentes de luz de banda ancha con filtros para estudiar proteínas sensibles a la luz como los fitocromos7. Recientemente, se han publicado algunos sistemas de iluminación LED junto con herramientas optogenéticas 8,9,10,11,12, pero esos protocolos pueden requerir una experiencia significativa en electrónica / software, requieren equipos especializados (por ejemplo, impresoras 3D, máquinas de corte por láser o fotomáscaras) o no proporcionan las instrucciones paso a paso que algunos investigadores necesitarían implementar para sus necesidades de investigación. Si bien el control independiente de pozos individuales en una placa de pocillos múltiples puede ser útil, a menudo es innecesario cuando los investigadores solo necesitan comparar varias muestras diferentes en luz clara y oscura o roja versus luz roja lejana. Además, muchos sistemas comerciales existentes son caros, con una capacidad de personalización limitada. Sin embargo, los LED descritos en este protocolo son rentables, brillantes y se pueden montar de muchas maneras; Por lo tanto, se pueden utilizar para iluminar varios tipos diferentes de muestras. Con el protocolo y el software proporcionado, los LED que van desde ultravioleta (UV) hasta NIR se pueden usar y controlar con software para realizar experimentos optogenéticos utilizando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, dominios LOV 17,18, Opsinas de función escalonada 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, fitocromos bacterianos26,27,28,29 y otros sistemas sensibles a la luz 30,31,32.
Este protocolo constituye un tutorial para el montaje de los circuitos y otros equipos necesarios para controlar diferentes parámetros para la estimulación de la luz, así como las herramientas moleculares / celulares para ejecutar un experimento optogenético. Además, reportamos plásmidos optimizados de Kyriakakis et al.4 que son más pequeños y más estables para la clonación. A través de este protocolo, los biólogos sin experiencia en electrónica y óptica pueden construir sistemas de iluminación que sean flexibles y robustos. De manera paso a paso, mostramos cómo construir sistemas LED, eliminando el cuello de botella técnico para la adopción más amplia de herramientas optogenéticas. Este sistema se puede utilizar fácilmente en la mayoría de las incubadoras de cultivo celular, incluso si no contienen puertos de cable. Por ejemplo, hemos mantenido el sistema LED en una incubadora humidificada deCO2 continuamente durante más de 6 meses sin disminución en el rendimiento. También explicamos cómo conectar el sistema LED a una computadora e interconectarlo con el software de código abierto que proporcionamos en GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). La construcción de un sistema utilizando este protocolo proporciona a los investigadores el conocimiento básico para depurar posibles problemas, reemplazar piezas y mejorar / ampliar las funcionalidades.
Descripción general del sistema
La construcción del sistema de iluminación implica (1) construir el circuito electrónico, (2) construir los periféricos (cable de alimentación, interruptor de alimentación, etc.), (3) construir los LED, (4) ensamblar todos estos componentes y (5) instalar el software para controlar los LED con una interfaz de usuario (Figura 1A). Una vez completado, el sistema de iluminación puede controlar hasta cuatro LED de forma independiente con una interfaz de usuario (Figura 1B). La interfaz de usuario permite que cada LED pulse a intervalos de tiempo especificados y se apague después de un tiempo especificado. También hay un retardo de inicio para comenzar los programas de iluminación a una hora específica. Los potenciómetros (POT) regulan la intensidad de cada LED de forma independiente o se pueden usar para el control manual de LED sin una computadora. Los cables a los LED pueden tener cualquier longitud personalizada, lo que les permite colocarse fácilmente en una incubadora o espacio de laboratorio. Debido a la alta potencia de estos LED, se pueden usar para iluminar un área grande con un solo LED a distancia.
Descripción del controlador LED
Para alimentar y controlar la intensidad de los LED, este protocolo seguirá los pasos para construir un "controlador LED". Cada LED tiene un rango de voltajes en los que opera (Figura 1C). Durante el funcionamiento, el voltaje de salida del regulador, que controla la intensidad de la luz, puede ser sintonizado por un potenciómetro. El POT varía la resistencia, ajustando el voltaje / brillo de salida. La sintonización con un POT de 1kΩ (1 kilo-ohmio) da lo que llamamos el "circuito de alto voltaje" y tiene un rango de 1.35 V a 2.9 V. Dado que 2.9 V es demasiado alto para operar los LED de menor voltaje (Figura 1C), mostramos una sola modificación (Resistencia 3 o "R3" Figura suplementaria 1A) que limita el rango para que coincida con los LED de bajo voltaje. R3 sirve para disminuir el voltaje máximo aplicado a los LEDs a 1.85 V (ensamblaje detallado en la Figura Suplementaria 8) cuando está en paralelo con el potenciómetro. Al usar voltaje para controlar el brillo en lugar de la corriente, el sistema es más flexible para LED con diferentes voltajes de funcionamiento. La Figura 1C contiene una lista de los LED de alto y bajo voltaje para guiar la selección óptima del circuito. Este diseño mantiene el voltaje mínimo lo suficientemente bajo como para que el LED esté completamente apagado cuando el potenciómetro está apagado y no permite que el voltaje supere el voltaje de funcionamiento típico del LED. Para la optogenética PhyB, utilizamos LED de color rojo intenso y rojo lejano, que utilizan el circuito de bajo voltaje.
Descripción del sistema de control informático LED
El sistema de iluminación LED se puede utilizar para una iluminación constante sin una computadora o microcontrolador. Sin embargo, para los programas pulsantes y para controlar la sincronización individual del LED, se debe instalar un microcontrolador. Para usar un microcontrolador para controlar los LED, se requiere un transistor para conectar el microcontrolador al circuito. Este transistor detecta el voltaje del microcontrolador y cambia de ser conductor o aislante. Para controlar el "encendido" y el "apagado", utilizamos lo que se denomina un "transistor de tipo de conmutación NPN" (2N2222) como una derivación controlable a través de R2 (Figura suplementaria 1A). Cuando el voltaje del microcontrolador se aplica a la base del transistor, el transistor se vuelve conductor y hace que el voltaje del LED sea bajo, apagando el LED. Por lo tanto, los estados de encendido y apagado del LED y el transistor son controlados directamente por el microcontrolador, que es controlado por el software instalado en la PC.
Para hacer el sistema de iluminación, se requieren los siguientes pasos: Construir el circuito eléctrico; construir la fuente de alimentación, el interruptor de alimentación manual, los POT y la conexión del microcontrolador; construir los LEDs; acomodar una caja negra para adaptarse al sistema de iluminación; conectar todo el cableado y los dispositivos; instalar el software de control LED, estimular las células con luz; Medir la expresión génica mediante un ensayo de luciferasa dual.

<table><tbody><tr><td>18AWG 2pin ROJO Cable negro</td><td>Amazon</td><td>15M-28AWG-2468</td><td>Cable económico para conectar LEDs al circuito de alimentación. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Potenciómetro de 1K Ohm</td><td>Amazon</td><td></td><td>52161500 2 x 1K Ohm potenciómetro de potencial + 2 x perilla de control negra. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Conector JST de silicona de calibre 20</td><td>Amazon</td><td>SIM& NAT 5.9 pulgadas 2 pines macho hembra JST RCY Conectores de enchufe Estos</td><td>son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>22 AWG cables de puente sólidos</td><td></td> Amazon <td>WJW-60B-R</td><td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Kit de puente de cable 350 cada uno 22 AWG, 14 longitudes 10 colores 25 de cada longitud. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>560 ohmios 1/2 vatio 1% tolerancia</td><td>Amazon</td><td>a14051600ux0301</td><td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piezas Cable Axial 1% Tolerancia Anillo Color Resistencia de Película Metálica, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td></tr><tr><td>820 ohm 1/2watt 1% tolerancia</td><td>Amazon</td><td>TTL-A-8035-50Ea</td><td>Juego de resistencia de película metálica 50Ea 820 ohmios 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td></tr><tr><td>Cable macho a B macho (10 pies)</td><td>Amazon</td><td>Part# 30-001-10B</td><td>El cable que viene con el Arduino no encaja bien en la caja. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Ardiuino UNO equivilent</td><td>Amazon</td><td>Elegoo EL-CB-001</td><td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 con cable USB para soporte Arduino Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td></td><td>Digikey</td><td>X000018</td><td>Se adapta muy bien. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td></tr><tr><td>Cajas negras para circuitos y cámaras de luz</td><td>Amazon</td><td>1591ESBK</td><td>Hammond 1591ESBK Caja de proyecto ABS Negro. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>LED azul</td><td>Digikey</td><td>LXML-PB01-0040</td><td>LED LUXEON REBEL AZUL SMD. Usos "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td></tr><tr><td>Bridas</td><td>Amazon</td><td>sd027</td><td>Tarvol Nylon Bridas (Paquete de 100) 8 pulgadas con bridas autoblocantes (blanco). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Clips de nevera Command</td><td>Amazon</td><td>17210CLR</td><td>Clips para sujetar la placa de circuito dentro de la caja negra. También se pueden usar tiras de comando. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>LED cian</td><td>Digikey</td><td>LXML-PE01-0070</td><td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Utiliza "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td></tr><tr><td>Cinta aislante - 3M Scotch #35 Cinta Aislante Value Pack</td><td>Amazon</td><td>03429NA</td><td>Cinta Aislante Scotch 700, 03429NA, 3/4 pulgadas x 66 pies https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td></tr><tr><td>Farred LED 720nm</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>LXML-PF01</td><td>Rojo lejano (720nm) LUXEON Rebel LED. Utiliza "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td></tr><tr><td>Farred LED 740nm</td><td>Ushio</td><td>EDC740D-1100-S5</td><td>Utiliza "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 780nm</td><td>Ushio</td><td>EDC780D-1100</td><td>Utiliza "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 810nm</td><td>Ushio</td><td>EDC810D-1100</td><td>Utiliza "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 850nm</td><td>Ushio</td><td>EDC850D-1100</td><td>Utiliza "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Ojales</td><td>Amazon</td><td>Pico 6120D</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td></tr><tr><td>Pinzas para el cabello/cocodrilo</td><td>Amazon</td><td></td><td>1-3/4 pulgadas (45 mm)- Pinzas para el cabello Pinzas de cocodrilo de metal de una sola punta Accesorio de lazo para el cabello - Plata, 50 piezas. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Base LED</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>LXB-RS20A</td><td>Saber 20 mm Star Blank Base MCPCB de aluminio para Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td></tr><tr><td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td><td>Soluciones LED Adura</td><td>Paquete STAR XP 3535 LED</td><td>Se adapta a muchos otros LED de Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td></tr><tr><td>Jeringa Loctite Epoxi Transparente Multipropósito, 0.85 onzas líquidas</td><td>Amazon</td><td>1943587</td><td>Loctite Epoxi Transparente Multipropósito, Jeringa de 0.85 onzas líquidas. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td></tr><tr><td>NTE Termorretráctil 2:1 Surtido de Colores y Tamaños 160 PCS</td><td>Amazon</td><td>B000FIDTYG</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Tiras de Velcro para colgar cuadros</td><td>Amazon</td><td>PH204-16NA</td><td>Con estos puedes colgar los LEDs en muchos lugares. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Amazon</td><td>tb013</td><td>Cualquier otro convertidor CA/CC de 9V 1.5Z servirá porque cortamos el extremo de todos modos. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Interruptor de alimentación Interruptor basculante</td><td>Amazon</td><td>SIXQJZML</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011</td></tr><tr><td>Conectores rectangulares - para cables engarzados</td><td>Digikey</td><td>2183-1905-ND</td><td>6 conectores rectangulares - carcasas negras de 0,100" (2,54 mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td></tr><tr><td>LED rojo</td><td>Digikey</td><td>LXM3-PD01</td><td>LED LUXEON REBEL ROJO INTENSO SMD. Utiliza "Papel de lija "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B002NEV6GS</td><td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, grano 800, 3 2/3 pulgadas x 9 pulgadas. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1</td></tr><tr><td>Soldadura para soldar cables y componentes de circuitos</td><td></td><td>Amazon Mudder Cable de soldadura sin plomo Sn99 Ag0.3 Cu0.7 con núcleo de colofonia para soldadura eléctrica 0.22lbs (0.6 mm)</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td></tr><tr><td>Placa de pruebas soldable para construir el circuito</td><td>Amazon</td><td>GK1007</td><td>Gikfun Solder-able Breadboard Acabado chapado en oro Proto Board PCB Kit de bricolaje para Arduino (paquete de 5 piezas) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Broca de pala</td><td>Amazon</td><td>Irwin 88811</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes.<br/</td></tr><tr><td>> https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit Transistor</td><td>Newark</td><td>2N2222A</td><td>Se puede comprar en muchos lugares. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td></tr><tr><td>Regulador de voltaje</td><td>Newark</td><td>LM317T</td><td>Equivalente a NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|partido|p|deslizado||producto||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|& s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!! g!! LM317T& CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td></tr><tr><td>Tableta con Windows 10</td><td>Amazon</td><td></td><td>B08BYTT79Y Cualquier PC con Windows 10 servirá. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Reactivos de cultivo celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Riñón embrionario humano 293 células HEK293</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1573</td><td>Línea celular común. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td>Son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada Glucosa Media Alta ThermoFisher</td><td></td><td>11965&menos; 092</td><td>Son muy comunes y hay muchos equivalentes.<br/</td></tr><tr><td>> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 10.000 unidades/mL de penicilina y 10.000 &micro; g/mL de estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td></tr><tr><td>Microplacas de poliestireno blanco o negro sólido de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>07-200-589</td><td>Se prefieren los platos blancos. No utilice placas transparentes. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td></tr><tr><td>PEI MAX - Clorhidrato de polietilenimina lineal de grado de transfección (MW 40,000)</td><td>PolySciences</td><td>24765-1</td><td>Se puede reemplazar con otro reactivo de transfección. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre del equipo</alicate de corte diagonal fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(110 mm)</td><td>Amazon</td><td>Proskit 1PK-037S</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11</td></tr><tr><td>Dremil 3000 con herramienta de corte y amoladora</td><td>Amazon</td><td>Dremel 3000</td><td>Dremel 3000-2/28 Kit de herramientas rotativas de velocidad variable- 1 Accesorios & 28 Accesorios: amoladora, lijadora, pulidora, enrutadora y grabadora. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3</td></tr><tr><td>Herramienta de corte y esmerilado Dremil</td><td>Amazon</td><td>Dremel 200-1/15</td><td>Cualquier Dremil similar funcionará. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Punta de molienda Dremil</td><td>Amazon</td><td>Dremel 84922</td><td>Piedra de molienda de carburo de silicio. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922</td></tr><tr><td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td><td>Amazon</td><td>DS017</td><td>Para eliminar soldaduras/errores. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td></tr><tr><td>Mano amiga con lupa</td><td>Amazon</td><td>SE MZ101B</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Micro alicates de punta</td><td>Amazon</td><td>Hakko CHP PN-20-M</td><td>Micro alicates de punta puntiaguda súper especiales de acero con mandíbulas lisas, punta de 1,0 mm. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Tornillo pequeño controladores</td><td>Amazon</td><td>Wiha 26197</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set</td></tr><tr><td>Soldador</td><td>Amazon</td><td>Yihua 939D+ Estación</td> <td>de soldadura digitalEstos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td></tr><tr><td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td><td>Amazon</td><td>2507-N</td><td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Pensador Dispensador, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1</td></tr><tr><td>Weller WSA350 120v Absorbedor de humo de sobremesa</td><td>Amazon</td><td>WSA350</td><td>Para la seguridad de la soldadura. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td></tr><tr><td>Pelacables</td><td>Amazon</td><td>CSP-30-7</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td></tr><tr><td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&sup2; 32-20AWG</td><td>Amazon</td><td>IWS-3220M</td><td>Estos son muy comunes y hay muchos equivalentes. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1</td></tr></tbody></table>

construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

El control de los procesos biológicos utilizando la luz ha aumentado la precisión y la velocidad con la que los investigadores pueden manipular muchos procesos biológicos. El control óptico permite una capacidad sin precedentes para diseccionar la función y tiene el potencial de permitir nuevas terapias genéticas. Sin embargo, los experimentos optogenéticos requieren fuentes de luz adecuadas con control espacial, temporal o de intensidad, a menudo un cuello de botella para los investigadores. Aquí detallamos cómo construir un sistema de iluminación LED versátil y de bajo costo que sea fácilmente personalizable para diferentes herramientas optogenéticas disponibles. Este sistema es configurable para control manual o por ordenador con intensidad LED ajustable. Proporcionamos una guía ilustrada paso a paso para construir el circuito, hacerlo controlado por computadora y construir los LED. Para facilitar el montaje de este dispositivo, también discutimos algunas técnicas básicas de soldadura y explicamos los circuitos utilizados para controlar los LED. Usando nuestra interfaz de usuario de código abierto, los usuarios pueden automatizar la sincronización precisa y el pulso de luz en una computadora personal (PC) o una tableta económica. Esta automatización hace que el sistema sea útil para experimentos que utilizan LED para controlar genes, vías de señalización y otras actividades celulares que abarcan grandes escalas de tiempo. Para este protocolo, no se requiere experiencia previa en electrónica para construir todas las piezas necesarias o para usar el sistema de iluminación para realizar experimentos optogenéticos.

Este protocolo describe cómo realizar experimentos optogenéticos para controlar la expresión génica con luz roja y roja lejana utilizando PhyB y PIF3. Se incluyen instrucciones paso a paso para construir un sistema de iluminación simple y flexible, que permite el control de la expresión génica u otra optogenética con una computadora.

Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

El sistema permite a los investigadores construir fácilmente un sistema de iluminación económico y versátil para experimentos optogenéticos. Las ventajas de esta técnica incluyen la capacidad de programar el tiempo de iluminación LED con longitudes de onda disponibles que abarcan el espectro visible cercano al IR, y que los LED se pueden usar en una variedad de contextos. Para construir un circuito eléctrico, sujete la placa de circuito impreso en las manos de ayuda e inserte los cables de puente, conectándolos para formar los agujeros A1 y A3 al suelo, el cable de puente D2 en el agujero de alfiler D6, y la fuente de alimentación más los cables de puente número siete en el agujero de alfiler A7. Dobla los terminales 45 grados y añade flujo.Después de soldar, recorte la parte posterior de los cables. Inserte un extremo del conector hembra de cable a cable soldado en el orificio A5. Luego conecte un extremo de la resistencia al orificio A5.Conecte el otro extremo del conector a tierra. Luego conecte el otro extremo de la resistencia a tierra y suelde la conexión. Para el conector Arduino, engarce los extremos de los conectores de cable a cable y empuje los extremos engarzados a través del conector rectangular.Para configurar los LED, coloque un cable calentando desde abajo mientras agrega soldadura desde la parte superior. Coloque una cantidad generosa de soldadura sobre la punta de soldadura grande y use la punta para calentar la base del LED en el flujo que contiene el contacto. Después de unos segundos, arrastre individualmente la soldadura a través de cada contacto y fije el cable negro en el cátodo con una pinza para el cabello.Coloque una cantidad generosa de soldadura en la punta de soldadura grande y presione la punta sobre el cable hasta que la soldadura en la base del LED se derrita. Mantenga presionado el cable y retire el soldador mientras mantiene el cable en su lugar. Coloque una pequeña cantidad de pasta de soldadura en las almohadillas para las conexiones LED y use pinzas para colocar el LED sobre las almohadillas.Sostenga el cable rojo preestañado en el ánodo y use una pinza para el cabello para sujetar el cable. Agregue la soldadura a la punta grande como se demostró y presione la punta sobre la conexión hasta que la soldadura en la base del LED se derrita y la pasta de soldadura se derrita y se convierta en plata. Para hacer los cables LED, coloque un tubo retráctil de 4,76 milímetros sobre el cable cortado a la longitud y un tubo retráctil de 3,18 milímetros sobre el conector de cable a cable.Pelar y añadir fundente a los extremos del cable. Use las manos amigas para sujetar el conector de cable a cable y gire el extremo del conector con un extremo de cable. Suelde los materiales juntos y conecta el otro cable a la configuración de la misma manera y suelda.Luego sujete los cables LED a las manos amigas con cinta adhesiva debajo de la base del LED. A continuación, mezcle epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante y extienda el epoxi sobre la parte superior del LED soldado. Usando la broca de pala, perfore un orificio de 1,5 centímetros a través de la parte superior de la caja en la que se colocará el LED y use una herramienta giratoria de alta velocidad para hacer una muesca en un lado del orificio para hacer espacio para el cable LED.Pegue una pieza de 25 a 30 milímetros de película de privacidad en la caja negra que cubre el orificio por el que se iluminará el LED y pegue el LED fuera de la caja negra en la parte superior del agujero. Para un sistema de control de cuatro LED, perfore cuatro agujeros de 0,83 centímetros separados por 3,81 centímetros en la tapa de la caja y utilice una herramienta giratoria de alta velocidad para cortar un orificio rectangular de 1,19 por 1,90 centímetros en la esquina superior izquierda. Usando una broca de pala, perfore un agujero de 1,5 centímetros en la parte posterior de la caja e inserte una arandela en el agujero.Para los LED controlados por computadora, lije el área donde se pegará el microcontrolador en la caja, así como la parte inferior del soporte del microcontrolador. Encaje el microcontrolador en el soporte y luego coloque epoxi el soporte y la caja juntos antes de asegurar el soporte en la caja negra. Luego coloque cinta de doble cara en el clip y asegure el clip dentro de la caja.En muestras transfectadas para expresar fitocromo B pero no ficocianina bilina, la permeabilidad aumenta a medida que aumenta la cantidad de ADN reportero. Además, cuando todo el interruptor del gen del fitocromo B, incluido el plásmido productor de ficocianina bilina del cromo de nuestro orcio, se ilumina con luz roja lejana, la expresión de luciferasa también aumenta con las cantidades crecientes de construcción del reportero dentro de la mezcla de transfección. Del mismo modo, cuando las células sensibles a la luz se iluminan con luz roja, la expresión de luciferasa también aumenta con el aumento de la cantidad de reporteros.Al comparar los niveles de inducción de las células tratadas con luz roja con las células tratadas con luz roja lejana, se encuentra una pequeña disminución en la activación del pliegue con cantidades crecientes de reportero. Es esencial seguir cuidadosamente cada paso al construir el circuito eléctrico y verificar los números de estenopeicos línea por línea antes de soldar cada componente. Este protocolo se puede utilizar para la estimulación óptica de muchos tipos de muestras o herramientas optogenéticas utilizando una variedad de longitudes de onda y permite la programación de horarios de iluminación.

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