Disección regional cerebelosa para análisis molecular
5 de diciembre de 2020
Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las diferencias en la expresión gén
Los estudios moleculares tradicionales del cerebelo se han realizado en extractos cerebelosos enteros, lo que puede enmascarar cualquier distinción entre regiones cerebelosas específicas. Este protocolo permite evaluar distintas regiones del cerebelo por separado y permite la exploración de los mecanismos moleculares que pueden subyacer a sus contribuciones únicas a una variedad de comportamientos y progresión de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite la disección rápida y reproducible de cuatro regiones cerebelosas, los núcleos cerebelosos profundos, la corteza cerebelosa anterior y posterior del Vermis y la corteza cerebelosa de los hemisferios.
Después de decapitar al ratón sacrificado, haga una incisión con una cuchilla de afeitar a lo largo de la línea sagital medial de la cabeza, comenzando en la nariz y continuando hacia atrás. Separe la piel y use la hoja de afeitar para cortar el músculo de cada lado, cortando más allá de los canales auditivos. Con unas tijeras de disección, recorte muchas regiones de la médula espinal hasta donde el tronco encefálico se une con el cerebelo, teniendo cuidado de no dañar el cerebelo.
Inserte una de las hojas de tijera vascular en el espacio entre el tronco encefálico y la columna vertebral y corte hacia el canal auditivo, levantándolo hacia arriba mientras corta para limitar el daño al tejido. Continúa cortando a lo largo del borde del cráneo hacia los bulbos olfativos. Con las pinzas romas, despegue suavemente la parte posterior de este cráneo para descubrir la región posterior del cerebro y el cerebelo.
Coloque las pinzas romas a lo largo del borde cortado del cráneo y pele el cráneo hacia arriba y sobre el cerebro. Recorta el resto del cráneo con las tijeras vasculares y las pinzas romas, limpiando la mayor parte de la parte superior del cerebro. Levante ligeramente el cerebro con la microespátula para eliminar los bulbos olfativos del cráneo restante y desconectar las fibras del tracto óptico.
El cerebro debería liberarse fácilmente en este punto. Coloque el cerebro en la placa de Petri, colocándolo sobre hielo y retire cualquier cráneo restante u otros desechos. Coloque suavemente el cerebro en la matriz del cerebro con el lado dorsal hacia arriba.
Asegúrese de que esté nivelado en la matriz y que la línea media esté en el centro. Coloque una hoja de afeitar a lo largo de la línea media sagital, asegurándose de que la hoja empuje hasta la parte inferior de la matriz. Coloca otra hoja de afeitar un milímetro al lado de la primera hoja.
Coloque dos cuchillas más, lo que da como resultado tres cuchillas colocadas en un lado del cerebro, todas separadas por un milímetro. Repita esto en el otro lado. Agarra con cuidado el extremo delantero y trasero de las hojas de afeitar y levántalas directamente fuera de la matriz.
Desecha el pañuelo de papel en la parte exterior de las hojas de afeitar. Lentamente, separe una hoja de afeitar a la vez de las demás, teniendo cuidado de no dañar las secciones de tejido. Deslice la sección de tejido fuera de la hoja de afeitar y colóquela en el portaobjetos de vidrio con la microespátula.
Se deben recolectar seis secciones sagitales del cerebro. Las secciones laterales más delanteras tendrán DCN visible. Para aislar el DCN, sostenga una punta de pipeta de 200 microlitros perpendicularmente sobre el DCN y empuje hacia abajo a través del tejido balanceándose firmemente en todas las direcciones.
Levante la pipeta y confirme visualmente la presencia del tejido en la punta. Coloque un dedo en la parte superior de la punta y empuje hacia abajo, haciendo que el tejido sobresalga. Inserte la punta en un tubo de microficha correctamente etiquetado y asegúrese de que el punzón de tejido esté colocado en el fondo del tubo.
Repita esto para las tres secciones restantes, colocando los punzones DCN en el mismo tubo. Congele rápidamente el tubo en nitrógeno líquido. Empuje el resto del tejido cerebral alrededor del cerebelo en las secciones donde se extrajo el DCN.
Use pinzas romas para recoger suavemente estas secciones de la corteza cerebelosa del hemisferio y colóquelas en los tubos de microficha respectivos, luego congélelas rápidamente. Para las dos últimas secciones verféricas, empuje el tejido cerebral circundante para dejar solo el cerebelo. Con una cuchilla de afeitar, haz un corte separando los labios anteriores de los labios posteriores.
Asegúrese de que el corte sea justo después de la formación del labial seis y no incluya el labial 10. Usando pinzas romas, colocó cuidadosamente las secciones de la corteza cerebelosa anterior y las secciones de la corteza cerebelosa posterior en sus respectivos tubos de microficha y congele rápidamente dejando los tubos en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Coloque los tubos de microficha en hielo para evitar que el tejido se descongele demasiado rápido y aplique 150 microlitros de solución de aislamiento de ARN frío en el tubo de microficha, luego homogeneice con un mortero esterilizado.
Una vez que el tejido está homogeneizado, pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo para asegurarte de que no quede tejido intacto. Además, rompa los pequeños pedazos de tejido tirando de ellos hacia arriba en una jeringa de insulina unas cuantas veces. Agregue otros 350 microlitros del reactivo, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien y déjelo reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Agregue 150 microlitros de cloroformo al tubo y agítelo vigorosamente, luego déjelo reposar durante dos o tres minutos. Centrifugar a 12.000 veces G a 15 grados centígrados durante 10 minutos. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga y ajuste la temperatura de la centrífuga a cuatro grados centígrados.
Transfiera solo la fase acuosa clara a un nuevo tubo, teniendo cuidado de no interrumpir la interfase opaca. Guarde o deseche la solución restante en los tubos. Agregue alcohol isopropílico al 100% en una proporción de uno a dos y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Deje reposar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos para precipitar el ARN de la solución. Centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, colocando todos los tubos en la misma orientación para facilitar la visualización del pellet. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos y retire el sobrenadante con la pipeta, asegurándose de no romper el pellet.
El pellet es similar a un gel y es difícil de ver, así que estime dónde está en función de la orientación de los tubos en la centrífuga. Después de eliminar todo el sobrenadante, agregue 500 microlitros de etanol al 75%, vórtice brevemente y centrifugue a 7, 500 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire el sobrenadante con cuidado, sin alterar el pellet.
Deje las tapas abiertas para secar la muestra durante cinco a 10 minutos. Una vez seco, vuelva a suspender el pellet en el agua libre de ADN a 20 microlitros para las muestras para DCN y 30 microlitros para todas las demás. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta su posterior análisis.
Este protocolo se utilizó para diseccionar cuatro regiones distintas del cerebelo del ratón y para explorar las diferencias regionales en la expresión génica. Los niveles de expresión de Aldolasa C, parvalbúmina y KCNG4 se evaluaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La aldolasa C se expresa más en el vermis cerebeloso posterior.
Pero menor en la DCN y en la región anterior del vermis en comparación con la disección cerebelosa masiva. La parvalbúmina está presente de manera similar en el vermis anterior, el vermis posterior y las cortezas cerebelosas del hemisferio DCN, en comparación con los extractos cerebelosos a granel. KCNG4 está significativamente enriquecido en el DCN y en los vermis interiores, pero no en los vermis o hemisferios posteriores en comparación con la extracción a granel.
Para comparar directamente la expresión de la aldolasa C en la corteza cerebelosa, se compararon los niveles de expresión con el vermis anterior. El nivel de expresión de aldolasa C fue significativamente mayor en el Vermis posterior y con tendencia al alza en los hemisferios cerebelosos. El ARN extraído de estas regiones también se puede utilizar en experimentos de secuenciación de ARN.
La comparación de la secuencia de ARN para las regiones cerebelosas proporcionaría información más detallada sobre los mecanismos moleculares y las funciones discretas subyacentes de estas regiones. Así como las posibles diferencias en su vulnerabilidad a la enfermedad.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para la disección reproducible y rápida de regiones cerebelosas distintas, específicamente los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos. El objetivo es esclarecer las diferencias moleculares en la expresión génica que podrían subyacer a salidas conductuales únicas asociadas con regiones cerebelosas específicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Molecular
- Expresión Génica
Antecedentes
- Se sabe que el cerebelo influye en diversas salidas conductuales.
- Los estudios tradicionales suelen analizar extractos enteros del cerebelo, lo que podría ocultar diferencias regionales.
- Un enfoque más específico podría ayudar a descubrir mecanismos moleculares particulares en áreas cerebelosas distintas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para aislar ARN de regiones cerebelosas específicas.
- Comparar la expresión génica entre las regiones cerebelosas.
- Facilitar el estudio de los fundamentos moleculares del comportamiento y las enfermedades.
Métodos Utilizados
- El método implica la disección de regiones cerebelosas de ratones sacrificados.
- El modelo biológico clave incluye tejidos cerebelosos de ratón.
- El ARN aislado se procesa para el análisis de expresión génica.
- Los pasos procedimentales críticos incluyen la disección cuidadosa, la congelación rápida y la homogenización del tejido.
Resultados principales
- El protocolo permite la identificación de diferencias moleculares entre regiones cerebelosas.
- Los hallazgos incluyen información sobre cómo regiones específicas pueden contribuir de manera única al comportamiento.
- El proceso permite examinar los cambios en la expresión génica relevantes para la función cerebelosa.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método novedoso para diseccionar y analizar regiones cerebelosas destinadas a estudios moleculares.
- El enfoque facilita la comprensión de la relación entre mecanismos específicos de regiones cerebelosas y resultados conductuales.
- Los conocimientos obtenidos podrían avanzar en el entendimiento de la base molecular del involucramiento cerebeloso en diversas enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La disección regional del cerebelo permite un análisis molecular preciso de áreas cerebrales distintas, abordando una limitación clave en la investigación en neurociencia donde los extractos de tejido completo ocultan la heterogeneidad funcional. Este enfoque apoya la validación de dianas al vincular los patrones de expresión génica con subregiones cerebelosas específicas implicadas en las vías del movimiento, la cognición, el afecto y la recompensa. Al posibilitar el aislamiento reproducible de tejido a partir de zonas anatómicas definidas, el método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos e informa sobre la reducción de riesgos mecanicistas en programas de descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de firmas moleculares de regiones cerebelosas implicadas en el control motor y funciones neuropsiquiátricas.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado para la disección de los núcleos cerebelosos profundos, la corteza vermal y la corteza hemisférica, reduciendo la variabilidad en los análisis omicos posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera entradas de ARN específicas de región adecuadas para qPCR y secuenciación de ARN, lo que permite la comparación cuantitativa de la expresión génica entre subregiones cerebelosas.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante protocolos de congelación rápida y homogenización consistente, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la exploración de la vulnerabilidad regional en modelos de enfermedad mediante la comparación de perfiles moleculares en zonas cerebelosas definidas anatómicamente.
- Valor operativo: Permite el biobancado de tejidos diseccionados a −80°C, apoyando estudios longitudinales y comparaciones entre experimentos en vías de validación de objetivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la identificación de dianas guiada por hipótesis y la validación preclínica mediante la provisión de datos moleculares con resolución anatómica del cerebelo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante la correlación de la expresión génica (por ejemplo, aldolasa C, parvalbúmina, KCNG4) con la función cerebelosa regional.
- Tamizaje: Produce extractos de ARN estandarizados adecuados para detección de alta sensibilidad, facilitando la comparación confiable de estados moleculares entre diferentes condiciones experimentales.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas a partir de qPCR y ARN-seq que permiten a los equipos evaluar la interacción con el blanco y la modulación de vías con precisión regional.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos moleculares con fenotipos conductuales al permitir el análisis de regiones relacionadas con el afecto, la cognición y la coordinación motora en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco de disección reutilizable aplicable a múltiples cepas de ratones y modelos de enfermedad, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco al revelar mecanismos moleculares específicos de cada región que quedan enmascarados en los análisis del cerebelo completo.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de disección, congelación y aislamiento de ARN, minimizando la varianza técnica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/interrupción al proporcionar claridad mecanicista sobre los blancos cerebelosos, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de los programas del sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en patrones de expresión regional y relevancia para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía y técnicas de disección microquirúrgica para garantizar la separación nítida de las regiones cerebelosas.
- Depende del acceso a equipos criogénicos (nitrógeno líquido, congelador a −80°C) y herramientas de precisión (tijeras vectory, pinzas romas, espátula micro) para el manejo del tejido.
- Necesita una formación estandarizada entre los equipos para mantener la consistencia en la profundidad del punzonado del tejido y en la identificación de las regiones.
- Debe tener en cuenta los riesgos de degradación del ARN mediante la reducción del tiempo de procesamiento y el mantenimiento de la cadena fría desde la disección hasta la resuspensión.
- Está limitado por el rendimiento de tejido obtenido de regiones pequeñas como el DNC, lo que requiere la optimización de las cantidades de entrada para aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN con baja cantidad de entrada.
