Diferenciación celular precursora neuronal inducida por campo eléctrico en dispositivos microfluídicos
14 de abril de 2021
En este estudio, presentamos un protocolo para la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas únicamente por estimulación del pulso de corriente directa (DC) en un sistema microfluídico.
Este estudio presenta un protocolo para la diferenciación de las células precursoras neuronales inducidas únicamente por la estimulación directa del pulso de corriente en un sistema microfluídico. Esta técnica proporciona un enfoque beneficioso para reducir el tiempo de configuración experimental, el volumen de la muestra y el volumen de reactivos. Además, el chip MOE es adecuado para observaciones de microscopía confocal.
El tratamiento simple del pulso de corriente directa puede controlar el destino de las células precursoras neuronales del ratón y podría utilizarse para desarrollar estrategias terapéuticas para trastornos del sistema nervioso. Para empezar, dibuje patrones para capas PMMA individuales y la cinta de doble cara utilizando el software adecuado. Encienda el escribar láser de dióxido de carbono y conéctelo a un ordenador personal.
Abra el archivo de patrón diseñado utilizando el software. Coloque las hojas pmma o cinta de doble cara en la plataforma del escribar láser y, a continuación, centre el láser en la superficie de las hojas de PMMA o en la cinta de doble cara mediante la herramienta de enfoque automático. Seleccione el escribar láser como impresora y, a continuación, utilice el escribar láser para iniciar la ablación directa en la hoja PMMA o cinta a doble cara.
Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno. Para unir múltiples capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de un milímetro y acompájelas bajo una presión de cinco kilogramos por centímetro cuadrado en una unión térmica durante 30 minutos a 110 grados Celsius para formar el flujo o el conjunto del canal de estimulación eléctrica. Adherir 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa uno del conjunto de chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.
Desinfectar los sustratos pmma de un milímetro, la cinta de doble cara y el PMMA de grado óptico de tres milímetros usando irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de montar el chip. Adhera los sustratos PMMA de un milímetro en el PMMA de grado óptico de tres milímetros con la cinta de doble cara para completar el ensamblaje de PMMA. Adhiera el vidrio de cubierta limpiado al conjunto PMMA con la cinta de doble cara.
Selle las aberturas de los adaptadores del puente del agar con tapones blancos ajustados a los dedos. Conecte el conector inferior plano al conjunto de chips MOE a través de los adaptadores de entrada y salida medianas y, a continuación, conecte el adaptador Cono Luer a los stopcocks de tres vías. Añadir dos mililitros de solución 0.01% PLL utilizando una jeringa de tres mililitros que se conecta al stopcock de tres vías de la entrada mediana, y conectar una jeringa vacía de tres mililitros al tapón de tres vías de la toma de corriente media.
Llene las regiones de cultivo celular con la solución PLL y bombee lentamente la solución de recubrimiento de un lado a otro. Cierre los dos stopcocks de tres vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo. Incubar el chip MOE a 37 grados Celsius durante la noche en una incubadora llena de 5% de la atmósfera de dióxido de carbono.
Abra los dos stopcocks de tres vías y tire las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento de ida y vuelta en el canal utilizando las dos jeringas. Dibuje tres mililitros de medio completo en una jeringa de tres mililitros que se conecte al stopcock de tres vías de la entrada mediana y agréguelo para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Reemplace el tapón blanco ajustado con el adaptador Luer e inyecte 3% de agarose caliente para llenar el adaptador.
Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer e inyecte 3% de agarose caliente a través del bong de goma negro para llenar la jeringa de bloqueo Luer. Espere de 10 a 20 minutos para que la agarose se enfríe y se solidifique. Instale el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO transparente que se fija en una etapa motorizada XYZ programable mantenida a 37 grados Celsius.
Infunda los mNPC bombeando manualmente al chip MOE a través de la toma de corriente media, luego incuba el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO durante cuatro horas. Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexador EF al chip MOE a través de los electrodos del chip. Conecte un multiplexador EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada.
Retire todo el conector y adaptadores de fondo plano del chip MOE y llene los adaptadores con PBS y, a continuación, selle las aberturas del adaptador con parafilm. Después de la inmunodetención, observe las células utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. La estimulación del pulso de CC dio lugar a mNC simultáneos que se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en el medio de mantenimiento de células madre.
Los porcentajes de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en el grupo de control y en el grupo de estimulación se muestran aquí. Después del tratamiento del pulso de CC, los MNC expresaron un número significativamente alto de neuronas en DIV siete, astrocitos en DIV tres y oligodendrocitos en DIV siete y DIV 14 estaban presentes en niveles relativamente más altos en los grupos de estimulación que en el grupo de control. Neuroesferas formadas por 30 a 40 células son preferidas para iniciar la diferenciación mNPC.
El crecimiento excesivo de mNPC afectará la supervivencia celular durante el proceso de diferenciación.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para la diferenciación de células precursoras neurales inducida por estimulación con pulsos de corriente continua en un sistema microfluídico. Esta técnica reduce el tiempo de preparación del experimento, el volumen de muestra y el volumen de reactivos, lo que la hace eficiente para aplicaciones de investigación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Microfluídica
Antecedentes
- Las células precursoras neurales (NPCs) son fundamentales para comprender el desarrollo neural.
- La estimulación con pulsos de corriente continua puede influir en el destino celular.
- Los sistemas microfluídicos permiten un control preciso de las condiciones experimentales.
- Este enfoque puede contribuir al desarrollo de terapias para trastornos del sistema nervioso.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo confiable para la diferenciación de células progenitoras neurales.
- Utilizar la estimulación con corriente continua como un método para controlar el destino celular.
- Mostrar la eficacia de un sistema microfluídico en la investigación en neurociencia.
Métodos Utilizados
- Diseñar patrones para capas de PMMA y cinta de doble cara.
- Utilizar un grabador láser de dióxido de carbono para la fabricación.
- Aplicar estimulación con pulsos de corriente continua a las NPCs.
- Realizar observaciones mediante microscopía confocal para el análisis.
Resultados Principales
- Diferenciación exitosa de las NPCs utilizando el protocolo propuesto.
- Reducción del tiempo de configuración experimental y del uso de recursos.
- Factibilidad de utilizar el chip MOE para microscopía.
- Aplicaciones potenciales en estrategias terapéuticas para trastornos del sistema nervioso.
Conclusiones
- El protocolo ofrece un enfoque simplificado para la diferenciación de NPC.
- La estimulación con corriente continua es efectiva para controlar el destino celular.
- Los sistemas microfluídicos mejoran la eficiencia experimental en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma microfluídica permite un control preciso de la diferenciación de células precursoras neuronales mediante la estimulación con pulsos de corriente continua, ofreciendo un modelo escalable y eficiente en recursos para la validación de dianas en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Al reducir la complejidad experimental y el consumo de reactivos, apoya la eliminación temprana de riesgos mecanicistas y aumenta la confianza predictiva en las estrategias de modulación del destino celular. La compatibilidad del sistema con la estimulación a largo plazo y el análisis automatizado de imágenes lo posiciona para su integración en flujos de trabajo de descubrimiento centrados en terapias para el sistema nervioso.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las señales eléctricas como reguladoras del destino de las células precursoras neuronales, apoyando la verificación de hipótesis específicas en las vías del desarrollo neurológico.
- Valor operativo: Reduce los volúmenes de muestra y reactivo mediante confinamiento microfluídico, disminuyendo los costos en campañas iniciales de cribado de objetivos.
- Valor predictivo: Proporciona lecturas cuantitativas de la diferenciación neuronal, astrocítica y oligodendrocítica, permitiendo decisiones basadas en datos sobre objetivos moduladores (continuar o descartar).
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera resultados de diferenciación estandarizados y reproducibles bajo parámetros controlados de campo eléctrico, adecuados para la optimización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita la prueba multiplexada de condiciones mediante diseños basados en canales, aumentando el rendimiento en la evaluación de compuestos o estímulos.
- Preparación para ensayos: Permite cultivos a largo plazo e imágenes de lapso de tiempo, lo que posibilita el perfilado cinético de la dinámica de diferenciación para la validación de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Utiliza células precursoras neurales de ratón en un microentorno definido, lo que aumenta la relevancia respecto a los procesos in vivo de diferenciación neural.
- Modelado Preclínico: Permite la generación de linajes gliales y neuronales a partir de un progenitor común, útil para modelar trastornos del sistema nervioso.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite evaluar el sesgo de diferenciación bajo estimulación, aportando información para el perfilado mecanicista de seguridad y eficacia.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, particularmente en las etapas de validación de dianas e identificación de compuestos activos, donde es fundamental la comprensión mecanicista de los reguladores del destino celular. Apoya las campañas de cribado al proporcionar un sistema controlado y cuantificable para evaluar la actividad biológica de moduladores eléctricos o farmacológicos. La salida de la plataforma—métricas de diferenciación específicas para cada linaje—alimenta las tuberías analíticas utilizadas para priorizar dianas con confianza predictiva en los mecanismos de reparación neural.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías de señalización bioeléctrica en células precursoras neuronales, reduciendo la ambigüedad en el mecanismo diana.
- Selección: Permite ensayos de diferenciación cuantitativos y reproducibles bajo estimulación eléctrica definida, mejorando la fiabilidad del ensayo.
- Análisis: Proporciona puntos finales medibles (por ejemplo, % de neuronas, astrocitos, oligodendrocitos) para análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Translacional: Modela la dinámica de diferenciación relacionada con trastornos del sistema nervioso, favoreciendo la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Diseñado para su uso repetido en múltiples condiciones experimentales, promoviendo la estandarización y la coherencia entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del objetivo al aislar la estimulación eléctrica como una variable definida en la determinación del destino celular.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de diferenciación mediante la precisión microfluídica, mejorando la reproducibilidad entre distintos centros y equipos.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas tempranas y mecanicistas sobre el compromiso de linaje, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos que modulan la diferenciación neural, mejorando la eficiencia del capital en carteras de neurociencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el ensamblaje de dispositivos microfluídicos, electrofisiología y cultivo de células madre neurales.
- Depende del acceso a herramientas de fabricación láser, calentadores de óxido de indio y estaño (ITO), multiplexores de CE y sistemas de microscopía invertida.
- Necesita la estandarización de parámetros eléctricos (ancho de pulso, frecuencia, amplitud) entre experimentos para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a células precursoras neurales derivadas de humanos puede requerir la optimización de los parámetros de estimulación y las condiciones de cultivo.
- La estabilidad a largo plazo de los electrodos y el ensuciamiento biológico en estudios de estimulación crónica representan limitaciones prácticas a considerar.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
